CN109679970B - 猫疱疹i型病毒快速检测的制备方法 - Google Patents

猫疱疹i型病毒快速检测的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，通过对猫疱疹I型病毒抗原序列进行分析，选择其中一段优势抗原表位序列，为增加其在原核细胞中的表达效果，将该序列进行重复，并采用大肠杆菌最嗜密码子合成对应的核苷酸序列。采用基因工程方法将上述核苷酸序列插入原核表达载体并构建重组表达菌株，该表达菌株通过IPTG诱导后产生重组蛋白FHV51，最终基于该重组蛋白建立猫疱疹I型病毒胶体金诊断方法。本发明主要涉及猫疱疹I型病毒重组抗原的制备、该重组抗原多抗的制备及基于该重组蛋白建立的一种猫疱疹I型病毒急性感染与潜伏期感染的快速诊断方法。

Description

猫疱疹I型病毒快速检测的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，通过对猫疱疹I型病毒抗原序列进行分析，选择其中一段优势抗原表位序列，为增加其在原核细胞中的表达效果，将该优势抗原表位序列进行重复，并采用大肠杆菌最嗜密码子合成对应的核苷酸序列。采用基因工程方法将上述核苷酸序列插入原核表达载体并构建重组表达菌株，该表达菌株通过IPTG 诱导后产生重组蛋白FHV51，最终基于该重组蛋白建立猫疱疹I型病毒胶体金诊断方法。本发明主要涉及猫疱疹I型病毒重组抗原的制备、该重组抗原多抗的制备及基于该重组蛋白所建立的一种猫疱疹I型病毒急性感染与潜伏期感染的快速诊断方法。
背景技术
猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1，FHV-1)属于疱疹病毒科，α－疱疹病毒亚科成员，主要引起猫科动物的传染性鼻气管炎，是猫的一种急性上部呼吸道感染性非常强的急性传染病。FHV-1主要感染幼猫，感染后在上呼吸道黏膜复制导致猫出现体温升高、精神沉郁、咳嗽、打喷嚏等临床症状与慢性鼻窦炎、角膜结膜炎等并发症，发病率为100％，幼猫病死率可达50％。且感染猫康复后，FHV-1潜伏于三叉神经、视神经、扁桃体、颌下淋巴结、鼻甲骨以及口鼻眼分泌物内，造成持续性感染和潜伏性感染，还可再活化引起感染猫的二次发病，因此对猫疱疹I型病毒的早期诊断以及潜伏性感染的诊断与治疗尤为重要。
目前，常用的FHV-1诊断方法包括病毒的分离鉴定、血清学诊断及分子生物学诊断技术。
1、病毒的分离鉴定
因FHV-1型病毒在细胞内能迅速复制并产生典型的细胞病变，故通过采集眼、咽拭子(急性感染)或结膜、角膜刮取物(慢性感染)，将样本处理后接种猫肾细胞 (FK-81)，接种2d后出现典型的细胞病变，表现为细胞灶状圆缩、形成合胞体、出现多核巨细胞。病毒分离虽能准确诊断出FHV-1感染，但FHV-1对外界环境抵抗力较弱，且只能在FK-81细胞上增殖，运输过程中极易造成病毒的失活，且检测费时，临床上一般不建议使用病毒的分离进行诊断。
2、血清学诊断
主要包括免疫荧光试验(FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验以及血凝-血凝抑制试验(HA-HI)。
免疫荧光试验：取患病猫角膜、结膜刮取物以及活体组织切片处理后，与荧光素标记的抗体相结合，通过荧光显微镜下观察特异性荧光进行诊断。该方法敏感度低，仅能诊断急性感染期的患病猫，对于自发慢性感染的猫群检测成功率较低。
酶联免疫吸附试验(ELISA)：利用可溶性抗原与抗体特异性结合的原理，通过酶标显色进行抗原或抗体的检测。ELISA方法可检测FHV-1血清抗体，但检测耗时，操作繁琐，限制了其大规模生产与投放。
中和试验：由于FHV-1原发感染时机体的抗体滴度较低，复发感染后血清抗体滴度大幅升高，可用于FHV-1抗体效价及区分FHV-1原发与继发感染的检测。但抗体效价的检测与患病猫临床表现无关，一般不采用该法进行诊断。
