RU2754791C1 - Мозаичный рекомбинантный полипептид, содержащий фрагменты белков вируса гепатита Е 1 и 3 генотипов в одной полипептидной цепи, предназначенный для использования в тест-системах, применяемых в серодиагностике гепатита Е - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Описан мозаичный рекомбинантный полипептид, в составе которого находятся фрагменты белков ORF2 и ORF3 вируса гепатита Е 1 и 3 генотипов в одной полипептидной цепи. Продукт разработан для использования в тест-системах, применяемых в серодиагностике гепатита Е. Техническими результатами изобретения являются: генно-инженерная конструкция, содержащая фрагменты генов orf2 и orf3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в одной рамке считывания; штамм-продуцент мозаичного рекомбинантного полипептида с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в составе одной полипептидной цепи; очищенный мозаичный рекомбинантный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в составе одной полипептидной цепи. 30 ил., 9 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и представляет собой генно-инженерную конструкцию белка, кодирующую мозаичный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в одной рамке считывания, который может найти применение в тест-системах для серодиагностики гепатита Е.

Гепатит Е (ГЕ) представляет значимую проблему для здравоохранения, и неоспоримо важным является совершенствование его лабораторной диагностики. Основным лабораторным показателем инфицирования вирусом гепатита Е (ВГЕ) является выявление в сыворотке крови больных специфических антител методом иммуноферментного анализа (ИФА). Из-за трудностей, связанных с культивированием ВГЕ известные к настоящему времени диагностические тест-системы основаны главным образом на использовании рекомбинантных антигенов.

Описано 8 генотипов вируса, из них вирусы 1-4 генотипов вызывают заболевание у людей. На гиперэндемичных территориях циркулируют ВГЕ 1 и 2 генотипов, вызываемая ими инфекция является строгим антропонозом. К таким территориям относятся страны Африки, Америки, Азии. ВГЕ 3 и 4 генотипов, доминирующие на эндемичных и неэндемичных территориях, инфицирующий не только человека, но животных (домашних и диких свиней, диких кабанов, оленей, кроликов). Доказана зоонозная передача ВГЕ 3 и 4 генотипов. ВГЕ 3 генотипа отвечает за спорадические случаи во всем мире, включая Европу и США, ВГЕ 4 генотипа преобладает в Юго-Восточной Азии. Заболевание, вызываемое ВГЕ 1 генотипа, является строгим антропонозом и распространено на территории стран постсоветского пространства Центральной Азии. В данной работе была поставлена задача получения мозаичного рекомбинантного мозаичного рекомбинантного полипептида, содержащего аминокислотные последовательности ВГЕ 1 и 3 генотипов штамма, циркулирующих в странах СНГ и имеющих эпидемиологическую значимость с точки зрения возможного завоза в Россию в связи с усилением международной трудовой миграции.

Первоначально диагностика гепатита E основывалась на серологическом исключении вирусных гепатитов другой этиологии. Большинство разработанных к настоящему времени методов серодиагностики гепатита E основано на определении антител к белкам-продуктам второй и третьей открытых рамок считывания генома вируса гепатита E в сыворотках крови. Для этих целей используются различные подходы, в которых применяется принцип иммуноферментного анализа (ИФА), метода иммунофлюоресценции, иммуноблотинга. Применение этой группы методов базируется на использовании синтетических пептидов-фрагментов вирусных белков или рекомбинантных полипептидов, содержащих фрагменты вирусных антигенов. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования диагностических тест-систем является применение в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков вируса гепатита E, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Такие рекомбинантные белки, сохраняющие антигенные детерминанты вируса гепатит E, используются в серодиагностике заболевания, обеспечивая высокие показатели чувствительности и специфичности используемых тестов (патент US 5563032, кл. 435/5, 08.10.96).

Геном ВГЕ представляет собой одноцепочечную полиаденилированную РНК положительной полярности размером 7,3 тысяч нуклеотидных остатков (т.н.о.), содержит три открытых рамки считывания orf1, orf2 и orf3, а также недавно обнаруженную четвертую открытую рамку считывания orf4, трансляция которой происходит через внутренний сайт связывания рибосом. В процессе жизненного цикла вируса синтезируется субгеномная бицистронная РНК размером 2,2 т.н.о., кодирующая основные антигенно значимые белки ORF2 и ORF3 Ген orf2 ВГЕ кодирует капсидный белок протяженностью 660 аминокислотных остатков (а.о.) с молекулярной массой 72kDa. Известно, что для ВГЕ нейтрализующие антигенные детерминанты располагаются в области двух третей С-концевого участка ORF2-белка. Тест-системы, в которых используются различные по аминокислотным последовательностям рекомбинантные антигены ORF2 ВГЕ, различаются по показателям диагностической эффективности. Так тесты, в которых применяются антигены, включающие участок рЕ2 (394-606 а.о.) белка ORF2 (Wantai, Китай), в 10 раз превосходят по чувствительности диагностикумы, в которых данный фрагмент белка не используется (GenLabs, Сингапур). Применение антигена ORF2 позволяет изучать сероконверсию на более поздних сроках реконвалесценции и обнаруживать анамнестические антитела. Другим диагностически значимым антигеном является продукт гена orf3 - белок ORF3, или VP13, с молекулярной массой 13 kDa и протяженностью 113-114 а.о. ORF3 - мультифункциональный регуляторный белок, отвечающий за уклонение вируса от иммунного ответа хозяина, регуляцию репликации вируса, сборку и созревание вирионов, выход вируса из инфицированной клетки. Установлено, что в составе белка ORF3 имеется 3 антигенных домена в области 31 – 40 а.о., 63 - 76 а.о. и С-концевого участка, который содержит основные иммунодоминантные эпитопы. Известно, что обогащенный пролином мотив «PXXP» (в положении 63-76 а.о.) содержит линейные и поверхностно-ориентированные генотип-специфические антигенные сайты. Диагностически важной особенностью белка ORF3 является его способность взаимодействовать с сыворотками крови больных на поздних сроках острой фазы инфекции и в ранней фазе реконвалесценции. Применение антигенов, в полной мере содержащих иммунодоминантные участки данного белка перспективно не только с точки зрения возможности выявления генотип-специфических антител, но и для определения давности инфицирования и стадии заболевания гепатитом Е (ГЕ).

Наиболее близким аналогом является решение по патенту RU №2172346, опубл. 20.08.2001. В нем описан способ получения полипептида, обладающего антигенной активностью ВГЕ, предусматривающий создание участка ДНК, кодирующего полипептид, клонирование в векторной системе экспрессии с получением рекомбинантной ДНК, трансформацию клеток штамма-хозяина полученной рекомбинантной плазмидной ДНК, культивирование трансформантов и выделение целевого продукта. Особенностями способа получения полипептида заключается в получении фрагментов ДНК, кодирующих полипептиды, содержащих фрагмент белков - продуктов второй или третьей открытых рамок считывания генома ВГЕ. Создают участок ДНК, кодирующий полипептид, содержащий фрагмент белков - продуктов второй открытой рамки считывания вирусного генома с аминокислотной последовательностью (см. графическую часть формулы). Создают участок ДНК, кодирующий полипептид, содержащий фрагмент белков - продуктов второй открытой рамки считывания вирусного генома с аминокислотной последовательностью (см. графическую часть формулы). Создают участок ДНК, кодирующий полипептид, содержащий фрагмент белков-продуктов третьей открытой рамки считывания вирусного генома с аминокислотной последовательностью (см. графическую часть формулы).

Также в прототипе описан набор для определения антител к возбудителю гепатита Е-вирусу гепатита Е, включающий иммуносорбент, на основе антигенов вируса гепатита Е, реагенты для определения присутствия антител, отличающийся тем, что в качестве антигена вируса гепатита Е он содержит фрагменты белков - продуктов второй и/или третьей открытых рамок считывания вирусного генома, имеющие аминокислотные последовательности, охарактеризованные в пп.2-4 соответственно, иммобилизованные на твердом носителе в смеси и/или по отдельности.

Наиболее близким аналогом является решение по патенту RU2711907, опубликовано: 23.01.2020. В нем описан рекомбинантный белок, содержащий антигенно-значимый фрагмент белка вируса гепатита Е 1 генотипа, используемый в тест-системах для серодиагностики гепатита Е, где рекомбинантный белок имеет аминокислотную последовательность, где последовательность без учета белка-носителя (бета-галактозидазы), С-концевой фрагмент, почти полноразмерный белковый продукт ORF3 (жирный шрифт) - без одного Arg на С-конце (канонически Gln-Leu-Gly-Pro-Arg-Arg), последние 8 аминокислотных остатков на С-конце относятся к вектору, полноразмерный белковый продукт ORF3 (жирный шрифт), последние 9 аминокислотных остатков на С-конце относятся к вектору.

Технической проблемой прототипа является следующее.

ГЕ, вызываемый ВГЕ, является эмерджентным заболеванием с повсеместным распространением и в настоящее время признается важной глобальной проблемой общественного здравоохранения. В России и на территории стран постсоветского пространства доминируют штаммы ВГЕ 1 и 3 генотипов.

В связи с трудностью получения натуральных антигенов, в серодиагностике данного заболевания наибольшее распространение получили рекомбинантные антигены (РекАг), содержащие различные фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ. В зависимости от используемых РекАг наборы для диагностики ГЕ широко различаются по чувствительности и специфичности. РекАг часто содержат в своем составе белки-носители (например, β-галактозидазу E.coli), способствующие повышению уровня экспрессии целевых продуктов и облегчению технологии их выделения.

Однако присутствие таких белков часто приводит к снижению локальной концентрации диагностически-значимых эпитопов при сорбции на твердой фазе, что может быть ослаблено за счет повышения относительного содержания вирусоспецифических последовательностей в составе химерного РекАг.

Для повышения специфичности РекАг ВГЕ в иммунохимических тестах, задачей настоящего изобретения является предложение получения гибридного белка, содержащего антигенно значимые эпитопы вирусных белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в составе одной полипептидной цепи, для чего необходимо сконструировать рекомбинантную плазмиду pEL5cSHE, содержащую фрагменты генов orf2 и orf3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

Техническими результатами изобретения являются: генно-инженерная конструкция, содержащая фрагменты генов orf2 и orf3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в одной рамке считывания; штамм-продуцент мозаичного рекомбинантного полипептида с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в составе одной полипептидной цепи; очищенный мозаичный рекомбинантный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в составе одной полипептидной цепи. Использованные подходы позволили масштабировать получение белка и упростить технологию его выделения и очистки.

Указанные задача и технический результат достигаются за счет того, что заявлен белок, кодирующий мозаичный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов, имеющий аминокислотную последовательность:

MetGlyArgGlySerAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyAspSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMetTyrValSerAspThrValThr

PheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpSerLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerValSerAlaValGly

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrIleAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgAsnLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

SerGlySerGluPheAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGluSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnSerThrTyrGlySerSerThrGlyProValTyrValSerAspSerValThr

LeuValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpThrLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuSerThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnLeuLeuValGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerIleSerAlaValAla

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaLeuLeuGluAspThrMetAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgProLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

LeuGluPheGluLeuMetGlySerProCysAlaLeuGlyLeuPheCysCysCysSerSer

CysPheCysLeuCysCysProArgHisArgProAlaSerArgLeuAlaAlaValValGly

GlyAlaAlaAlaValProAlaValValSerGlyValThrGlyLeuIleLeuSerProSer

ProSerProIlePheIleGlnProThrProLeuProProThrSerTyrHisAsnProGly

LeuGluLeuAlaLeuAspSerArgProAlaProSerAlaProLeuGlyValThrSerPro

SerAlaProProLeuProProValValAspLeuProGlnLeuGlyLeuArgArgIlePhe

IleGlnProThrProSerProProMetSerProLeuArgProGlyLeuAspLeuValPhe

AlaAsnProProAspHisSerAlaProLeuGlyValThrArgProSerAlaProProLeu

ProHisValValHisLeuProGlnLeuGlyProArgGluLeuArgArg

Жирным шрифтом выделены фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

Осуществление изобретения

«Гибридный» ген, собранный из 3´-концевых фрагментов генов orf2 ВГЕ 1 и 3 генотипов, последовательности гена orf3 3 генотипа и 3’-концевого участка гена orf3 1 генотипа, был клонирован в векторе pEL5a, модифицированном с целью уменьшения размера фрагмента β-галактозидазы с помощью делеции двух третей гена LacZ. Для повышения уровня экспрессии в клетках E.coli проведена оптимизация кодонов вирусоспецифических фрагментов ДНК.

Таким образом, получена генно-инженерная конструкция, кодирующая мозаичный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в одной рамке считывания. Оптимизация кодонов клонированных фрагментов вирусоспецифической ДНК и сохранение на 5´-конце гибридного гена участка, кодирующего фрагмент белка-носителя (β-галактозидазы E.coli), позволили повысить уровень экспрессии разрабатываемого мозаичного РекАг и упростить процесс его выделения и очистки.

Получен белок, кодирующий мозаичный полипептид с фрагментами белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов, имеющий аминокислотную последовательность:

MetGlyArgGlySerAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyAspSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMetTyrValSerAspThrValThr

PheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpSerLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerValSerAlaValGly

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrIleAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgAsnLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

SerGlySerGluPheAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGluSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnSerThrTyrGlySerSerThrGlyProValTyrValSerAspSerValThr

LeuValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpThrLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuSerThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnLeuLeuValGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerIleSerAlaValAla

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaLeuLeuGluAspThrMetAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgProLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

LeuGluPheGluLeuMetGlySerProCysAlaLeuGlyLeuPheCysCysCysSerSer

CysPheCysLeuCysCysProArgHisArgProAlaSerArgLeuAlaAlaValValGly

GlyAlaAlaAlaValProAlaValValSerGlyValThrGlyLeuIleLeuSerProSer

ProSerProIlePheIleGlnProThrProLeuProProThrSerTyrHisAsnProGly

LeuGluLeuAlaLeuAspSerArgProAlaProSerAlaProLeuGlyValThrSerPro

SerAlaProProLeuProProValValAspLeuProGlnLeuGlyLeuArgArgIlePhe

IleGlnProThrProSerProProMetSerProLeuArgProGlyLeuAspLeuValPhe

AlaAsnProProAspHisSerAlaProLeuGlyValThrArgProSerAlaProProLeu

ProHisValValHisLeuProGlnLeuGlyProArgGluLeuArgArg

Жирным шрифтом выделены фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

Получение заявленного изобретением белка осуществлялось следующими этапами.

На первом этапе получили штамм E.coli - продуцент мозаичного рекомбинантного полипептида, содержащего аминокислотные последовательности белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

На территории СНГ разнообразие циркулирующих штаммов ВГЕ ограничивается, в основном, первым и третьим генотипами. Для улучшения диагностических свойств тест-систем, запланированных в проекте к разработке, была поставлена задача собрать антигенно значимые эпитопы вирусных белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в одну мозаичную структуру. Для получения системы, экпрессирующей такой гибридный белок, были использованы ранее полученные ркомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты генов ВГЕ 1 и 3 генотипов (см.:

[1. Алаторцева, Г.И. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 1-го генотипа с применением метода оптимизации кодонов. / Алаторцева Г.И. Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Доценко В.В., Амиантова И.И., Кабаргина В.Ю., Милованова А.В., Воробьев Д.С., Аммур Ю.И., Блинов В.М., Нурматов А.З., Нурматов3.Ш., Байызбекова Д.А., Касымов О.Т., Кюрегян К.К., Михайлов М.И., Жаворонок С.В., Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии – 2017 – N 6 – C. 63-72.

2. Алаторцева, Г.И. Получение рекомбинантного аналога капсидного белка вируса гепатита Е первого генотипа: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. / Г.И. Алаторцева, А.В. Сидоров, Л.Н. Нестеренко, Л.Н. Лухверчик, В.В. Доценко, И.И. Амиантова, А.В. Милованова, Д.С. Воробьев, Ю.И. Аммур, М.И. Михайлов, К.К. Кюрегян, В.С. Кичатова, И.А. Потемкин, О.В. Исаева, Е.Ю. Малинникова, А.А. Карлсен, В.М. Блинов, З.Ш. Нурматов, А.З. Нурматов, О.Т. Касымов, С.В. Жаворонок, В.В. Зверев // ЖМЭИ – 2017 – N 6 – C. 72-80.

3. Алаторцева, Г.И. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 3 генотипа и оценка его антигенных свойств. / Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Милованова А.В., Аммур Ю.И., Михайлов М.И., Кюрегян К.К., Жаворонок С.В., Зверев В.В. // ЖМЭИ – 2018 – N. 5 – C. 46-53.

4. Алаторцева, Г.И. Разработка рекомбинантного белка капсида вируса гепатита Е третьего генотипа: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. / Алаторцева Г.И., А.В. Сидоров, Л.Н. Нестеренко, Л.Н. Лухверчик, В.В. Доценко, И.И. Амиантова, М.В. Жукина, В.Ю. Кабаргина, А.В. Милованова, Д.С. Воробьев, Ю.И. Аммур, М.И. Михайлов, К.К. Кюрегян, Е.Ю. Малинникова, С.В. Жаворонок, В.М. Блинов, В.В. Зверев // ЖМЭИ – 2019 – N. 1 – С. 10-17.

4. Изобретение RU2711907 (прототип)].

Ниже представлены результаты по получению экспрессирующего вектора и штамма E.coli - продуцента мозаичного рекомбинантного полипептида, содержащего аминокислотные последовательности белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов.

Использовали бактериальные штаммы и плазмидные векторы: штаммы E.coli PLT90: (F- lon: Tn10 (TetR) endA1 malPpa: [PR, c1857] Mal-, λ imm) thi hsdR17) [см. RU2043409]. Векторы pAL2-T и pKAN-T(Евроген) применяли для клонирования продуктов ПЦР; pET28a (Novagen, Merck Biosciences, США) – для сборки мозаичного фрагмента; pEL5c, производную вектора pEL5a [см. RU №2071503, опубл. 10.01.1997] – для экспрессии рекомбинантного полипептида. В работе использовали компетентные клетки E.сoli CC001 (Евроген) генотипа XL-Blue; для экспрессии – штамм E.сoli PLT90.

В качестве сырья и реактивов использовали нижеследующие:

Дрожжевой экстракт, пептон, глицерин, глюкоза безводная, пеногаситель, магния сульфат, кальция хлорид, калия дигидрофосфат, тетрациклин, ампициллин, калия гидрофосфат, натрия гидроксид, натрия хлорид, вода, очищенная на приборе «Simplicity UV» (Merck Millipore, Франция) до конечного удельного сопротивления 18 мегаОм/см. Cмеси нуклеотидтрифосфатов, буферные растворы для проведения работ по клонированию, синтезу и очистке праймеров заказывали в компаниях ЗАО «Синтол» и ООО «Евроген», Россия. Набор для идентификации грамотрицательных палочек «api 20 E» (компания «bioMérieux», Франция). Среды готовили, используя триптон и NaCl (Panreac, Испания), дрожжевой экстракт (Becton Dickinson, США), бакто-агар (Difco, США). В работе использовали реактивы и ферменты следующих производителей: эндонуклеазы рестрикции производства компаний ThermoFiisher (США), СибЭнзим (Россия); соли и другие химические реактивы – Хеликон (Россия), Sigma (США), Merck (США), Панэко (Россия); антарктическую щелочную фосфатазу – ThermoFisher (США); T4 ДНК лигазу – Евроген (Россия); термофильную Taq ДНК Полимеразу – Синтол (Россия); высокоточную Phusion ДНК Полимеразу – ThermoFisher (США).

- пероксидазный конъюгат мышиных моноклональных антител к IgG человека ООО «Сорбент-Сервис» (Россия);

- мышиные моноклональные (МАТ) к иммуноглобулинам класса G человека;

- антивидовой конъюгат «Пероксидаза - антитела козы к иммуноглобулинам кролика», кат. № P-GAR Iss, (ООО «Имтек», Россия);

- рекомбинантные полипептиды ORF2/3_ВГЕ1/3, ORF2 ВГЕ 1 и 3 генотипов, ORF3 ВГЕ 3 генотипа из коллекции рекомбинантных антигенов ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова);

- поликлональные кроличьи антитела α1.9.11.15, полученные к рекомбинантному белку ORF2 1 генотипа, от 06.11.15;

- поликлональные кроличьи антитела α1.63.06.18, полученные к рекомбинантному белку ORF2 3 генотипа, от 05.06.18;

- поликлональные кроличьи антитела α1.84.01.18, полученные к рекомбинантному белку ORF3 3 генотипа, от 15.01.18;

- поликлональные кроличьи антитела α1.54.11.19, полученные к рекомбинантному полипептиду ORF2/3-ВГЕ1/3, от 18.11.19

- поликлональные кроличьи антитела β1.46.04.19, полученные к рекомбинантному антигену р120 ВИЧ-1, от 25.04.19.

Все препараты поликлональных кроличьих антител в предварительных исследованиях показали отсутствие взаимодействия с β-галактозидазой E.coli.

Образцы сывороток крови, отрицательные (n=30) и положительные (n=30) в отношении содержания IgG-антител и IgМ-антител к ВГЕ, предоставленные БГМУ (Минск, Беларусь) и НПО «Профилактическая медицина» (Бишкек, Кыргызстан). Все образцы были протестированы: на содержание IgG-антител к ВГЕ с помощью наборов реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G», экспериментального образца тест-системы для определения суммарных антител к ВГЕ «Скрин-ВГЕ-АТ» (НИИВС им. И. И. Мечникова) и «RecomWeel HEV IgG» (Euroimmun, Германия).

Наборы мебран mdi Easypack «Advanced Microdevices» (Индия), включающие закрепленную на твердой основе рабочую мембрану CNPF SN12 с размером пор 10 мкм, стекловолоконную мембрану для коллоидного конъюгата PT R7, мембрану для нанесения пробы FR 1 и конечную адсорбирующую мембрану AP045.

Использовали следующие методы.

Биоинформационные методы. Стратегию клонирования, включая анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и дизайн праймеров, а также оптимизацию кодонов разрабатывали, используя пакет программ Vector NTI ver. 11.0. Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы AlignX, входящей в пакет Vector NTI. Оптимизацию кодонов проводили по частоте встречаемости кодонов в белке-носителе вектора для экспрессии с последующим заказом синтеза оптимизированной последовательности в фирме Евроген (Россия).

Молекулярно-биологические методы. Для приготовления стандартных микробиологических сред и буферных растворов использовали общепринятые протоколы [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. – М.: Мир, 1984. – 487 c]. Синтез праймеров для проведения ПЦР и секвенирования проводили на автоматическом ДНК синтезаторе ASM-1000 фирмы «Биосет», Новосибирск, Россия в ЦКП ВНИИСБ «Биотехнология». Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили методом Сэнгера в модификации капиллярного электрофореза в ЦКП ВНИИСБ «Биотехнология» на геномном анализаторе ABI-3130-XL фирмы «Applied Biosystems», США.

Электрофорез ДНК в агарозном геле. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле проводили стандартным методом [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. – М.: Мир, 1984. – 487 c]. Фрагменты ДНК визуализировали с помощью интеркалирующего красителя бромистого этидия, добавляемого в гель. Концентрацию агарозы в геле подбирали в зависимости от молекулярной массы разделяемых фрагментов ДНК, варьируя от 0,7 до 2 %. В качестве маркеров молекулярных масс использовали ДНК бактериофага λ, обработанную рестриктазой Pst1.

Определение концентрации ДНК. Концентрацию ДНК (двуцепочечной ДНК в плазмидах и ДНК-фрагментах, либо одноцепочечной ДНК в олигонуклеотидах) оценивали по соотношениям значений оптической плотности при длинах волн 230 нм, 260 нм и 280 нм, определенных на спектрофотометре NanoDrop 2000 (ThermoFisher, США). Альтернативно концентрацию двуцепочечной ДНК определяли, сравнивая интенсивность полос образцов и маркеров молекулярных масс на электрофореграммах агарозных гелей на приборе Molecular Imager GelDoc (Bio-Rad).

Выделение плазмидной ДНК мультикопийных плазмид. Плазмидную ДНК выделяли из 5 мл ночной культуры бактерий на колонках фирмы Евроген по протоколу производителя.

Выделение плазмидной ДНК малокопийных плазмид. Для выделения малокопийной плазмидной ДНК при культивировании бактериальных культур использовали среду TB, отличающуюся повышенным содержанием дрожжевого экстракта (24 г/л) [Wood, W.N. Enhancing Yields of Low and Single Copy Number Plasmid DNAs From Escherichia Coli Cells / Wood W.N., Smith K.D., Ream J.A., Lewis L.K. // J Microbiol Meth – 2017 – Vol. 133 – P. 46-51.].

Выделение ДНК из агарозного геля. Фрагмент ДНК (продукты ПЦР или фрагменты ДНК) разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле в присутствии красителя кристаллического фиолетового в концентрации 100 мкг/мл. Минимально необходимое исходное количество ДНК для разделения, составляющее 2-3 мг, определяли спектрофотометрически или по результатам предварительного электрофореза в присутствии бромистого этидия. После разделения из геля на свету вырезали полоску синего цвета нужной молекулярной массы и очищали на колонках фирмы «Евроген» (Россия) согласно протоколу производителя.

Очистка ДНК после ферментативных реакций. ДНК после ферментативных реакций очищали на колонках производства фирмы «Евроген» (Россия) согласно рекомендациям производителя.

Амплификация ДНК. Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью высокоточной ДНК-полимеразы Phusion (Thermofisher, США) согласно рекомендациям производителя. Продукты ПЦР обрабатывали дополнительно Taq полимеразой (Синтол, Россия) для возможности проведения последующего А/Т-клонирования.

Приготовление вектора. Для A/T клонирования продуктов ПЦР использовали коммерческие наборы фирмы Евроген (Россия). При клонировании по сайтам рестрикции плазмидную ДНК после расщепления соответствующей рестриктазой дополнительно обрабатывали щелочной фосфатазой (Shrimp Alkaline Phospatase, ThermoFisher, США) с последующей очисткой на колонках Евроген (Россия).

Лигирование. Лигирование полученной проводили при +10 ºС в течение 12 часов с молярным соотношением концентраций лигируемых концов вектор:вставка в пределах 1:3 - 1:15.

Трансформация. Трансформацию компетентных клеток E.coli СС001 (Евроген, Россия), либо E.coli PLT90 проводили по следующему протоколу: к 100 мкл компетентных клеток добавляли 3 мкл лигазной смеси и выдерживали во льду в течение 30 минут. Затем компетентные клетки нагревали (тепловой шок) в водяной бане при температуре от +32°С до +34°С (E.coli PLT90) или от +4°С до +42°С (E.coli СС001) в течение 30-45 сек. Далее снова выдерживали во льду в течение 5 минут и добавляли среду SOC [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. – М.: Мир, 1984. – 487 c.] из расчета на 100 мкл клеток - 200 мкл среды. Полученную смесь выдерживали в суховоздушном шейкере-инкубаторе при 220 об/мин в течение 1 часа при температуре +30°С (E.coli PLT90) или +37°С (E.coli СС001). Затем высевали по 50 мкл смеси на LB-агар с нужным антибиотиком (ампицилин или канамицин) и выращивали при температуре +30°С (E.coli PLT90) или +37°С (E.coli СС001) в течение 16-20 часов. На следующий день отбирали отдельные колонии и засевали в 5 мл жидкой среды с антибиотиком. Инкубацию проводили при 220 об/мин в течение 18-24 часов при температуре +30°С (E.coli PLT90) или +37°С (E.coli СС001). Выросшую культуру центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин при +4°С. Надосадочную жидкость сливали, осадок бактерий использовали для выделения плазмидной ДНК.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (https://doi.org/10.21769/BioProtoc.80). Электрофорез проводили на приборе приборе Mini-ProteanTetraCellSystem фирмы «BioRad» (США) в 7,5 % или 10 % разделяющем SDS - полиакриламидном геле в Трис-глициновом буфере (0,025М Трис, 0,192М глицина, 0,1 % SDS). Буфер для образцов содержал 0,0625М Трис, 2,3 % SDS, 1 % 2-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 0,05% бромфенолового синего. В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор белков - маркеров производства фирмы «Sigma» (CША). По завершении электрофореза гель окрашивали в растворе, содержащем 0,1 % Кумасси R-250, 10 % уксусной кислоты и 25 % этилового спирта, несвязавшийся краситель отмывали в нескольких сменах раствора, содержащего 10 % уксусной кислоты и 25 % этилового спирта.

Вестерн-блоттинг

Иммобилизацию белков на нитроцеллюлозной мембране проводили по ранее описанному методу [Towbin, H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications / H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1979. – V.76. – N.9. – P.4350 – 4354] на приборе для электропереноса Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, США) по рекомендациям производителя. По окончании электропереноса контролировали его качество окрашиванием мембран в течение 5 минут 0,2 % раствором PONSO S в 3% растворе трихлоруксусной кислоты. Несвязавшийся с белками краситель отмывали дистиллированной водой. На фильтре отмечали положение белковых зон. Фильтры промывали три раза по 5 минут буфером TBS-T (20 мМ Трис-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,05 % Твин 20) до полного обесцвечивания. Затем нитроцеллюлозную мембрану с иммобилизованными белками инкубировали в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 5% сухого обезжиренного молока в буфере TBS-T. Затем мембрану инкубировали в течение 1 часа при +37°С с содержащей антитела к ВГЕ человеческой сывороткой в 100-кратном разведении в буфере ТBS-T с 5% лизата бактерий E.coli PLT90. После трехкратной промывки в буфере TBS-T фильтр инкубировали в растворе конъюгата моноклональных антител к Fc-фрагменту иммуноглобулинов IgG человека с пероксидазой хрена в течение 30 минут при +37°С и вновь три раза отмывали в буфере TBS-T. Реакцию проявляли субстратным раствором (0,04 % диаминобензидина и 0,003 % H₂O₂ в растворе 50 мМ Трис-HCl pH7,5) в течение 15-20 минут при комнатной температуре без доступа света. Реакцию останавливали, промывая мембрану водой.

Непрямой иммуноферментный анализ с сыворотками крови человека проводили на иммуносорбенте, полученном с помощью сорбции рекомбинантных антигенов ORF2 и ВГЕ 1 и 3 генотипов и ORF2 ВГЕ 3 генотипа и мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 в концентрации 0,75 мкг/мл в 60 мМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6 (КББ) в лунках 96-луночных полистироловых планшетов («Costar», США) в течение 16 часов при температуре +4°С. Исследуемые образцы сывороток крови разводили в соотношении 1:10 в растворе 0,01 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,5, содержащего 0,05% Твина-20 и 0,9% казеина, - и вносили в соответствующие лунки планшетов с сорбированными рекомбинантными антигенами. Инкубировали в течение 30 минут при температуре +37°С и промывали 3 раза с помощью автоматического устройства для промывания планшет «WellWash» (BioRad, США). Наличие или отсутствие связывания антител с изучаемыми рекомбинантными белками выявляли с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена моноклональных антител к IgG человека. Для этого 100 мкл рабочего разведения (1:30000) пероксидазного конъюгата моноклональных антител мыши к IgG человека в 0,1 М ФСБ pH 7,5, содержащем 0,05% Твин-20 и 0,9% казеина, вносили в каждую лунку, инкубировали полчаса при температуре +37°С и промывали 3 раза. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл индикаторного раствора, содержащего субстрат и хромоген - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, поместив в защищенное от света место. Реакцию останавливали путем внесения во все лунки по 100 мкл 0,5М раствора серной кислоты. Оптическую плотность раствора в каждой лунке измеряли при двух длинах волн 450 нм и 620 нм с помощью спектрофотометра Multiscan GO (Thermoscientific, США). Для оценки результатов рассчитывали уровень ОП критического для мозаичного полипептида и каждого из рекомбинантных белков по формуле: среднее значение ОП отрицательных сывороток плюс трехкратное стандартное отклонение (σ).