血凝-血凝抑制试验(HA-HI)：利用FHV-1可以凝集猫红细胞的特点实现FHV-1 感染的检测，但目前对于FHV-1血凝性仍存在争议，未建立系统的HA-HI诊断方法。
3、分子生物学诊断
依据FHV-1的高度保守序列-胸苷激酶(Thymidine kinase，TK)基因，通过普通PCR、巢氏PCR、实时荧光定量PCR等技术可实现对FHV-1感染的检测。分子生物学诊断技术具有灵敏度高、特异性强的特点，但操作复杂且费时。因此，建立一种快速、操作简便的针对FHV-1急性感染及潜伏期感染检测的方法意义重大。
本发明通过对猫疱疹I型病毒抗原优势表位进行分析，兼顾特异性等特点，选择优势抗原表位序列进行重复，并采用大肠杆菌最嗜密码子合成对应的核苷酸序列。采用基因工程方法将上述核苷酸序列插入原核表达载体并构建重组表达菌株，该表达菌株通过IPTG诱导后产生重组蛋白FHV51，最终基于该重组蛋白建立猫疱疹I型病毒急性感染与潜伏期感染的胶体金快速诊断方法。
发明内容
本发明目的之一是提供编码猫疱疹I型病毒重组蛋白FHV51的DNA序列。
本发明目的之二是提供一种可以特异性表达猫疱疹I型病毒重组蛋白FHV51的重组大肠杆菌。该菌株经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后可特异性表达猫疱疹 I型病毒重组蛋白FHV51，为血清学诊断提供特异性抗原。
本发明目的之三是提供一种可以特异性识别该重组蛋白的多抗。
本发明目的之四是提供一种快速，操作简便的猫疱疹I型病毒急性感染与潜伏期感染的诊断方法。
本发明通过以下实验方案实现：
1)通过目前已知的猫疱疹I型病毒基因序列，与其它同源病原微生物的特征表位进行比对，通过计算机模拟猫疱疹I型病毒的优势表位，兼顾特异性与灵敏度及大肠杆菌高效表达效果，最终选择猫疱疹I型病毒一段优势抗原表位序列作为目的序列，并采用大肠杆菌最嗜密码子合成对应的核苷酸序列。
2)在原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点BamHI和EcoRI之间定向插入合成的目的核苷酸序列，构建得到重组原核表达载体pET-28a(+)-FHV-1A。
3)将步骤2)中得到的重组原核表达载体pET-28a(+)-FHV-1A转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，利用该菌株具有卡那青霉素抗性特征筛选出单克隆菌株。
4)选取步骤3)中得到的单克隆菌株分别进行培养，经IPTG诱导后，对菌液进行鉴定，挑选出能特异表达重组蛋白FHV51的菌株。
5)将步骤4)挑选出的特异性菌株进行扩大培养，并将所表达的重组蛋白FHV51 进行纯化。
6)将步骤5)纯化得到的FHV51重组蛋白免疫新西兰白兔，制备多克隆抗体，并且将制备好的多克隆抗体进行纯化。
7)将步骤5)纯化得到的FHV51重组蛋白标记胶体金颗粒。
8)将步骤6)纯化后的多克隆抗体作为C线进行包被(硝酸纤维素膜)。
9)分别将鼠抗猫IgM单克隆抗体(杭州贤至生物科技有限公司)与鼠抗猫IgG 单克隆抗体(杭州贤至生物科技有限公司)作为T1线、T2线进行包被(硝酸纤维素膜)。
10)组装胶体金试纸条，利用胶体金试纸检测待测血清。根据胶体金颜色变化确定其临床使用。
本发明涉及到的质粒载体pET-28a(+)以及大肠杆菌菌株BL21(DE3)为分子生物学领域应用最广泛的载体工具与表达菌株，方便易得，对环境及操作人员无安全隐患，且表达所得的融合抗原，不存在致病性与传染性，因将优势抗原表位进行多次重复，提高了多抗制备过程中的免疫原性。同时，通过对猫IgM与IgG单克隆抗体分别进行包被，可实现猫疱疹I型病毒急性感染与潜伏期感染的双重诊断，大大降低临床漏检率。
附图说明
图1为测试样品在第7天时猫疱疹I型病毒感染状况显示图；
图2为测试样品在第45天时猫疱疹I型病毒感染状况显示图.