Непрямой иммуноферментный анализ с сыворотками крови иммунизированных кроликов проводили с использованием рекомбинантных антигенов ORF2 и ВГЕ 1 и 3 генотипов и ORF2 ВГЕ 3 генотипа и мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3, сорбированных в концентрации 0,75 мкг/мл в 10 мМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6 в лунках 96-луночных полистироловых планшетов («Costar», США) в течение 16 часов при температуре +4°С. Из используемых препаратов кроличьих антител (α1.9.11.15, α1.63.06.18, α1.84.01.18, α1.54.11.19) готовили серии разведений от 1:200 до 1: 204800 с 4-кратным шагом в растворе ФСБ pH 7,5, содержащем 0,05% Твин-20, 0,9% казеина и вносили в лунки планшетов с иммуносорбентами. Инкубировали в течение 30 минут при температуре +37°С и промывали 3 раза с помощью автоматического устройства «WellWash» (BioRad, США). Наличие или отсутствие связывания препаратов антител с изучаемыми рекомбинантными белками выявляли с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена козьих поликлональных антител к IgG кролика (P-GAR Iss). Для этого 100 мкл рабочего разведения (1:5000) конъюгата в ФСБ pH 7,5, содержащем 0,05% Твин-20 и 0,9% казеина, вносили в каждую лунку, инкубировали полчаса при температуре +37°С и промывали 3 раза. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл индикаторного раствора, содержащего субстрат и хромоген - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, поместив в защищенное от света место. Реакцию останавливали внесением во все лунки по 100 мкл 0,5М раствора серной кислоты. Оптическую плотность раствора в каждой лунке измеряли при двух длинах волн 450 нм и 620 нм с помощью спектрофотометра Multiscan GO (Thermoscientific, США).

Для проведения ИФА в иммунометрическом формате рекомбинантный полипептид ORF2/3_ВГЕ1/3 по 1,0 мкг/мл сорбировали в 60 мМ КББ в лунках 96-луночных полистироловых планшетов («Costar», США) в течение 16 часов при температуре +4°С. Предварительно готовили серии разведений кроличьих антител (α1.9.11.15, α1.63.06.18, α1.84.01.18, α1.54.11.19, β1.46.04.19) от 1:200 до 1: 204800 с 4-кратным шагом в ФСБ pH 7,5, содержащем 0,05% Твин-20, 0,9% казеина. По 10 мкл каждого разведения и по 90 мкл пероксидазного конъюгата ORF2/3-ВГЕ1/3 [1:16000] последовательно вносили в каждую лунку иммуносорбента. Для разведения конъюгата использовали ФСБ pH 7,5, содержащий 0,05% Твин-20, 0,9% казеина. Заполненный иммуносорбент инкубировали в течение 60 минут при температуре +37°С и промывали 5 раз с помощью автоматического устройства «WellWash» (BioRad, США). В каждую лунку вносили по 100 мкл индикаторного раствора, содержащего субстрат и хромоген - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, поместив в защищенное от света место. Реакцию останавливали путем внесения во все лунки по 100 мкл 0,5 М раствора серной кислоты. Оптическую плотность раствора в каждой лунке измеряли при двух длинах волн 450 нм и 620 нм с помощью спектрофотометра Multiscan GO (Thermoscientific, США).

Описание ряда методов, условий постановки эксперимента, состав питательных сред и растворов приводятся при изложении полученных результатов.

Результаты

В процессе работ получен фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидные последовательности участков генов orf2 и orf3 ВГЕ 1 и 3 генотипов, кодирующий рекомбинантный белок, содержащий диагностически значимые эпитопы белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов в виде одной полипептидной цепи со следующей аминокислотной последовательностью:

MetGlyArgGlySerAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyAspSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMetTyrValSerAspThrValThr

PheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpSerLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerValSerAlaValGly

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrIleAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgAsnLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

SerGlySerGluPheAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGluSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnSerThrTyrGlySerSerThrGlyProValTyrValSerAspSerValThr

LeuValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpThrLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuSerThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnLeuLeuValGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerIleSerAlaValAla

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaLeuLeuGluAspThrMetAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgProLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

LeuGluPheGluLeuMetGlySerProCysAlaLeuGlyLeuPheCysCysCysSerSer

CysPheCysLeuCysCysProArgHisArgProAlaSerArgLeuAlaAlaValValGly

GlyAlaAlaAlaValProAlaValValSerGlyValThrGlyLeuIleLeuSerProSer

ProSerProIlePheIleGlnProThrProLeuProProThrSerTyrHisAsnProGly

LeuGluLeuAlaLeuAspSerArgProAlaProSerAlaProLeuGlyValThrSerPro

SerAlaProProLeuProProValValAspLeuProGlnLeuGlyLeuArgArgIlePhe

IleGlnProThrProSerProProMetSerProLeuArgProGlyLeuAspLeuValPhe

AlaAsnProProAspHisSerAlaProLeuGlyValThrArgProSerAlaProProLeu

ProHisValValHisLeuProGlnLeuGlyProArgGluLeuArgArg

Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая приведенный выше полипептид:

ATGGGTCGCGGATCCAATGGCGAACCGACCGTGAAACTGTATACCAGCGTGGAGAATGCGCAACAGGACA

AAGGCATTGCGATTCCACATGACATTGATCTTGGCGATAGTCGTGTTGTGATTCAGGACTATGACAACCA

GCATGAACAGGATCGTCCGACCCCGTCTCCAGCACCGAGTCGTCCGTTCAGCGTGCTGCGTGCGAACGAT

GTTCTGTGGTTGAGTCTGACAGCAGCTGAATATGATCAGACCACCTATGGCAGCAGCACCAATCCGATGT

ATGTGAGCGATACCGTGACCTTTGTGAACGTGGCGACTGGTGCGCAGGCAGTTGCACGCAGCCTGGATTG

GAGCAAAGTGACCCTGGATGGTCGTCCGTTGACTACCATTCAGCAGTACAGCAAGACCTTCTATGTGCTT

CCGTTGCGTGGCAAACTGAGCTTCTGGGAAGCAGGCACGACCAAAGCAGGCTATCCGTACAACTACAACA

CGACTGCGAGCGATCAGATTCTGATTGAGAACGCTGCAGGCCATCGTGTTGCGATCAGCACCTATACCAC

CAGCCTTGGTGCGGGTCCGGTGTCTGTGAGTGCGGTTGGCGTGCTGGCACCGCATAGCGCACTGGCGGTG

CTGGAAGATACCATTGACTATCCAGCACGTGCGCACACCTTTGATGACTTCTGTCCGGAGTGTCGCAACC

TTGGTCTGCAAGGCTGTGCGTTTCAGAGCACCGTGGCGGAACTGCAACGTCTGAAGATGAAAGTGGGCAA

GACTCGCGAATCTGGATCCGAATTCAATGGCGAACCGACCGTGAAACTGTATACCAGCGTGGAAAATGCG

CAGCAGGATAAAGGCATTGCGATTCCGCATGATATTGATCTGGGTGAAAGCCGTGTTGTGATTCAGGATT

ATGATAACCAGCATGAACAGGATCGTCCGACCCCGAGCCCGGCACCGAGCCGTCCGTTCAGCGTGCTGCG

TGCGAACGATGTTCTGTGGCTGAGCCTGACAGCAGCGGAATATGATCAGAGCACCTATGGTAGCAGCACC

GGTCCGGTGTATGTTAGCGATAGCGTAACCCTGGTAAACGTTGCCACCGGTGCACAGGCTGTTGCACGTA

GCCTGGATTGGACCAAAGTGACCCTGGATGGTCGTCCGCTGAGCACCATTCAGCAGTACAGCAAAACCTT

CTTTGTGCTGCCGCTGCGTGGTAAACTGAGCTTCTGGGAAGCAGGCACGACCAAAGCAGGCTATCCGTAC

AACTACAACACCACGGCAAGCGATCAGCTGCTGGTCGAAAACGCTGCAGGTCATCGTGTTGCGATTAGCA

CCTATACCACGAGCCTGGGTGCAGGTCCGGTTAGCATTAGCGCAGTTGCTGTCCTGGCACCGCATAGCGC

ACTGGCTCTGCTGGAAGATACCATGGATTATCCGGCACGTGCGCATACCTTTGATGACTTCTGCCCGGAA

TGCCGTCCTCTGGGTCTGCAGGGTTGCGCGTTTCAGAGCACCGTTGCCGAACTGCAGCGTCTGAAAATGA

AAGTGGGTAAAACCCGTGAACTTGAATTCGAGCTCATGGGCAGTCCGTGTGCATTGGGTCTGTTCTGCTG

TTGCAGCTCCTGCTTCTGTCTGTGCTGTCCTCGTCATCGTCCTGCGAGTCGCTTGGCAGCTGTGGTTGGT

GGTGCAGCAGCGGTTCCAGCAGTGGTGAGTGGCGTGACCGGCTTGATTCTGAGTCCGTCACCGAGCCCGA

TCTTCATTCAACCGACGCCGTTGCCTCCGACCAGCTATCACAATCCAGGCTTGGAATTGGCGCTGGACTC

ACGTCCGGCACCGAGTGCTCCGTTGGGCGTGACCAGTCCGTCAGCACCTCCTCTGCCACCGGTTGTGGAT

CTTCCGCAGCTTGGCTTGCGTCGCATTTTCATCCAGCCAACGCCGTCACCACCGATGAGTCCGTTGCGTC

CTGGCTTGGATCTGGTGTTTGCGAACCCTCCTGATCATAGCGCACCGCTTGGTGTTACCCGTCCGAGTGC

ACCACCGTTGCCGCATGTGGTGCATCTTCCTCAGTTAGGTCCACGTGAGCTCCGTCGA

Модификация вектора экспрессии pEL5a

Для уменьшения размера белка-носителя (β-галактозидазы E.coli) из вектора pEL5a была получена плазмида для экспрессии pEL5c-cut. Для этого плазмиду обрабатывали рестриктазами EcoRV и SmaI, лигировали по тупым концам и трансформировали в компетентные клетки штамма E.coli PLT90. Отбирали клоны, устойчивые к ампициллину, из них выделяли плазмидную ДНК, полученные плазмиды секвенировали. В результате был получен вектор pEL5c-сut, содержащий фрагмент ДНК, кодирующий укороченную версию белка-носителя (β-галактозидазы), а именно N-концевой участок, составляющий примерно 40 % от полноразмерной β-галактозидазы (см. Фиг.1, где показана схема pEL5a (А) и укороченного варианта pEL5c-cut (Б)).

Оптимизация кодонов клонируемого фрагмента кДНК orf2 ВГЕ 1 генотипа

Для улучшения экспрессии в бактериальной системе по аналогии с оптимизацией кодонов в orf2 и orf3 ВГЕ 3 генотипа [Алаторцева, Г.И. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 3 генотипа и оценка его антигенных свойств. / Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Милованова А.В., Аммур Ю.И., Михайлов М.И., Кюрегян К.К., Жаворонок С.В., Зверев В.В. // ЖМЭИ – 2018 – N. 5 – C. 46-53.; Г.И. Алаторцева Разработка рекомбинантного белка капсида вируса гепатита Е третьего генотипа: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. / Г.И. Алаторцева А.В. Сидоров, Л.Н. Нестеренко, Л.Н. Лухверчик, В.В. Доценко, И.И. Амиантова, М.В. Жукина, В.Ю. Кабаргина, А.В. Милованова, Д.С. Воробьев, Ю.И. Аммур, М.И. Михайлов, К.К.Кюрегян, Е.Ю. Малинникова, С. В. Жаворонок, В.М. Блинов, В.В. Зверев // ЖМЭИ – 2019 – N 1 – C. 10-17] была проведена оптимизация последовательности гена orf2 ВГЕ 1 генотипа. Оптимизацию проводили по результатам анализа частоты встречаемости кодонов вирусных генов по сравнению с кодонами, используемыми бактерией для экспрессии белка-носителя - β-галактозидазы. Редкие кодоны заменяли на более обычные для E.coli, при этом стараясь избегать палиндромных повторов и излишнего GC-обогащения во избежание затруднений с синтезом генов и последующим их клонированием.

Синтез фрагмента кДНК гена orf2 ВГЕ 1 генотипа с оптимизированной последовательностью нуклеотидов был осуществлен в виде оптимизированной последовательности ранее клонированного фрагмента гена orf2 ВГЕ 1 генотипа (см. Фиг.2).

Получение «гибридного» гена orf3 ВГЕ 1 и 2 генотипов

Был также сконструирован «гибридный» ген orf3, содержащий оптимизированные последовательности гена orf3 ВГЕ 3 генотипа [Алаторцева, Г.И. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 1-го генотипа с применением метода оптимизации кодонов. / Алаторцева Г.И. Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Доценко В.В., Амиантова И.И., Кабаргина В.Ю., Милованова А.В., Воробьев Д.С., Аммур Ю.И., Блинов В.М., Нурматов А.З., Нурматов3.Ш., Байызбекова Д.А., Касымов О.Т., Кюрегян К.К., Михайлов М.И., Жаворонок С.В., Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии – 2017 – N 6 – C. 63-72.] и 3’-концевого участка гена orf3 ВГЕ 1 генотипа (orf3+1) (см. Фиг3, где показана оптимизированная последовательность гена orf3 3 генотипа, соединенная с оптимизированной последовательностью 3’-концевого участка гена orf3 1 генотипа).

В результате сравнительного анализа аминокислотных последовательностей белков ORF3 (см. Фиг.4, где показан сравнительный анализ аминокислотных последовательностей ORF3 ВГЕ 3 генотипа изолятов, выделенных в разных странах мира; последовательности ORF3-HE3 и ORF3-HE1 относятся к белкам ORF3 ВГЕ 3 и 1 генотипов, используемым в настоящем исследовании), было показано, что у белков 1 и 3 генотипов они практически совпадают, за исключением С-концевого фрагмента, поэтому был сконструирован гибридный фрагмент ДНК orf3+1, содержащий оптимизированные последовательности гена orf3 3 генотипа и 3’-концевого участка гена orf3 1 генотипа, кодирующего наиболее гетерогенный фрагмент белка. Нуклеотидная последовательность мозаичного фрагмента была оптимизирована по алгоритму, описанному выше. Синтез гибридного фрагмента orf3+1 с оптимизированной последовательностью нуклеотидов был осуществлён в компании Евроген.

Получение плазмиды pEL5cSHE для экспрессии мозаичного рекомбинантного полипептида

Полученный ранее оптимизированный фрагмент гена orf2 ВГЕ 3 генотипа, фланкированный сайтами рестрикции BamHI, был клонирован в вектор pET28a (Novagen) по сайту BamHI. Наличие и ориентацию вставки в векторе подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием полученной плазмиды (см. Фиг.5).

На Фиг.5 показаны первичные данные по анализу результатов на примере клонирования фрагмента orf2(3) в вектор pET28a:

А) разделение фрагментов плазмидных ДНК в 0,8 %-ном агарозном геле после обработки рестриктазами NcoI и HindIII; дорожки 1 и 5 - плазмиды без обработки ферментами, дорожки 2 и 4 - реакционные смеси, дорожка 3 - маркеры молекулярных масс. Выщепляемая вставка (нижние полоски на дорожках 2 и 4) идёт чуть ниже полосы маркера 1 kb, что соответствует расчетному значению (0,98 kb).

Б) первичная последовательность и частичный хроматографический профиль после секвенирования по Сэнгеру с использованием прямого праймера T7uni. Отмечена последовательность сайта рестрикции BamHI, по которому проводили клонирование, слева от сайта последовательность плазмиды, справа – вставки в прямой ориентации.

Далее, в плазмиду по сайту EcoRI вставили оптимизированный фрагмент гена orf2 ВГЕ 1 генотипа, а затем по сайту SacI фрагмент orf3+1. Каждый шаг клонирования подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием. Полученный вектор использовали как ДНК-матрицу для амплификации мозаичного фрагмента orf2(3)-orf2(1)-orf3+1 с последующим A/T-клонированием в вектор pKAN-T (Евроген). Для амплификации использовали праймеры, фланкированные сайтами SalI. Отбирали клоны, устойчивые к канамицину, выделяли плазмидную ДНК и проверяли наличие вставки с помощью рестрикционного анализа с последующей визуализацией в агарозном геле. Вставку вырезали и клонировали в вектор pEL5c-cut по сайту SalI. В результате была получена плазмида для экспрессии pEL5cSHE, содержащая фрагмент ДНК, кодирующий мозаичный рекомбинантный полипептид в виде слитного с укороченной β-галактозидазой белка (см. Фиг.6, где показана схема pET28aS и конечной плазмиды pEL5cSHE).

Наличие и ориентацию вставки подтверждали секвенированием. Расчетная полипептидная последовательность и физико-химические свойства белка, кодируемого клонированным фрагментом ДНК, представлены на Фиг.7, где показаны расчетные характеристики мозаичного рекомбинантного полипептида, аминокислотная последовательность (А), его физико-химические свойства (Б).

Получение штамма E. coli - продуцента мозаичного рекомбинантного полипептида

Отбор клонов рекомбинантных штаммов E.coli PLT90 для получения штамм-продуцента рекомбинантного белка

В результате трансформации рекомбинантной плазмидой компетентной культуры клеток E.coli PLT90 были получены клеточные клоны, которые пересевали в 0,5 мл жидкой LB-среды с антибиотиком ампициллином, выращивали в течение 12 часов при 30°С, затем вносили в 10 мл такой же среды и культивировали 3 часа при 30°С и 2 часа при 39°С. Лизаты полученных биомасс анализировали методами электрофореза в SDS-полиакриламином геле (SDS-ПААГ) и Вестернблоттинга с образцом пулированной сывороткой крови человека, содержащей IgG-антитела к ВГЕ. Отбирали клоны, в белковых профилях лизатов которых присутствовала полоса, соответствующая белку с молекулярной массой 121,5 кД, окрашивающаяся в реакции Вестернблоттинга.

По результатам анализа для дальнейших исследований в качестве штамма-продуцента E.сoli PLT90_ORF2/3_ВГЕ1/3 был отобран клон, для которого было показано наибольшее содержание в лизате биомассы целевого белка, обладающего соответствующей молекулярной массой и способностью взаимодействовать со специфическими IgG-антителами. На Фиг.8 представлен анализ с помощью электрофореза в 7% SDS-ПААГ (А) и Вестернблоттинга с пулом сывороток крови больных ГЕ (Б) белкового профиля отобранного клона-продуцента рекомбинантного белка ORF2/3_ВГЕ1/3 после трансформации рекомбинантной плазмидой pEL5cSHE. В качестве положительного образца использовали ранее полученный рекомбинантный белок ORF3 ВГЕ 1 генотипа, имеющий участок гомологии аминокислотной последовательности с исследуемым мозаичным рекомбинантным полипептидом и близкое значение молекулярной массы (128,5 кДа). В качестве отрицательного контрольного образца - β-галактозидазу E.coli, выделенную из клеток штамма PLT90, трансформированных векторной плазмидой без вставки вирусоспецифического фрагмента ДНК. Дорожки: 1 - лизат биомассы клеток E.coli PLT90, трансформированных рекомбинантной плазмидой pEL5cSHE, 2 – ранее полученный рекомбинантный белок ORF3 ВГЕ 1-го генотипа; 3 - β-галактозидаза E.coli, выделенная из клеток штамма PLT90, трансформированных плазмидой pEL5a - 4 - белковые маркеры молекулярных масс. Стрелкой показано положение β-галактозидазы E.coli.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма E.сoli PLT90_ORF1/2-ВГЕ1/3 - продуцента мозаичного рекомбинантного полипептида

Культурально-морфологические характеристики

Клетки мелкие, прямые, утолщенной палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные, капсул не образуют. Размер клеток в длину 3-4 мкм, в ширину 0,8-1 мкм. Клетки хорошо растут как на простых питательных средах, так и богатых средах. При росте на LB-агаре при температуре +37°С образуются круглые, гладкие, выпуклые, мутные, блестящие, серые колонии, с ровными краями. Колонии клеток, выросшие на агаре при температуре +30÷32°С, имеют «слизистый» фенотип, характерный для колоний клеток с lon-мутациями, растущих при пониженной температуре. При росте в жидких средах (в минимальной среде с глюкозой или в LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физиолого-биохимические характеристики

Аэробы. Клетки хорошо растут при температуре в пределах от +4 до +32°С при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Не сбраживают мальтозу. Уреазная активность не образуется. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам

Клетки проявляют устойчивость к тетрациклину (до 40 мкг/мл) и ампициллину (до 100 мгк/мл).

Биотехнологические характеристики

Молекулярная масса рекомбинантного белка, синтезируемого штаммом Escherichia coli PLT90_ORF2/3_ВГЕ1/3 составляет 121,5 кДа. Продуктивность штамма соответствует выходу 450 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 5×10⁸ кл/мл.

Генетическая характеристика

Генотип штамма хозяина: (F- lon: Tn10 (TetR) endA1 malPpa: [PR, c1857] Mal-, λ imm) thi hsdR17)

Описание рекомбинантной плазмиды:

- название рекомбинантной плазмиды pEL5сSHE

- размер 6,564 тысячи пар оснований (т.п.о.)

- сведения о векторе, на основе которого сконструирована плазмида: название pEL5с-cut, размер 4,489 т.п.о., состоит из следующих элементов: Xbal-Xbal-фрагмент плазмидной ДНК бактериального вектора pEL5а размером 3,889 т.п.о. который содержит слитый cro-lacZ с укороченным фрагментом «lacZ» - ген кодирующий слитный белок под контролем промотора РR бактериофага лямбда, ген резистентности к ампициллину, полилинкер в 3'-конце lacZ-гена; фрагмента ДНК плазмиды pLysS, содержащего ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющего размер 0,6 т.п.о. [Патент RU №2071501 C1].

- сведения о клонированной ДНК: в качестве источника кДНК использовали рекомбинантные плазмиды, pEL5a_ORF2_HE1, pEL5a_ORF3S_HE1, pEL5a_ORF2_HE3, pEL5a_ORF3_HE3 со вставками фрагментов, кодирующих фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 генотипа (pEL5a_ORF2_HE1 и pEL5a_ORF3S_HE) и 3 генотипа (pEL5a_ORF2_HE3, pEL5a_ORF3_HE3);

- общие сведения о клонированном фрагменте:

кДНК-фрагмент гена orf2 ВГЕ 1 генотипа размером 0,753 т.п.о., кодирующий С-концевой фрагмент капсидного белка ВГЕ;

кДНК-фрагмент гена orf2 ВГЕ 3 генотипа размером 0,774 т.п.о., кодирующий С-концевой фрагмент капсидного белка ВГЕ;

кДНК-фрагмент гена orf3 ВГЕ 3 генотипа размером 0,349 т.п.о., кодирующий полноразмерный белок ORF3 ВГЕ;

кДНК-фрагмент гена orf3 ВГЕ 1 генотипа размером 0,153 т.п.о., кодирующий С-концевой фрагмент капсидного белка ВГЕ.

Изучены его культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма-продуцента.

Таким образом, получены рекомбинантная экспрессирующая плазмида pEL5cSHE и и штамм PLT90_ORF2/3_ВГЕ1/3 для экспрессии в бактериальной системе мозаичного полипептида, содержащего С-концевые фрагменты белков ORF2 ВГЕ 1 и 3 генотипов (405-660 а.о.), полноразмерную копию белка ORF3 ВГЕ 3 генотипов (1-113 а.о.), и С-концевой фрагмент белка ORF3 ВГЕ 1 генотипа (62-113 а.о.), в виде слитного с укороченным фрагментом β-галактозидазы E.coli полипептида.

Получение мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_HEV1/3 и иммунореагентгов на его основе

Из данных, приведенных в литературе [Costa, S.Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: The novel Fh8 system. /A.Almeida, A.Castro, L.Domingues// Front.Microbiol.–2014-V. 5, №63.-doi:10.3389/fmicb.2014.00063.], следует, что не существует единых методик выделения и очистки для всех белков. В каждом конкретном случае данный процесс имеет относительную автономность, поскольку конформация любой молекулы белка зависит от его первичной структурой и конкретных физико-химических условий (температуры, кислотности среды, состава растворителя, присутствия детергентов и других факторов).

Мозаичный рекомбинантный белок ВГЕ в клетках E.coli упакован в тельца включения. Его изоэлектрическая точка составляет 5,44, поэтому для выделения и отмывании телец включений использовали буферные растворы с рН 8,0. Процессы проводились в основном при температуре +4-8°С.

40 г биомассы штамма E.сoli PLT90_ORF1/2-ВГЕ1/3, хранившейся при минус 80°С, размораживали медленно на ледяной бане, затем энергично разбивали с помощью гомогенизатора-блендера в буфере, содержащем 50 мМТрис НС1 рН 8,0, 1.7мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl. Далее добавляли раствор лизоцима до концентрации 0,2 мг/мл, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 1 мМ ТСЕР НС1. Суспензию перемешивали, выдерживали 30 минут и подвергали дезинтеграции методом механического лизиса, трижды продавливая полученный гомогенат при давлении 500 бар через гомогенизатор RANNIEMini-Lab 8.30H (Дания). Полученный грубый лизат клеток центрифугировали при 10 тыс об/мин в течение 30 мин в центрифуге Beckman J2-21 и отделяли осадок, содержащий тельца включения. Супернатант контролировали с помощью электрофореза в ПААГ на предмет потерь целевого белка, осадок телец включения взвешивали и трижды отмывали. Полученный осадок телец включения, содержащий мозаичный полипептид ВГЕ, трижды отмывали с применением детергентов с последующим центрифугированием при 4°С в течение 30 мин при 10 тыс об/мин, отделением супернатанта, ресуспендированием осадка в буфере Трис-HCl pH 8.0, содержащем 4 мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl. Для первой отмывки в качестве детергента использовали Тритон Х-100. Дальнейшие отмывки телец включения от ДНК и клеточных белков производили в течение нескольких суток с добавками ионного детергента дезоксихолата натрия в концентрации 0,5%, а затем н-октил-β-Dглюкопиранозида в концентрации 0,1%. Использованный подход позволил избирательно выводить из телец включения примеси без потерь целевого продукта. Для предотвращения процессов окисления и образования дисульфидных связей при выделении белков добавляли 0,1%. β-меркаптоэтанола в концентрации и 1 мМ Трис(2-карбоксиэтил)фосфина. Процесс очистки телец включения контролировал на каждой стадии с помощью электрофореза проб осадка и супернатанта в 10% SDS-полиакридамидном геле (SDS-ПААГ). С каждой отмывкой масса телец включения уменьшалась с 37% по отношению к исходной биомассе до 30%, 23% и 12%, соответственно.

На Фиг.9 показано изменение массы осадка телец включения рекомбинантного мозаичного белка ORF2/3-ВГЕ 1/3 в процессе отмывок (0 - исходная биомасса; 1 - нерастворимая фаза после дезинтеграции клеток; 2 - первая отмывка; 3 - вторая отмывка; 4 - третья отмывка). На представленном графике видно, что по мере отмывок на кривой появляется горизонтальный участок, свидетельствующий о постоянной массе осадка телец включения вследствие освобождения препарата от посторонних примесей.

На Фиг.10 приведены результаты отмывки телец включения по стадиям - электрофорез в SDS-ПААГ выделения мозаичного полипептида ORF2/3-ВГЕ 1/3 из биомассы E.coli (1 - биомасса; 2 - растворимая часть лизата; 3 - осадок телец включения; 4 - супернатант после первой отмывки; 5 - осадок после первой отмывки; 6 - супернатант после второй отмывки; 7 - осадок после второй отмывки; 8 - супернатант после третьей отмывки; 9 - осадок после третьей отмывки; 10 – маркеры молекулярный масс (BioRad, США).

Осадок телец включения, содержащий целевой белок, переводили в растворенное состояние и проводили дальнейшую его очистку с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке, заполненной сорбентом Toyopearl HW-65С («ToyoSodaCorp.», Япония), таким образом разделяя по молекулярной массе мозаичный полипептид и оставшиеся в осадке примесные белки. Осадок телец включения ресуспендировали растворе, содержащем 6 М мочевины, 40 мМ Трис-HCl, рН 9,0, 20 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, нагревали до 50°С, перемешивая на магнитной мешалке до полного растворения, затем диализовали против того же буфера в течение часа при комнатной температуре. Раствор центрифугировали при 4°С в течение 10 мин при 16000g, фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. На всех стадиях хроматографического разделения была использована система NGC фирмы Био-Рад (США) с программным обеспечением ChromLabSoftwareVersion 5.0 (Фиг.11).

Концентрацию белков во фракциях оценивали по методу Варбурга и Кристиансена [Скоупс Р. Методы очиски белков: Пер. с англ. – М.: Мир, 1985. – 358 с.] с помощью спектрофотометра Genesys 10SUV-Vis фирмы «ThermoFisherScientific» (США), среднюю концентрацию белка во фракциях рассчитывали с помощью программы ChromLabSoftwareVersion 5.0. Присутствие остаточных количеств клеточных протеинов оценивали по результатам электрофореза фракцияй в 10 % SDS-PAGE на приборе Mini-ProteanTetraCellSystem фирмы «BioRad» (США). Результаты электрофореза полученных фракций мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ_1/3 представлены на Фиг.12 (Дорожка-фракция: 1-15; 2-17; 3-19; 4-21; 5-23; 6-25; 7-27; 8-29; 9-30; 10-31; 11-32; 12-33; 13-34; 14-35; 15-37; 16-39; 17-41; 18-43).

Для оценки антигенной активности фракций белка был выбран метод ИФА в непрямом формате. На поверхность лунок иммунологического планшета сорбировали разведения фракций, полученных после хроматографической очистки белка: в каждую лунку вносили по 100 мкл разведений с концентрацией 5 мкг/мл в КББ рН 9,5 (КББ). Планшеты выдерживали сутки при температуре +4°С, после промывки в каждую лунку добавляли 10-кратное разведение пула сывороток больных вирусным гепатитом Е (К⁺) и пул сывороток здоровых доноров (К^-) в фосфатно-солевом буфере с 1% Tween20 рН7,4 (ФСБ-Т), инкубировали 30 минут при 37°С, а затем несколько раз промывали ФСБ-Т. После промывок во все лунки добавляли конъюгат моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой хрена, планшет выдерживали 30 минут при 37^оС, а затем трижды промывали и в каждую лунку вносили по 100 мкл хромогена - тетраметилбензидина в субстратном буфере, содержащем пероксид водорода (АО БТК «Биосервис», Россия). Планшет 15 минут инкубировали в темноте, в каждую лунку добавляли по 50 мкл 0,5 М раствора серной кислоты и оценивали конечный результат, измеряя оптическую плотность во всех лунках планшета при 450 нм.