具体实施方式
以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
实施例1：猫疱疹I型病毒优势抗原表位序列选择
以猫疱疹I型病毒为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，兼顾其特异性与灵敏度，最终选择一段优势抗原表位序列，该优势抗原表位序列为所有猫疱疹I型病毒蛋白特有序列，且与其他蛋白序列无明显同源性。
实施例2：猫疱疹I型病毒优势抗原表位序列串联与优化
依据该蛋白多抗制备效价的要求，将猫疱疹I型病毒优势抗原表位序列进行3次重复，为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，采用大肠杆菌最嗜密码子合成对应的核苷酸序列，得到重组蛋白氨基酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No:2所示。将连接后的重组蛋白氨基酸序列转化为对应核苷酸序列，具体编码序列如序列表SEQ ID No:1 所示，在该段序列上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
实施例3：构建重组蛋白表达载体
将合成后的目的基因进行PCR扩增，扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带，命名为pET-28a(+)-FHV-1A。
将回收的目的基因与pET-28a(+)载体(德国Novagen公司)通过限制性内切酶BamHI和EcoRI分别于37℃水浴双酶切12小时，酶切产物通过1％琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收(目的基因回收与酶切产物回收均采用宁波中鼎生物技术有限公司胶回收试剂盒)。
使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因片段和pET-28a(+)载体片段按一定比例于4℃连接12小时，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃恒温过夜培养。次日于平板上挑取单克隆菌株接种至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养5小时后，对菌株质粒进行提取(宁波中鼎生物技术有限公司质粒纯化试剂盒)，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体pET-28a(+)-FHV-1A。
DH5α感受态细胞制备：取大肠杆菌DH5α菌液100uL加至2mL LB液体培养基中， 37℃恒温摇床培养3-4小时至OD600＝0.6，取100uL活化后的菌液加至6mL LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养1.5小时至OD600＝0.6，取1mL菌液，低温离心后弃上清，沉淀中加入160uL含CaCl2-甘油溶液，吹匀后5000rpm，4℃离心3min，弃上清，加入160uL 含CaCl2-甘油溶液，吹匀则得到DH5α感受态细胞。其中CaCl2-甘油溶液配方：CaCl2终浓度1mmol/L，甘油终体积10％。
实施例4：构建重组蛋白表达菌株
将构建好的重组表达载体pET-28a(+)-FHV-1A转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。次日挑取平板上单克隆菌株接种至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中(2mL)， 37℃恒温摇床培养4小时后，加终浓度1.0mmol/L的诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)进行诱导，37℃恒温摇床培养1.5小时后，12％聚丙烯酰胺凝胶鉴定电泳结果表明重组蛋白FHV51成功表达，得到重组蛋白表达菌株。
实施例5：重组蛋白FHV51大量表达与纯化
从含卡那青霉素抗性的LB平板上挑取pET-28a(+)-FHV-1A单克隆重组菌株加至含卡那青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中(6mL)，37℃恒温摇床培养1.5小时至OD600＝0.6，用含终浓度为50μg/mL的卡那青霉素LB液体培养基将该菌按1：100 比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃摇床恒温过夜培养至OD600＝0.6，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L，继续诱导培养5小时。低温离心后收集沉淀(菌体)，用细菌裂解液将沉淀重悬，超声破碎3分钟，低温离心后取上清。上清过0.45μm滤膜后，室温过Ni层析柱(常州天地人和生物科技有限公司)，20mM咪唑去除杂蛋白，300mM咪唑洗脱目的蛋白，收液后，4℃静置30分钟，转至截留分子量为10kDa-12kDa的透析袋中，于PBS(10mmol/L，pH7.4)中过夜透析。透析后立即取出并分装，于-20℃保存备用。