На Фиг.13 показаны результаты тестирования фракций мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3-ВГЕ1/3 методом ИФА 1-1фракция (фрак); 2-3 фрак.; 3-5 фрак.; 4-7 фрак.; 5-9 фрак.; 6-11 фрак.; 7-13фрак.; 8-15фрак.; 9-17 фрак.; 10-18 фрак.; 11-20 фрак.; К⁺ - пул сывороток крови больных ГE, К^– - пул сывороток крови здоровых доноров.

На основании результатов электрофореза и данных ИФА объединяли фракции, выбрав лучшие по показателям двух методов, фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры и концентрировали в ячейках для ультрафильтрации Amicon Ultra-15Ultracel 100 k с пределом исключения 100 кД до оптической плотности 1 о.е./мл при длине волны 280 нм.

На Фиг.14 показаны результаты электрофореза в SDS-ПААГ(А) и иммуноблоттинга (Б) рекомбинантных полипептидов ВГЕ: 1 - ORF2/3_ВГЕ 1/3; 2 - ORF2 1 генотипа; 3 - М (140, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15); 4 - ORF2 3 генотипа; 5 - ORF 1 генотипа; ORF3 3 генотипа. Из них видно, что новый рекомбинантный мозаичный полипептид показывает высокую реакционную способность с сывороткой, содержащей антитела к ВГЕ, что свидетельствует о доступности всех четырех составляющих антигенных участков мозаичного рекомбинантного белка ORF2/3_ВГЕ1/3 для взаимодействия со специфическими антителами.

Таким образом, разработана технология получения мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 в препаративных количествах из биомассы бактерий E.coli. Она состояла из стадий разрушения клеток и выделения телец включения, нескольких стадий отмывок телец включения в условиях, обеспечивающих максимальное освобождение их из клеточного лизата. Также был проведена очистка рекомбинантного полипептида методом эксклюзионной хроматографии, в результате которой был получен целевой продукт со степенью чистоты более 95% по данным электрофореза. Молекулярная масса выделенного мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3, оцененная с помощью электрофореза хорошо согласуется с теоретически рассчитанной. Фракции очищенного рекомбинантного белка показали высокую антигенную реактивность в ИФА с сыворотками крови людей больных ВГЕ и высокую специфичность в реакциях с сыворотками здоровых доноров, что позволило сделать заключение о хороших перспективах для его использования в целях диагностики. Выход полученного в результате выделения и очистки мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 составил 85 мг, то есть примерно 2,12 мг/г взятой в эксперимент биомассы. Концентрация полученного белка составила 1,11 мг/мл.

Оценка антигенных свойств рекомбинантного полипептида ORF2/3-ВГЕ1/3 методами ИФА в реакциях с международным стандартным образцом ВОЗ «Anti-Hepatitis E Serum, Human» 95/584 NIBSC

Для оценки аналитической чувствительности и иммунореактивности полученного рекомбинантного полипептида проведено сравнительное титрование ВОЗ-стандарта 95/584 в «непрямом» ИФА с использованием мозаичного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 и белка ORF2(3) в качестве антигенов, сорбированных в лунках планшет для ИФА.

Полученные кривые титрования ВОЗ-стандарта 95/584 представлены на Фиг.15, где показано титрование ВОЗ-стандарта 95/584 NIBSC с полипептидом ORF2/3-ВГЕ1/3 и рекомбинантным антигеном ORF2(3) для оценки их взаимодействия с эталонными специфическими антителами к ВГЕ. Анализ кривых титрования показал, что график взаимодействия белка ORF2(3) имеет нелинейный вид, при этом его конечный участок выходит на «плато», что существенно затруднят определение высоких концентраций ВОЗ-стандарта (от 15 МЕ/мл и выше). Кривая титрования ВОЗ-стандарта на мозаичном полипептиде ORF2/3_ВГЕ1/3, несмотря на более низкую кривизну, по своей форме приближается к линейной, что позволяет более точно определять оптическую плотность всего диапазона исследуемых концентраций ВОЗ-стандарта.

Оценка антигенных свойств полученного полипептида с применением ВОЗ-стандарт 95/584 показал, что для данного белка характерны высокая чувствительность и иммунореактивность. На основании этого, можно заключить, что полипептид ORF2/3_ВГЕ1/3 является перспективным препаратом для разработки иммунохимических методов диагностики ВГЕ.

Изучение антигенных свойств рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 методом ИФА с сыворотками крови от серогенативных и серопозитивных лиц

Чувствительность и специфичность полученного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 в сравнении с отдельными рекомбинантными белками оценивали путем тестирования в ИФА серопозитивных по специфическим IgG-антителам к ВГЕ (n=30) и серонегативных образцов сывороток (n=30), предварительно охарактеризованных в референтных тест-системах. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты исследования чувствительности и специфичности мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3-ВГЕ1/3

№ п/п	№ образца сыворотки	Используемый в ИФА рекомбинантный белок:
		ORF2/3_ВГЕ1/3	ORF2(1)	ORF2(3)	OFR3(3)
		ОПкрит.=0,205	ОПкрит.=0,146	ОПкрит.=0,168	ОПкрит.=0,12
	3	0,262	0,167	0,223	0,171
	186	1,820	0,898	1,400	0,049
	238	0,887	0,423	0,584	0,072
	303	1,767	0,713	0,939	0,155
	316	3,448	2,370	3,267	0,079
	405	2,137	0,929	1,129	0,054
	421	0,218	0,177	0,203	0,038
	431	2,023	1,150	1,503	0,038
	462	0,575	0,262	0,445	0,044
1.	465	1,408	0,934	1,301	0,050
2.	465	1,310	0,902	1,104	0,044
3.	659	0,216	0,173	0,168	0,124
4.	660	0,274	0,270	0,194	0,081
5.	749	0,365	0,160	0,084	0,041
6.	924	0,698	0,510	0,648	0,068
7.	1243	1,270	0,482	0,819	0,032
8.	1468	2,415	1,221	1,861	0,078
9.	1584	1,851	0,933	1,536	0,037
10.	1725	1,339	0,571	0,838	0,053
11.	2354	0,280	0,160	0,165	0,116
12.	2411	2,112	1,261	1,798	0,021
13.	2496	0,556	0,421	0,326	0,011
14.	2519	0,442	0,135	0,231	0,139
15.	2642	1,564	0,760	1,251	0,086
16.	2729	0,540	0,286	0,430	0,049
17.	2847	0,303	0,105	0,150	0,091
18.	2850	0,863	0,273	0,234	0,077
19.	3128	1,193	0,472	0,954	0,091
20.	3192	2,012	1,116	1,740	0,047
21.	3229	3,315	2,309	3,172	0,083
		Серонегативные сыворотки
	1	0,098	0,069	0,125	0,067
	2	0,053	0,050	0,076	0,022
	4	0,145	0,048	0,072	-0,010
	5	0,094	0,032	0,085	0,046
	226	0,054	0,036	0,057	0,023
	228	0,062	0,010	0,046	0,018
	229	0,041	0,059	0,052	-0,006
	232	0,053	0,017	0,017	-0,025
	297	0,073	0,067	0,074	0,038
	300	0,035	0,079	0,062	0,027
1.	359	0,063	0,069	0,113	0,068
2.	439	0,112	0,087	0,102	0,045
3.	444	0,065	0,060	0,079	0,028
4.	446	0,064	0,087	0,089	0,041
5.	460	0,002	0,040	0,058	0,009
6.	463	0,069	0,046	0,073	0,039
7.	464	0,087	0,038	0,081	0,036
8.	467	0,072	0,058	0,097	0,032
9.	468	0,082	0,042	0,062	0,025
10.	468	0,100	0,057	0,086	0,039
11.	469	0,080	0,037	0,055	0,009
12.	470	0,095	0,040	0,090	0,048
13.	471	0,098	0,085	0,063	0,055
14.	622	0,081	0,063	0,088	0,034
15.	687	0,123	0,076	0,066	0,016
16.	739	0,066	0,010	0,057	-0,013
17.	768	0,027	0,043	0,038	0,005
18.	772	0,104	0,084	0,075	0,023
19.	830	0,065	0,050	0,107	0,035
20.	860	0,130	0,101	0,143	0,059

Все протестированные рекомбинантные белки продемонстрировали 100% чувствительность и 100% специфичность на использованных в исследованиях панелях положительных и отрицательных сывороток. Подтверждена специфическая иммунореактивность мозаичного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3: с ним взаимодействовали все серопозитивные образцы сывороток крови с разной степенью связывания (см. таблицу 1). При взаимодействии с отдельными рекомбинантными белками исследуемые серопозитивные образцы показали гетерогенную иммунореактивность. Так, с белком ORF2 ВГЕ 1 генотипа связалось 28 сывороток из 30 исследуемых, с белком ORF2 3 генотипа – 26 из 30, с белком OFR3 3 генотипа – 3 из 30. Необходимо отметить, что все сыворотки, не связавшиеся с отдельными белками, взаимодействовали с полипептидом ORF2/3_ВГЕ1/3.

Полученные данные показали, что по антигенной активности полученный нами полипептид ORF2/3_ВГЕ1/3 по своей чувствительности превосходит отдельные рекомбинантные белки ВГЕ, что можно объяснить более эффективным моделированием эпитопов или аддитивным эффектом «сборки» вирусоспецифических последовательностей ранее полученных белков в одну структуру. Это служит дополнительным подтверждением того, что применение полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 для целей диагностики ВГЕ методом ИФА предпочтительнее в силу его оптимальных антигенных характеристик, по сравнению с отдельными белками ВГЕ.

Получение иммунореагентов на основе мозаичного рекомбинантного белка ORF2/3_ВГЕ1/3

Получение конъюгата мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 с пероксидазой хрена

Одним из направлений применения мозаичного белка является получение на его основе иммунометрического конъюгата, что открывает широкие возможности для его применения в ИФА различных форматов, в частности, позволяет использовать один меченый белок вместо четырех в тест-системах для определения суммарных антител в методе сэндвич-ИФА с двойным антигеном или для определения антител различных классов методом ИФА в «ловушечном» формате.

Для получения конъюгата рекомбинантного полипептида с пероксидазой хрена провели реакцию окисления полисахаридных цепей пероксидазы периодатом натрия с образованием активных альдегидных групп, способных взаимодействовать с аминогруппами белков и иммуноглобулинов с образованием оснований Шиффа, восстановление которых приводит к образованию конъюгатов [Nakane, P.K. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation / P.K. Nakane, A. Kawaoi // J. Histochem.Cytochem. – 1974. – V.22. – N.12. – P.1084 – 1091]. С учетом физико-химических свойств антигена были подобраны условия, исключающие необратимое изменение конформации белковых молекул и/или потерю ферментом своей активности.

Рекомбинантный мозаичный белок переводили в КББ с помощью гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-25. Навеску пероксидазы растворяли в деионизированной воде и добавляли соотвествующий объем водного 0,1 М раствора периодата натрия. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Признаком образования активной формы пероксидазы служило изменение окраски раствора фермента с желто-коричневой на зеленую. Далее пероксидазу переводили в буфер сшивки (1мМ ацетат натрия рН 4,4) методом гель-фильтрации. Активированную пероксидазу хрена добавляли к рекомбинантному мозаичному белку и проводили синтез в течение 2-х часов при комнатной температуре в темноте при перемешивании. Массовое соотношение количества белка к количеству пероксидазы составляло 3:1. Далее добавляли раствор боргидрида натрия, реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. Освобождение конъюгата от избытка компонентов реакции осуществляли методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-200, собирая фракции, относящиеся к первому пику. Фракции объединяли, раствор конъюгата переводили в ФСБ, добавляли 0,05% ProClean и хранили при 4°С. Проверка стабильности конъюгата, проведенная по методике ускоренного старения, показала, что после трех недель хранения в термостате его активность сохранилась более чем на 80%, что соответствует критериям сохранности свойств иммунореагентов в течение года при температуре 4°С.

Таким образом получен конъюгат полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 с пероксидазой хрена с рабочим разведением 1/16000.

Получение гипериммунных сывороток кроликов к мозаичному рекомбинантному полипептиду

Получение кроличьих сывороток к рекомбинантному мозаичному полипептиду имеет большое практическое значение не только для использования в тест-системах, предназначенных для диагностики ГЕ у человека, но и для применения в ветеринарной практике, поскольку в последнее время обнаружено повышение выявляемости ВГЕ у животных, в том числе кроликов. В литературе имеются сведения об иммунизации кроликов рекомбинантными белками ВГЕ, содержащими короткие С-концевые фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ [Ghabrah, T.M. Comparison of tests for antibody to hepatitis E virus / T.M. Ghabrah, S. Tsarev, P.O. Yarbough, S.U. Emerson, G.T. Strickland, R.H. Purcell // J. Med. Virol. – 1998. –V.55. – N2. – P.134 – 137].

Для иммунизации кроликов рекомбинантный мозаичный полипептид ORF2/3-ВГЕ1/3 переводили с помощью колонок PD-10 в ФСБ рН 7.4. Кроликам-самцам породы «Шиншилла» массой 2,5 - 3,0 кг вводили по 0,1 мл эмульсии, состоящей из смеси полного адъюванта Фрейнда и 0,6 мг/мл рекомбинантного антигена ORF2/3_ВГЕ1/3 в ФСБ в соотношении 1:1 в подколенные лимфатические узлы задних конечностей и подкожно в область шеи. На 14-е, 17-е и 20-е сутки после первой иммунизации раствор антигена без адъюванта вводили подкожно в каждую конечность. Дозы повторных иммунизаций составляли соответственно 0,33 мг; 0,67 мг и 1мг на 1 кг веса животного. Для контроля динамики иммунного ответа производили забор крови у каждого кролика перед введением ему рекомбинантного белка и проверку титра антител в этих образцах методом ИФА. Через 8 недель проводили повторную иммунизацию путем подкожного введения в каждую конечность по 5 мкг антигена c неполным адъювантом Фрейнда. Подкожные инъекции антигена в физиологическом растворе повторяли с недельным интервалом, контролируя нарастание титра антител с помощью ИФА. Забор крови осуществляли через 1 неделю после последней иммунизации.

Выделение и очистка поликлональных антител из сыворотки крови иммунизированных кроликов

Гамма-глобулиновую фракцию сывороток крови иммунизированных и неиммунизированных кроликов осаждали насыщенным раствором сульфатом аммония, сформированный осадок осаждали центрифугированием и растворяли в 50 мМ ФСБ. Далее раствор переводили в 25 мМ ФСБ. Полученные антитела отделяли от примесей сывороточных белков методом аффинной хроматографии на колонке Белок G-сефароза. Наличие белка во фракциях оценивали спектрофотометрически, измеряя оптическое поглощение при длине волны 280 нм. Результаты электрофореза фракций поликлональных антител кроликов, иммунизированных рекомбинантным мозаичным полипептидом ORF2/3-ВГЕ1/3 представлены на Фиг.16 (1 - наносимая фракция антител; 2, 3, 4 - фракции после хроматографической очистки). Методом ИФА оценивали фракции по иммунореактивности полученных антител. Лучшие по этим трем показателям фракции объединяли.

Кроличьи поликлональные антитела, полученные нами к рекомбинантному мозаичноиу полипептиду ORF2/3_ВГЕ1/3, показали высокий титр (1:250000) при тестировании их в ИФА, а также высокую степень очистки (более 95%), что свидетельствует об их пригодности для применения в диагностических тест-системах.

Получение конъюгата кроличьих поликлональных антител к мозаичному рекомбинантном к полипептиду с пероксидазой хрена

Получение конъюгатов поликлональных антител е рекомбинантным белкам ВГЕ с пероксидазой хрена создает возможность разработки тестов для выявления не только антител к ВГЕ, но и вирусного антигена.

Синтез конъюгата осуществлялли с помощью описанных в литературе методов [Nakane, P.K. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation / P.K. Nakane, A. Kawaoi // J. Histochem.Cytochem. – 1974. – V.22. – N.12. – P.1084 – 1091.; Zhang, K. Synthetic rabbit-human antibody conjugate as a control in immunoassays for immunoglobulin M specific to hepatitis E virus / K. Zhang, L. Wang, M. Liu, R. Zhang, J. Li // Virology Journal. – 2010. – V.7. – P.101 – 105].

Для получения конъюгата с пероксидазой хрена раствор кроличьих поликлональных антител антитела перводили в КББ. Навеску пероксидазы растворяли в воде. Затем в этот раствор вносили 0,1 М раствор периодата натрия и инкубировали при комнатной температуре в течение получаса и диализовали против 1 мМ ацетатного буфера рН 4,4. В раствор полипептида в КББ вносили активированную пероксидазу и перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем проводили восстановление непрореагировавших групп путем внесения в реакционную смесь раствора боргидрида натрия и инкубации в течение 2 часов. Избыток непрореагировавших компонентов реакции отделали от конъюгата путем гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-200, собирая фракции, относящиеся к первому пику.

Получение конъюгата белка ORF2/3_ВГЕ1/3 с наночастицами коллоидного золота

Коллоидное золота (КЗ) получали цитратным методом [Frens G. // Nat. Phys. Sci. 1973. V. 241. № 105. P. 20–22]. К 97,5 мл деионизированной воды добавляли 1.0 мл 1%-ного раствора золотохлористоводородной кислоты, доводили до кипения и при перемешивании добавляли 1,5 мл 1%-ного раствора цитрата натрия. Смесь кипятили 25 мин, затем охлаждали и хранили при температуре от +4 до +6°С.

Предварительную оценку связывания белка ORF2/3_ВГЕ1/3 с КЗ проводили по ранее предложенной методике [Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. Amsterdam: Acad. Press, Elsevier – 2008 – 900 p.]. С этой целью к 0,1 мл раствора белка ORF2/3_ВГЕ1/3 (с концентрацией от 5 до 250 мкг/мл) добавляли по 1,0 мл раствора КЗ (А₅₂₀ = 1,0), смесь перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 0.1 мл 10%-ного хлорида натрия, перемешивали и через 10 мин измеряли А₅₈₀. Зависимость А₅₈₀ от концентрации белка ORF2/3_ВГЕ1/3 (флоккуляционная кривая) отражала агрегацию получаемого конъюгата при высокой ионной силе раствора. Концентрацию белка ORF2/3_ВГЕ1/3 определяли как величину, на 10–15% превосходящую точку выхода А₅₈₀ на плато в соотвествие с рекомендациями [Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. Amsterdam: Acad. Press, Elsevier – 2008 – 900 p.]. Перед конъюгацией с КЗ раствор рекомбинантного белка диализовали в течение 2 ч при темпепратуре +4°C против 1000-кратного объема буфера, содержащего 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 9,0. К раствору КЗ (А₅₂₀ = 1,0) добавляли 0,1 М карбонат калия до достижения рН 9.0 и вносили КЗ в раствор белка выбранной концентрации. Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре и перемешивании, после чего вносили водный раствор БСА до конечной концентрации 0,25%. Частицы КЗ с иммобилизованным на них антигеном отделяли от непровзаимодействовавших молекул белка центрифугированием при 8000 g в течение 30 мин. После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl буфере, рН 9.0, содержащем 0,25% БСА, 0.05 % Твина 20 и 0,05% азида натрия. Препараты конъюгатов хранили при температуре от +4°С до +6°С.

Изготовление иммунохроматографических тест-полосок

Нанесение реагентов на мембраны, входящих в состав тест-полоски, проводили с использованием автоматического диспенсера IsoFlow (Индия). Конъюгаты КЗ с белком ORF2/3_ВГЕ1/3 (Б–КЗ) наносили на стекловолоконную мембрану в разведении, соответствующем А₅₂₀ = 6,0 (16 мкл на 1 см ширины стекловолоконной мембраны). Для формирования аналитической зоны использовали моноклональные антитела мыши к IgG человека в концентрации 0,5 мг/мл в 50 мМ ФСБ, содержащем 0.05 % БСА и 0.1 % азида натрия, контрольной зоны – кроличьи антитела к белку ORF2/3_ВГЕ1/3 в концентрации 0,5 мг/мл в таком же растворе. На 1 см ширины рабочей мембраны наносили по 2,0 мкл растворов. Полученные стекловолоконные и рабочие мембраны сушили на воздухе при 20–22°C не менее 20 ч. Из мембраны для нанесения пробы и адсорбирующей мембраны собирали мультимембранный композит и получали из него тест-полоски шириной 3.5 мм, используя прибор для ручной ламинации бумажных поверхностей и автоматический гильотинный резак. Эти тест-полоски герметично упаковывали с силикагелем в качестве осушителя в пакеты из ламинированной алюминиевой фольги. Упакованные тест-полоски хранили при комнатной температуре.

Изучение возможности использования рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 в иммуноферментном анализе различных форматов

Пригодность полученного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 для использования в иммуноферментном анализе (ИФА) оценивали путем проведения сравнительно ИФА с использованием полученных ранее рекомбинантных антигенов – ORF2(1), ORF2(3) и ORF3(3), и поликлональных кроличьих антител, полученных к этим антигенам:

- α1.9.11.15, полученные к рекомбинантному белку ORF2(1);

- α1.63.06.18, полученные к рекомбинантному белку ORF2(3);

- α1.84.01.18, полученные к рекомбинантному белку ORF3(3);

- α1.54.11.19, полученные к рекомбинантному полипептиду ORF2/3_ВГЕ1/3.

В качестве антител для сравнения использовали поликлональные кроличьи антитела к рекомбинантному антигену р120 ВИЧ-1 из коллекции ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.

Результаты нескольких серий ИФА в непрямом формате приведены на Фиг.17 - 19.

На Фиг.17 показано титрование антител α1.9.11.15 для оценки их взаимодействия с полипептидом ORF2/3_ВГЕ1/3 в сравнении с антигеном OFR2(1), против которого они получены.

На Фиг.18 показано титрование антител α1.63.06.18 для оценки их взаимодействия с полипептидом ORF2/3_ВГЕ1/3 в сравнении с антигеном OFR2(3), против которого они получены.

На Фиг.19 показано титрование антител α1.84.01.18 для оценки их взаимодействия с полипептидом ORF2/3_ВГЕ1/3 в сравнении с антигеном OFR2(3), против которого они получены.

Кривые титрования показали, что полипептид ORF2/3_ВГЕ1/3 обладает способностью связывать специфические антитела против отдельных рекомбинантных белков ВГЕ 1 и 3 генотипов.

Полученные результаты показали, что рекомбинантный полипептид ORF2/3-ВГЕ1/3 обладает способностью пассивно связываться с поверхностью лунок планшета для ИФА без нарушения способности взаимодействовать со специфическими антителами, а также продемонстрировали возможность использования пероксидазных конъюгатов на его основе ИФА в иммунометрическом формате, а, следовательно, также в «сэндвич»-ИФА с двойным антигеном и ИФА в формате «захвата».

Таким образом, проведенные исследования подтвердили пригодность полученного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 для использования в различных форматах твердофазного ИФА.

Изучение возможности использования мозаичного рекомбинантного полипептида в иммунохроматографическом анализе

Проведена оценка пригодности полученного мозаичного рекомбинантный полипептид ORF2/3_ВГЕ1/3 к использованию в иммунохроматографическом анализе.

Для проверки работоспособности полученных тест-полосок была проведена серия экспериментов по тестированию серопозитивных и серонегативных образцов сывороток, предварительно исследованных в ИФА. Полученные результаты представлены на Фиг.20, где показаны результаты тестирования полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3 на пригодность к использованию в иммунохроматографическом анализе.

Анализ полученных результатов показывает, что полученный мозаичный рекомбинантный полипептид ORF2/3_ВГЕ1/3 можно использовать в качестве антигена при разработке иммунохроматографических тест-систем для диагностики ГЕ.

Таким образом, в результате проведенных исследований получен экспериментальный образец мозаичного рекомбинантного полипептида ORF2/3_ВГЕ1/3, содержащего аминокислотные последовательности белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов, отработаны методы его выделения и очистки с постадийным контролем содержания и качества целевого продукта методами электрофореза в SDS–ПААГ, Вестерн-блоттинга и ИФА. Рекомбинантный полипептид ORF2/3_ВГЕ1/3 выделен в препаративных количествах, исследованы его физико-химические свойства, отработаны условия получения иммунореагентов на его основе: поликлональных кроличьих антител к белку ORF2/3_ВГЕ1/3, конъюгатов мозаичного рекомбинантного полипептида и поликлональных антител к нему с пероксидазой хрена, конъюгата белка с наночастицами коллоидного золота. Изучена возможность использования белка и иммунореагентов, полученных на его основе в иммунохимических реакциях: иммуноферментном анализе различных форматов и иммунохроматографическм анализе.

Для продуцента мозаичного рекомбинантного полипептида авторами была разработана методика получения биомассы штамма E.coli, которая не является предметом охраны настоящего изобретения, поэтому в материалх заявки не раскрыта.

Пример 1

Применение заявленного белка в тест-системах для серодиагностики гепатита Е (ГЕ) было апробировано путем получения экспериментального образца тест-системы (набора реагентов) «Скрин-ВГЕ-IgG» для качественного выявления IgG-антител к вирусу гепатита Е (ВГЕ) и/или определения концентрации IgG-антител к ВГЕ в сыворотке/плазме крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА) в «непрямом» формате и его лабораторных испытаний.

Экспериментальный образец тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG» предназначен для качественного и/или количественного определения специфических IgG -антител к ВГЕ в сыворотке или плазме крови человека методом ИФА в «непрямом» формате. В тест-системе используется мозаичный рекомбинантный белок ORF2/3_ВГЕ1/3, содержащий диагностически значимые эпитопы антигенов ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов, что гарантирует ее высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость. Применение мозаичного белка, содержащего эпитопы антигенов разных генотипов ВГЕ (генотип 1 и генотип 3), обеспечивает эффективность применения тест-системы для анализа образцов, как из высокоэндемичных, так и из низкоэндемичных регионов с высоким процентом автохтонных случаев ГЕ. В выбранном формате ИФА мозаичный рекомбинантный антиген ORF2/3_ВГЕ1/3 адсорбируют на поверхности лунок планшета для ИФА. Чувствительность и специфичность тестов, основанных на применении данного белка, должна превосходить эти показатели при использовании отдельных белков ВГЕ или более коротких их фрагментов за счет взаимодействия антител с антигенной основой, содержащей большее количество эпитопов белков эпидемиологически актуальных штаммов ВГЕ, циркулирующих на территории России и сопредельных государств.

Принцип метода

Состав тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG»:

- Планшет с адсорбированным мозаичным рекомбинантным белком ORF2/3_ВГЕ1/3 (ИС) – формованное разборное полистироловые изделие, состоящее из двенадцати восьмилуночных стрипов, закрепленных на рамке (всего 96 лунок), на внутренней поверхности лунок которого пассивно иммобилизован мозаичный рекомбинантный белок ORF2/3_ВГЕ1/3.

- Калибровочные пробы (КП№1 – КП №4) – прозрачные или слегка опалесцирующие жидкости розового цвета, приготовленные на основе конъюгата поликлональных кроличьих антител к мозаичному рекомбинантному белку ORF2/3_ВГЕ1/3 с человеческими иммуноглобулинами класса G и стандартизированные по международному Стандарту ВОЗ «Антитела к вирусу гепатита Е, сыворотка крови человека», NIBSC code: 95/584 (Англия).

- Положительная контрольная проба/ положительный контрольный образец (К ⁺ ) – жидкость, окрашенная в красный цвет, приготовлена на основе пула инактивированных сывороток крови человека с определенным содержанием IgG - антител к ВГЕ (концентрация в МЕ/мл указана на этикетке флакона). Используется для оценки правильности проведения качественного и количественного анализов.

- Отрицательная контрольная проба (0 МЕ/мл) / отрицательный контрольный образец (К ^– ) – жидкость, окрашенная в синий цвет, приготовлена на основе пула инактивированных сывороток крови человека, не содержащих IgG-антител к ВГЕ. Используется: при качественном анализе для оценки правильности проведения анализа и расчета ОП критического (ОП_крит); при количественном анализе как «нулевая» проба (0 МЕ/мл), не содержащая IgG-антител к ВГЕ, при построении калибровочного графика.

- Конъюгат моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой (КК) – детектирующий реагент, который представляет собой бифункциональное соединение, полученное путем химического синтеза из моноклональных антител мыши к IgG человека и пероксидазы хрена. Данный компонент содержит добавки, создающие и поддерживающие оптимальные условия для хранения конъюгата и протекания иммунохимической реакции в лунках планшета.

- Раствор для разведения образцов сыворотки/плазмы (РРС) – буферный раствор, содержащий специально подобранные смеси солей, детергентов и консервантов и обеспечивающий оптимальные условия для связывания специфических антител в составе исследуемых образцов сыворотки/плазмы крови.

- Раствор для разведения конъюгата (РРК) - буферный раствор, содержащий специально подобранные смеси солей, детергентов и консервантов и обеспечивающий оптимальные условия для связывания пероксидазного конъюгата моноклональных антител к IgG человека со специфическими антителами во время второй стадии анализа.

- Концентрат промывочного раствора (ПР×25) – специально подобранная смесь солей, детергентов и консервантов, обеспечивающая эффективное удаление непрореагировавших компонентов.

- Раствор хромогена (ТМБ) содержит 3,3’,5,5’- тетраметилбензидин – вещество, окисление которого пероксидазой дает окрашенный продукт.

- Раствор для разведения хромогена (РРХ) – источник пероксида водорода, который служит окислителем ТМБ.

- Стоп-реагент представляет собой 0,5 М раствор серной кислоты и предназначен для остановки ферментативной реакции.

На первой стадии анализа контрольные образцы и/или калибровочные пробы, а также исследуемые образцы, инкубируют с адсорбированным на поверхности лунок планшета для ИФА мозаичным рекомбинантным белком ORF2/3_ВГЕ1/3, содержащим диагностически значимые эпитопы антигенов ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов. Содержащиеся в них IgG-антитела связываются с рекомбинантным антигеном поверхности лунки, образуя комплекс «антиген – антитело». На второй стадии анализа образовавшиеся комплексы выявляют с помощью конъюгата моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой хрена. После удаления с помощью промывания не связавшихся компонентов реакции в лунки добавляют раствор хромогена, содержащий 3,3’,5,5’- тетраметилбензидин (ТМБ). В результате ферментативной реакции происходит окрашивание раствора в лунках, при этом интенсивность окрашивания прямо пропорциональна содержанию IgG-антител к ВГЕ в исследуемом образце. По окончании инкубации реакцию останавливают раствором «Стоп-реагент» и интенсивность окрашивания раствора измеряют на спектрофотометре по оптическому поглощению при длине волны 450 нм (длина волны сравнения 620-650 нм). Строят график зависимости оптической плотности от концентрации антител в калибровочных пробах. По калибровочному графику рассчитывают концентрации IgG-антител к ВГЕ в контрольных образцах и анализируемых пробах.