细菌裂解液配方：Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0)，EDTA(1mmol/L)，NaCl (100mmol/L)。
20mM咪唑配制：咪唑1.36g，加10mmol/L，pH7.4PBS溶液溶解定容至1000mL。
300mM咪唑配制：咪唑10.2g，加10mmol/L，pH7.4PBS溶液溶解定容至500mL。
实施例6：ELISA检测
取纯化后的FHV51经包被液稀释至终浓度为1μg/mL，以100μL/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)中，4℃过夜包被，通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次，洗板后加入封闭液200μL进行封闭，37℃孵育1小时后用洗涤液洗涤1次。再分别加入临床已确诊的猫疱疹I型病毒阴性血清、 IgM阳性血清及IgG阳性血清(一抗)，37℃孵育35分钟后用洗涤液洗涤3次，分别加入HRP标记的兔抗猫IgM抗体(杭州贤至生物科技有限公司)及HRP标记的兔抗猫IgG抗体(杭州贤至生物科技有限公司)，37℃孵育35分钟后用洗涤液洗涤4次。加入显色液A液与B液后加入终止液，空白对照孔校零后进行OD值测量，结果表明 IgM阳性血清孔OD值为阴性血清孔的2.5倍，IgG阳性血清孔OD值为阴性血清孔的 3.2倍。
包被液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加超纯水定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：伊利脱脂奶粉3g，加10mmol/L，pH7.4PBS溶液溶解定容至100mL。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加超纯水定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加超纯水定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加超纯水定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加超纯水定容至1000mL。
实施案例7：重组蛋白FHV51兔多抗制备
取FHV51重组蛋白300μg，用弗氏完全佐剂进行乳化(共1mL)，皮内多点注射至雄性新西兰白兔，进行第一次基础免疫。20天后进行加强免疫，取FHV51重组蛋白150ug，用弗氏不完全佐剂进行乳化(共1mL)，皮内多点注射。之后每隔15天加强免疫一次，方法与第二次免疫相同，第四次加强免疫后10天，耳动脉采血5mL，纯化得到FHV51多克隆抗体，通过ELISA检测其效价。具体操作与实施例6相同， FHV51多克隆抗体作为一抗添加，类似实施例6中猫疱疹I型病毒IgG阳性血清。第五次加强免疫后10天，颈动脉采血约100mL，处死白兔。
实施案例8：重组蛋白FHV51兔多抗纯化
琼脂糖亲和介质Protein G层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)平衡至室温，电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)预热20分钟，用10mmol/L， pH7.4的PBS溶液过柱洗涤至电脑核酸蛋白检测仪吸光度A显示为0。兔血清 12000rpm离心5分钟后，取上清过0.45μm滤膜后上样，随后加10mmol/L，pH＝7.4的 PBS溶液过柱洗涤至电脑核酸蛋白检测仪吸光度A显示为0。用0.1mol/L，pH＝3.0的甘氨酸溶液洗脱。收集洗脱液后，加入0.5mol/L，pH8.5的Tris-HCl缓冲液中和至pH7.0，即为重组蛋白FHV51兔多克隆抗体。
甘氨酸溶液配制：甘氨酸7.5g，超纯水溶解定容至800mL，加0.5M HCl调至pH3.0。Tris-HCl缓冲液配制：Tris 75.4g，超纯水搅拌溶解定容至1000mL，加0.5M HCl调至pH8.5。
实施例9：重组蛋白FHV51标记胶体金颗粒
取5mL 0.01％胶体金溶液，加入10μL 0.2mol/L碳酸钾溶液，充分混匀后加入50μg猫疱疹I型病毒重组蛋白FHV51，混匀，室温静置2小时后，加入500μL 10％BSA(牛血清白蛋白)溶液进行封闭，室温静置1小时，离心(6500rpm，20min)，弃上清后，沉淀用500μL复溶液充分溶解。溶解后的金溶液采用喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照10μL/cm均匀喷涂于6mm宽的玻纤上，后置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃鼓风干燥1小时。
相关溶液配方如下：
0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1mL，1％柠檬酸溶液1.4mL，超纯水加热溶解反应并定容至100mL。
1％氯金酸溶液：AuCL3.HCl.4H2O粉末1g，超纯水溶解并定容至100mL。
1％柠檬酸溶液：柠檬酸晶体1g，超纯水溶解并定容至100mL。
复溶液：Tris碱6.057g溶解于800mL超纯水中，用适量HCl调节pH至8.0，超纯水定容至1000mL。
实施案例10：猫疱疹I型病毒诊断试纸条制备
将猫疱疹I型病毒重组蛋白FHV51多抗用包被液稀释至终浓度为1mg/mL，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1μL/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius，CN140)上，为C线。将鼠抗猫IgM单抗(杭州贤至生物科技有限公司)用包被液稀释至终浓度为1mg/mL，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1μL/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius，CN140)上，为T1线。将鼠抗猫IgG单抗(杭州贤至生物科技有限公司)用包被液稀释至终浓度为1mg/mL，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1μL/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius，CN140)上，为T2线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃鼓风干燥30分钟。依次将硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫、吸水纸在PVC垫板上组装后切成宽4mm长条，装入卡壳后压紧。
实施例11：猫疱疹I型病毒诊断试纸条操作步骤及标准
用猫疱疹I型病毒标准品免疫正常家猫，第7天后取得血清A，梯度稀释后100μL/孔上样，室温放置15min后，如图1所示，随着测试样品浓度增高，紫红色反应条带 (T1线)颜色逐渐加深。第20天加强免疫正常家猫一次，第35天后再次加强免疫猫，第45天取得血清B，梯度稀释后100μL/孔上样，室温放置15min后，如图2所示，随着测试样品浓度增高，紫红色反应条带(T2线)颜色逐渐加深。基于本发明制备的重组蛋白FHV51所建立的胶体金试纸条可快速有效鉴别诊断猫疱疹I型病毒的急性感染与潜伏期感染。
实施案例12：试纸的灵敏性、特异性实验
灵敏度测定：按照猫疱疹I型病毒试纸条操作方法，将临床已确诊的猫疱疹I型病毒阴性血清、IgM阳性血清、IgG阳性血清、IgM及IgG双阳性血清各1份分别梯度稀释后使用本发明试纸条进行检测。通过胶体金读数仪(杭州唯赞科技有限公司) 分别读值，(T1/C线cut-off值为0.10，T2/C线cut-off值为0.10，T1/C线与T2/C线任意比值大于相应cut-off值为阳性，小于cut-off值则为阴性)，符合率为100％，结果如附表1所示。
附表1
Figure RE-GDA0001961405410000111
*A血清：临床已确定的猫疱疹I型病毒阴性血清
*B血清：临床已确定的猫疱疹I型病毒IgM阳性血清
*C血清：临床已确定的猫疱疹I型病毒IgG阳性血清
*D血清：临床已确定的猫疱疹I型病毒IgM及IgG双阳性血
特异性测定：按照猫疱疹I型病毒试纸条操作方法，使用本发明试纸条检测10份猫阴性血清(临床已确定)，均未出现假阳，符合率为100％。按照猫疱疹I型病毒试纸条操作方法，使用本发明试纸条分别检测10份猫弓形虫阳性血清样本，10份猫艾滋阳性血清样本，10份猫杯状病毒阳性血清等，均无阳性产生。结果表明，利用猫疱疹I型病毒重组蛋白FHV51所制备的胶体金快速检测试纸条与猫基础疾病及其他疾病基本不会造成假阳性，特异性良好。
SEQ ID NO1：编码重组蛋白的核苷酸序列；
SEQ ID NO2：重组蛋白的氨基酸序列。
Figure IDA0001961405440000011
Figure IDA0001961405440000021
Figure IDA0001961405440000031

Claims (3)

1.一种编码重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：l所示。
2.一种重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo: 2所示。
3.一种重组质粒载体，其特征在于该重组质粒载体含有权利要求1所述的基因。
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