Этапы разработки тест-системы

1. Разработка стандартной лабораторной панели сывороток (СЛПС), состоящей из сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к ВГЕ, для контроля тест-системы для качественного выявления IgG-антител к ВГЕ и определения концентрации IgG-антител к ВГЕ в сыворотке/плазме крови человека методом иммуноферментного анализа в «непрямом» формате «Скрин-ВГЕ-IgG».

Для создания СЛПС использовали образцы крови от больных ГЕ из клинических учреждений Республики Беларусь и Республики Киргизия, а также условно здоровых лиц из клинико-диагностического отделения ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, Россия, Москва.

СЛПС состоит из 8 образцов пулированных сывороток крови человека желтого или светло-желтого цвета. Все образцы инактивированы прогреванием при температуре (56±1)°С в течение 3 часов, не содержат НВs-антигена, антител к T.pallidum, вирусу гепатита С, ВИЧ-1/2 и антигена р24 ВИЧ-1. Во все образцы СЛПС в качестве консерванта добавляли Procline100 до конечной концентрации 0,1 %.

Наличие или отсутствие IgG-антител к ВГЕ в образцах СЛПС подтверждено при постановке иммуноферментного анализа в тест-системах «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G» (НПО «Диагностические системы»), экспериментального образца тест-системы для определения суммарных антител к ВГЕ «Скрин-ВГЕ-АТ» (НИИВС им. И. И. Мечникова) и «RecomWeel HEV IgG» (Euroimmun, Германия). Характеристика образцов СЛПС в наборах реагентов разных производителей представлена в таблице 2.

Таблица 2 - Характеристика образцов СЛПС в наборах реагентов разных производителей

Производитель		ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»	НПО «Диагностические системы»	ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»	ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»	«Euroimmun»
Название		«Скрин-ВГЕ-АТ», серия 3	«ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G», серия 039082	«Скрин-ВГЕ-IgG», Серия 2	«Скрин-ВГЕ-IgG», cерия 2	«recomWeel HEV IgG», серия Е1908112BR
Метод		ИФА	ИФА	ИФА	ИФА	ИФА
Маркер		Специфические антитела	IgG	IgG	IgG	IgG
ОП крит.		0,258	0,203	0,223
№ обр.	Характеристика в ИФА	Качественный анализ Оптическая плотность, (ОП)			Количественный анализ, концентрация, МЕ/мл
1	полож	1,140	1,291	2,6±0,0,2	25,0	12,3
2	полож	1,670	1,686	1,4±0,3	11,0	15,8
3	полож	1,280	1,342	1,560±0,280	15,0	9,5
4	полож	0,990	0,875	0,640±0,3	5,0	2,8
5	отр	0,07	0,048	0,130±0,03	<1,0	<1,0
6	отр	0,180	0,036	0,090±0,04	<1,0	<1,0
7	отр	0,06	0,059	0,1±0,03	<1,0	<1,0
8	отр	0,06	0,182	0,08±0,01	<1,0	<1,0

В дальнейшем образцы СЛПС использовали для разработки экспериментального образца тест-системы для качественного выявления IgG-антител к ВГЕ и определения концентрации IgG-антител к ВГЕ в сыворотке/плазме крови человека методом иммуноферментного анализа в «непрямом» формате «Скрин-ВГЕ-IgG».

2. Разработка условий иммобилизации мозаичного рекомбинантного белка ORF2/3_ВГЕ1/3 на поверхности лунок полистироловых планшет для ИФА.

Для определения оптимальной концентрации мозаичного рекомбинантного белка ORF2/3_ВГЕ1/3 для сорбции готовили его разведения в КББ в концентрации от 3 мкг/мл до 1,0 мкг/мл. Для сорбции использовали полистироловые стрипованные 96-луночные планшеты для ИФА с высокой связывающей способностью («Costar», Мексика, кат. №2592).

По 100 мкл каждого разведения вносили в соответствующие лунки планшета для ИФА и инкубировали в течение 12-14 часов при температуре +4°С. По окончании инкубации планшеты промывали с помощью устройства для автоматического промывания 3 раза промывочным раствором - ФСБ-Т. После промывки проводили блокировку лунок планшета 0,5 % раствором казеина в КББ, для чего в каждую лунку вносили по 200 мл данного раствора и оставляли на 60 минут при комнатной температуре. Через час раствор из каждой лунки удаляли путем аспирации, а планшеты сушили в ламинарном шкафу в течение часа.

Для определения оптимальной концентрации мозаичного антигена ВГЕ для сорбции выполняли ИФА в «непрямом» формате. В каждую лунку планшета вносили по 90 мкл раствора ФСБ-Т с 0,9 % казеина. Затем в соответствующие лунки вносили по 10 мкл положительных (12 шт.) и отрицательных (12 шт.) образцов сывороток крови. Все сыворотки были предварительно протестированы в наборе «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G».

Планшеты инкубировали при +37°С в течение 30 минут и промывали 3 раза, используя ФСБ-Т. На следующем этапе в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл рабочего разведения (1:10000) конъюгата (P-GAH Igg, АО «Имтек», Россия) и инкубировали при +37°С в течение 30 минут.

По окончании инкубации планшеты промывали 3 раза с помощью ФСБ-Т и вносили в каждую лунку по 100 мкл рабочего разведения раствора хромогена. Планшеты выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут, останавливали реакцию внесением в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и определяли оптическую плотность (ОП) в каждой лунке спектрофотометрически при длине волны 450 нм (длина волны сравнения 630 нм).

На основании полученных данных рассчитывали среднее значение ОП для положительных и отрицательных образцов и строили график, приведенный на Фиг.21, по которому определяли оптимальную концентрацию мозаичного рекомбинантного белка ORF2/3_ВГЕ1/3 для сорбции, которая составила 2,5мкг/мл, так как соотношение между средними значениями ОП положительных и отрицательных образцов при данной концентрации максимальное и равно 9,4.

3. Выбор препарата пероксидазного конъюгата к IgG человека и определение его рабочего разведения. Определение состава буфера для разведения конъюгата.

Определение оптимального препарата антивидового пероксидазного конъюгата к IgG человека является одним из ключевых моментов при разработке тест-систем для количественного анализа в формате «непрямого» твердофазного ИФА. Протестировано 3 препарата антивидовых антител к IgG человека, меченных пероксидазой:

- P-GAH Igg: конъюгат антител козы к иммуноглобулину IgG человека с пероксидазой хрена, производства «ИМТЕК», Москва;

- Моноклональные антитела (МАТ) к Fab-фрагменту IgG человека – МАТ2А11-ПХ («Сорбент», Москва), меченные пероксидазой хрена методом перйодатного окисления [Nakane P.K. (1974) J. Histochem. Cytochem., 22, 1084] в лаборатории клонирования вирусных геномов ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»;

- МАТ к Fс-фрагменту IgG человека – МАТСН1-ПХ («Сорбент», Москва), меченные пероксидазой хрена методом перйодатного окисления [Nakane P.K. (1974) J. Histochem. Cytochem., 22, 1084] в лаборатории клонирования вирусных геномов ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова».

Для этих целей в лунки полистироловых 96-луночных планшетов для ИФА с высокой связывающей способностью вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного антигена ORF2/3_ВГЕ1/3 в концентрации 2,5 мкг/мл в КББ и инкубировали в течение 12-14 часов при температуре +4°С после чего планшеты промывали с помощью автоматизированного вошера 3 раза раствором ФСБ-Т. После промывки проводили в течение 60 минут при комнатной температуре блокировку планшета 0,5% раствором казеина в КББ. После удаления блокирующего раствора планшеты сушили в течение 60 мин.

Предварительно готовили разведения препаратов пероксидазных конъюгатов от 1/10000 до 1/80000 в ФСБ-Т с 1% казеина.

Далее определяли активность конъюгатов в ИФА «непрямого» формата. В каждую лунку планшета вносили по 90 мкл раствора ФСБ-Т с 1% казеина и по 10 мкл положительных (4 шт.) и отрицательных (4 шт.) образцов СЛПС. Планшеты инкубировали при +37°С в течение 30 минут и промывали 3 раза ФСБ-Т. На следующем этапе в лунки планшетов вносили по 100 мкл каждого разведения тестируемых пероксидазных конъюгата к IgG человека и инкубировали при +37°С в течение 30 минут, затем планшеты промывали 3 раза с ФСБ-Т и вносили в каждую лунку по 100 мкл рабочего разведения раствора хромогена. Планшеты выдерживали в темноте при комнатной температуре 15 минут, останавливали реакцию внесением в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и определяли оптическую плотность (ОП) в каждой лунке спектрофотометрически при длине волны 450 нм (референс длина волны 630 нм). Рассчитывали среднее значение ОП для положительных и отрицательных образцов СЛПС для каждого разведения тестируемых конъюгатов и строили кривые титрования (Фиг.22). Анализ результатов позволил выбрать оптимальный вариант конъюгата для дальнейшего использования - МАТ к Fс-фрагменту IgG человека – МАТСН1-ПХ в разведении 1/40000. При этом соотношение между средними значениями ОП положительных и отрицательных образцов СЛПС составило 286,3.

Растворы для разведения конъюгата № 1 и № 2 тестировали в сравнении с ФСБ-Т. Оба раствора готовили на основе ФСБ-Т с добавлением 2,5 % казеина и 10 % глицерина. Раствор № 1 содержал 5 % сыворотки крупного рогатого скота (КРС), а раствор № 2 – 10% концентрата блокирующего раствора, представляющего собой лизат клеток E.coli в фосфатном буфере (КБР).

Выбор состава РРК выполняли методом ИФА, как описано выше. Положительные и отрицательные образцы СЛПС разводили в 10 раз, используя ФСБ-Т с 1% казеина. Конъюгат МАТСН1-ПХ разводили 1/40000 в растворе № 1, в растворе №2 и в ФСБ-Т с 1% казеина. Результаты представлены на Фиг. 23. Показано, что раствор № 1 препятствует неспецифическому связыванию и обеспечивает максимальное взаимодействие конъюгата со специфическими IgG-антителами к ВГЕ.

4. Определение состава раствора для разведения сывороток (РРС)

Оптимальный состав РРС должен препятствовать неспецифическому связыванию с твердой фазой различных белков, содержащихся в сыворотке крови человека и особенно неспецифических в отношении ВГЕ иммуноглобулинов класса G. Для этого необходимо было определить оптимальное количество КБР в базовом растворе на основе ФСБ-Т с 1% казеина. Было протестировано 3 варианта растворов для разведения проб сывороток крови в сравнении с контролем – ФСБ-Т с 1% казеина:

- ФСБ-Т с 1% казеина и 2,5% КБР, рН 7,4;

- ФСБ-Т с 1% казеина и 5% КБР рН 7,4;

- ФСБ-Т с 1% казеина и 10% КБР рН 7,4.

Для выбора состава РРС выполняли ИФА согласно вышеописанной процедуре с использованием образцов СЛПС. Результаты представлены на Фиг 24. Использование КБР в растворе для разведения сывороток КБР позволило существенно снизить неспецифическую фоновую реакцию на отрицательных образцах СЛПС, увеличивая тем самым дискриминацию между положительными и отрицательными образцами. Для дальнейшей работы в качестве РРС выбран вариант - ФСБ-Т с 1% казеина и 5% КБР.

5. Определение оптимального режима инкубации планшет для ИФА с исследуемыми образцами сывороток и конъюгатом.

Были изучены особенности взаимодействия образцов сывороток крови человека с мозаичным рекомбинантным антигеном, адсорбированным в лунках планшета для ИФА, в интервале от 30 минут до 1 часа при температуре 37,0±1,0°С и конъюгатом в течение 30 и 60 минут при температуре 37,0±1,0°С. Оптимальное время инкубации с образцами сывороток составило 30 минут и с конъюгатом - 30 мин. Увеличение продолжительности инкубаций удлиняло время проведения анализа и вызывало появление неспецифических взаимодействий.

6. Тестирование экспериментального образца тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG» с международным ВОЗ-стандартом АТ к ВГЕ

Для оценки аналитической чувствительности экспериментальной тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG» проводили титрование международного стандартного образца ВОЗ «Anti-Hepatitis E Serum, Human» 95/584 NIBSC, содержащего специфические IgM- и IgG-антитела. Для этого готовили разведения ВОЗ-стандарта в РРС с концентрациями 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05 МЕ/мл. По результатам их тестирования аналитическая чувствительность системы составила 0,05 МЕ/мл. На Фиг. 25 представлены кривые титрования ВОЗ-стандарта 95/584 в экспериментальном образце тест-системы (нижний график - часть полученной кривой титрования в диапазоне концентраций от 0,0 до 1,0 МЕ/мл).

7. Получение и стандартизация искусственных калибраторов по ВОЗ-стандарту 95/584. Исследование стабильности калибровочных проб в условиях моделирования длительного хранения. Определение основных функциональных характеристик разработанной тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG».

Важным компонентом тест-системы для количественного определения IgG-антител к ВГЕ является наличие стабильного стандартизованного калибратора, из которого готовятся калибровочные пробы с различными концентрациями антител. На основе калибровочных проб строится график зависимости оптической плотности от концентрации IgG-антител к ВГЕ, по которому определяют концентрацию антител в анализируемой пробе. Материал, используемый для создания калибратора, должен быть однородным и в достаточном количестве, легко стандартизироваться, сохранять стабильность в течение длительного времени.

Для разработки калибратора использовали конъюгат специфических поликлональных кроличьих антител с человеческими иммуноглобулинами класса G, выделенными из плазмы крови человека. Кроличьи антитела получали из антисывороток и очищали с помощью аффинной хроматографии.

Фракцию IgG человека выделяли из плазмы крови путем осаждения насыщенным раствором сульфата аммония с дальнейшим ее фракционированием методами эксклюзионной, ионообменной и аффинной хроматографии. Отбор фракций осуществляли по результатам проверки методами ИФА и электрофореза. Конъюгат синтезировали ранее предложенным методом [Staros, J.V., et al. (1986). Enhancement by N - hydroxysulfosuccinimide of water - soluble carbodiimide - mediated coupling reactions. Anal Biochem 156: 220 -222].

Полученный искусственный калибратор титровали относительно ВОЗ-стандарта IgG-антител к ВГЕ. ИФА проводили по процедуре, описанной выше. На основании полученных данных строили кривые титрования для ВОЗ-стандарта и оцениваемого искусственного калибратора (Фиг.26). Анализ полученных результатов подтвердил возможность использования полученных калибровочных проб с концентрациями IgG-антител к ВГЕ 25,0 МЕ/мл, 10,0 МЕ/мл, 1,0 МЕ/мл и 0,2 МЕ/мл.

Исследование стабильности калибровочных проб в условиях моделирования длительного хранения

В соответствии с требованиями ГОСТ 23640-2015 проведено предварительное испытание стабильности калибровочных проб в течение 21 сут при температурах: +4,0±1°С и +37,0±1°С с целью определения их стабильности при моделировании длительного хранения. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Средние значения ОП калибровочных проб в условиях эксперимента ускоренного старения

Калибровочные пробы:	Температура хранения +37°С				Температура хранения +4°С				Коэффициент вариации КВ, %
	1 сут	2 сут	14 сут	21 сут	1 сут	7 сут	14 сут	21 сут
	Средние значения ОП
КП№1, 25,0 МЕ/мл	2,466	2,408	2,487	2,452	2,580	2,563	2,667	2,837	5,5
КП№2, 10,0 МЕ/мл	1,287	1,175	1,251	1,255	1,411	1,298	1,326	1,415	6,2
КП№3, 1,0 МЕ/мл	0,218	0,202	0,202	0,209	0,234	0,246	0,216	0,254	9,0
КП№4, 0,2 МЕ/мл	0,083	0,073	0,084	0,108	0,082	0,087	0,082	0,090	5,8

Активность калибровочных проб не снижалась в течение всего срока хранения при двух температурных режимах. При этом КВ для калибровочных проб не превышали 9%.

Таким образом, результаты экспериментов по ускоренному старению, показали, что калибровочные пробы сохраняют специфические свойства и стабильность в течение года при температуре от 2 до 8°С.

Определение основных функциональных характеристик разработанной тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG».

В соответствии с ГОСТ 51352-2013 были определены основные функциональные характеристики разработанного прототипа тест-системы для количественного определения специфических IgG к ВГЕ в сыворотке/плазме крови человека (табл.4).

Таблица 4 - Основные функциональные характеристики

Функциональный показатель	Величина функционального показателя
Чувствительность	0,05 МЕ/мл
Тест на «открытие»	Определяемые в анализе концентрации IgG-антител к ВГЕ отличались от теоретически рассчитанных значений в среднем на 2,6% (от 0,5% до 7,0%).
Тест на «линейность»	Определяемые в анализе концентрации IgG-антител отличались от теоретически рассчитанных значений в среднем на 6,7% (от 0,8% до 12,0%).
Коэффициент вариации	7,8%
Соотношение: ОП0<ОПКП№4-0,2-min<ОПКП№3-1,0 <ОПКП№2 -10,0<ОПКП№1-25,0max	0,02±0,005< 0,04 ±0,005 < 0,24 ±0,04 < 1,60 ±0,3< 2,85 ±0,4
Отношение ОП калибровочной пробы с минимальным содержанием IgG-антител к ВГЕ к ОП нулевой калибровочной пробы ОПmin /ОП0	2,0
Отношение ОП калибровочной пробы с максимальным содержанием IgG-антител к ВГЕ к ОП нулевой калибровочной пробы ОПmax /ОП0	142,5
Интерсепт для: 25 МЕ/мл 10 МЕ/мл 1,0 МЕ/мл 0,2 МЕ/мл	58% 53% 50% 30%

Таким образом, полученные значения основных функциональных характеристик тест-системы для количественного анализа специфических IgG к ВГЕ в сыворотке/плазме крови человека соответствуют требованиям, приведенным в ГОСТе 51352-2013.

На основе проведенных исследований разработаны требования к учету результатов и интерпретации результатов.

Учет результатов и интерпретация результатов

Измерение ОП проводилось на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Рекомендуемая длина волны сравнения (620-650 нм). Выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществлялось по воздуху.

Рассчитывали средние значения ОП для положительного и отрицательного контрольных образцов. Полученные результаты должны были удовлетворять следующим требованиям:

среднее значение ОП по лункам с положительным контрольным образцом ОПСРК+	не менее 0,80 о.е.
среднее значение ОП по лункам с отрицательным контрольным образцом ОПСРК-	не более 0,2 о.е.

При несоблюдении любого из этих требований анализ повторяли. При соблюдении всех требований переходили к учету результатов анализа исследуемых образцов.

Рассчитывали критическое значение ОП (ОП_КРИТ) по формуле (1):

ОП_КРИТ = ОП_СРК- + А^*, где параметр A = 0,2* (1)

(* – параметр А индивидуален для каждой серии набора и указан в инструкции, вкладываемой в наборы соответствующей серии).

Рассчитывали ОП, соответствующую нижней границе «серой зоны» (ОП_СЗ) по формуле (2):

ОП_СЗ = ОП_КРИТ × 0,9 (2)

Результат исследования считали положительным, если ОП для исследуемого образца (ОП_ОБР) превышает значение ОП_КРИТ.

Результат исследования считали отрицательным, если ОП_ОБР не превышает значения ОП_СЗ.

Результат исследования считали неопределенным, если ОП_ОБР находится в пределах «серой зоны»: ОП_СЗ ≤ ОП_ОБР ≤ ОП_КРИТ.

Для интерпретации результатов также использовали коэффициент позитивности (КП_ОБР), рассчитываемый по формуле (3):

КП_ОБР = ОП_ОБР / ОП_КРИТ (3)

Результат исследования считать отрицательным, если КП_ОБР < 0,9.

Результат исследования считать положительным, если КП_ОБР > 1,0.

Результат исследования считать неопределенным, если 0, 9 ≤ КП_ОБР ≤ 1.

Калибровочный график строили методом «от точки к точке» (point-to-point). По оси Y откладывали среднее значение измеренной оптической плотности КП№1, КП№2, КП№3, КП№4, по оси X – соответствующие концентрации антител в МЕ/л в этих калибраторах. На Фиг.27 приведен пример типичного калибровочного графика. Данный график не использовали для определения концентрации антител в образцах пациентов.

Затем проверяли соответствие полученного значения содержания антител IgG к ВГЕ (МЕ/мл) в положительном контрольном образце. Если полученное значение находится в указанных на этикетке флакона пределах, анализ проведен правильно.

По калибровочному графику определяли содержание антител IgG к ВГЕ в анализируемых образцах сывороток крови.

Если ОП образца выше величины ОП для КП№ 1 (с концентрацией 25 МЕ/л), результат следует выражать как «>25,0 МЕ/мл». Такой образец разводили и тестировали повторно, а результат, полученный по калибровочному графику (в МЕ/мл), умножали на коэффициент разведения.

Верхняя граница интервала нормальных значений (ОП cut-off), установленная в настоящих исследованиях, составляла 1,0±0,2 МЕ/мл.

Интерпретация результатов:

< 0,8 МЕ/мл: Отрицательный результат;

> 0,8 до <1,2 МЕ/мл: Пограничный результат – «Серая зона»;

> 1,2 МЕ/мл: Положительный результат.

Состав экспериментального образца тест-системы представлен в таблице 5.

Таблица 5

Компонент	Внешний вид	Количество
Иммуносорбент (ИС)	Разборный 96-луночный планшет для иммунологических исследований с прозрачным плоским дном лунок	разборный (стрипованный) планшет
Калибровочная проба №1 (КП№1) с концентрацией IgG-ВГЕ 25,0 МЕ/мл, откалибрована относительно международного Стандарта ВОЗ «Антитела к вирусу гепатита Е, сыворотка крови человека», NIBSC code: 95/584 (Англия). Консервант – Фенол.	Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость розового цвета.	1,3 мл 1 пробирка
Калибровочная проба №2 (КП№2) с концентрацией IgG-ВГЕ 10,0 МЕ/мл, откалибрована относительно международного Стандарта ВОЗ «Антитела к вирусу гепатита Е, сыворотка крови человека», NIBSC code: 95/584 (Англия). Консервант – Фенол.	Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость розового цвета.	1,3 мл 1 пробирка
Калибровочная проба №3 (КП№3) с концентрацией IgG-ВГЕ 1,0 МЕ/мл, откалибрована относительно международного Стандарта ВОЗ «Антитела к вирусу гепатита Е, сыворотка крови человека», NIBSC code: 95/584 (Англия). Консервант – Фенол.	Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость розового цвета.	1,3 мл 1 пробирка
Калибровочная проба №4 (КП№4) с концентрацией IgG-ВГЕ 0,2 МЕ/мл, откалибрована относительно международного Стандарта ВОЗ «Антитела к вирусу гепатита Е, сыворотка крови человека», NIBSC code: 95/584 (Англия). Консервант – Фенол.	Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость розового цвета.	1,3 мл 1 пробирка
Положительная контрольная проба / Положительный контрольный образец инактивированный (К+), содержит IgG-антитела к ВГЕ. Инактивирован прогреванием при температуре (56±1)°С в течение 3 часов, не содержит НВs-антигена, антител к ВГС, ВИЧ-1/2 и антигена р24 ВИЧ-1. Консервант – Фенол.	Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость красного цвета, приготовленная на основе пула инактивированных сывороток крови человека с высоким содержанием специфических IgG-антител к ВГЕ. Концентрация IgG-ВГЕ указана на этикетке флакона и в паспорте.	0,2 мл 1 пробирка
Отрицательная контрольная проба (0 МЕ/мл) / Отрицательный контрольный образец инактивированный (К–), не содержит IgG-антител к ВГЕ. Инактивирован прогреванием при температуре (56±1)°С в течение 3 часов, не содержит НВs-антигена, антител к ВГС, ВИЧ-1/2 и антигена р24 ВИЧ-1. Консервант – Фенол.	Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость синего цвета, приготовленная на основе пула инактивированных сывороток крови человека, не содержащих специфических IgG-антител к ВГЕ	0,3 мл 1 пробирка
Концентрат (×25) раствора для промывания планшетов (ПР×25)	Пенящаяся прозрачная или опалесцирующая бесцветная жидкость, при хранении возможно расслоение и выпадение кристаллического осадка, растворяющегося при температуре от +35°С до +37°С в течение 30 мин	30,0 мл 1 флакон
Концентрат конъюгата (КК)	Опалесцирующая жидкость светло-желтого цвета – концентрат конъюгата моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой хрена	1 флакон (0,4 мл)
Раствор для разведения конъюгата (РРК)	Прозрачная бесцветная опалесцирующая пенящаяся жидкость	15,0 мл 1 флакон
Раствор для разведения сыворотки/плазмы (РРС)	Пенящаяся прозрачная бесцветная опалесцирующая жидкость	15,0 мл 1 флакон
Раствор для разведения хромогена (РРХ)	Прозрачная бесцветная жидкость	15,0 мл 1 флакон
Хромоген (ТМБ)	Прозрачная бесцветная жидкость	1,5 мл 1 пробирка
Стоп-реагент (0,5 N раствор серной кислоты)	Прозрачная бесцветная жидкость	15,0 мл 1 флакон
Пленка для заклеивания планшета	Самоклеящаяся влагонепроницаемая пленка	2 шт.
Ванночка для реагентов	Ванночка из поливинилхлорида для 8-ми канального дозатора	2 шт.
Наконечники для дозаторов	Одноразовые наконечники для отбора объемов жидкости до 200 мкл	16 шт.

На Фиг.28 представлен внешний вид макета экспериментального образца тест-системы.

Лабораторные испытания экспериментального образца тест-системы

По результатам титрования аналитическая чувствительность разработанного экспериментального образца тест-системы составила 0,05 МЕ/мл.

Аналитическая специфичность определяется как способность тест-системы обнаруживать только исследуемый аналит при наличии в пробе потенциально интерферирующих веществ или потенциально интерферирующих антител (при перекрестных реакциях).

Установлено, что на результаты исследований, выполненных с помощью «Скрин-ВГЕ-IgG», не влияет повышенное содержание в сыворотке/плазме крови основных интерферирующих веществ - ревматоидного фактора (от 10 до 90 МЕ/мл), билирубина (от 10 до 65 мкмоль/л), триглицеридов (от 0,5 до 7,5 мг/мл), глюкозы (от 6,0 до 33,5 мМоль/л) и церулоплазмина (от 0,5 до 8 г/л), а также присутствие в плазме гепарина в концентрациях 3,5 – 35 МЕ/мл, калий-ЭДТА – 1,6 – 16,0 мг/мл, цитрата натрия – 27,3 – 273 мг/мл.

Также для оценки аналитической специфичности тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG» исследовали 83 образца сывороток крови от пациентов, серопозитивных в отношении ряда вирусных инфекций (табл.6).

Таблица 6

Инфекция	N	Серопозитивные образцы в тест-системе «Скрин-ВГЕ-IgG»
Вирус простого герпеса 1/2 типа	12	0
Цитомегаловирус	12	0
Вирусный гепатит А	10	0
Вирусный гепатит В	11	0
Вирусный гепатит С	10	0
Вирус иммунодефицита человека	10	0
Вирус ветряной оспы	10	0
Вирус кори	8	0

Изучение диагностической чувствительности и специфичности экспериментального образца тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG»

Диагностическая эффективность экспериментального образца тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG» оценивалась на образцах положительных (n=39) и отрицательных (n=69) сывороток, предварительно протестированных в тест-системе «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G» («Диагностические системы», Россия).

Диагностическую чувствительность и диагностическую специфичность определяли с помощью методики построения кривых оперативных характеристик (ROC-кривых) с помощью компьютерной программы для сбора и статистической обработки биомедицинских данных «MedCalc» (Фиг. 29, где: 1 - положительные образцы, 0 - отрицательные образцы).

Рассчитанные характеристики с помощью модуля для построения ROC-кривых составили:

- диагностическая чувствительность – 100% (р<0,05; ДИ 90,9% – 100,0%);

- диагностическая специфичность – 98,6% (р<0,05; ДИ 94,7% – 99,9%);

- уровень отсечения (cut off) в виде ОПкрит. – 0,2.

Экспериментальный образец тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG» исследовали в сравнении с набором зарубежного производства - тест-системой «recomWeel HEV IgG» производства компании «Euroimmun», Германия (кат. № EI2525-9601 G). Всего было обследовано 26 образцов сыворотки крови человека, из которых 17 содержали, а 9 не содержали IgG-антител к ВГЕ по результатам тестирования в наборе «ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G». Анализ с помощью тест-системы «recomWeel HEV IgG» выполняли в соответствии с инструкцией по ее применению.

Показано хорошее соответствие калибровочных кривых, полученных с применением двух тест-систем, при этом в тест-системе «Скрин-ВГЕ-IgG» участки линейности отличались протяженностью в большем интервале концентраций определяемых антител (Фиг.30).

На втором этапе испытаний провели сравнение результатов определения содержания IgG-антител к ВГЕ в клинических образцах с помощью двух тест-систем (табл. 7).

Таблица 7 - Результаты определения IgG-антител к ВГЕ в клинических образцах с помощью тест-систем «Скрин-ВГЕ-IgG» и «recomWeel HEV IgG».

№ обр.	«Скрин-ВГЕ-IgG»		«recomWeel HEV IgG»
	Кон-ция IgG-ВГЕ, МЕ/мл	Результат	Кон-ция IgG-ВГЕ, МЕ/мл	Результат
1	25,0	Полож.	1,67	Полож.
2	25,0	Полож.	1,58	Полож.
3	15,8	Полож.	2,92	Полож.
4	21,39	Полож.	3,28	Полож.
5	25,0	Полож.	20,9	Полож.
6	4,04	Полож.	0,5	Отр.
7	25,0	Полож.	25,0	Полож.
8	23,5	Полож.	17,95	Полож.
9	21,4	Полож.	0,5	Отр.
10	25,0	Полож.	25,0	Полож.
11	2,46	Полож.	0,5	Отр.
12	4,97	Полож.	0,96	Отр.
13	18,6	Полож.	0,5	Отр.
14	22,4	Полож.	2,48	Полож.
15	25,0	Полож.	25,0	Полож.
16	2,2	Полож.	0,5	Отр.
17	25	Полож.	25,0	Полож.
18	<0,5	Отр.	<0,5	Отр.
19	<0,5	Отр.	<0,5	Отр.
20	<0,5	Отр.	<0,5	Отр.
21	<0,5	Отр.	<0,5	Отр.
22	<0,5	Отр.	<0,5	Отр.
23	<0,5	Отр.	<0,5	Отр.
24	<0,5	Отр.	<0,5	Отр.
25	<0,5	Отр.	<0,5	Отр.
26	<0,5	Отр.	<0,5	Отр.

Анализ полученных результатов показал, что в группе положительных сывороток, содержащих IgG-антитела к ВГЕ, доля положительных результатов анализа в обеих тест-системах не была одинаковой: в тест-системе «Скрин-ВГЕ-IgG» из 17 положительных сывороток все были положительными, в тест-системе «recomWeel HEV IgG» положительными были 11 из 17 образцов. В группе отрицательных сывороток все 9 образцов были отрицательными в двух тест-системах. Тест-система «Скрин-ВГЕ-IgG» имеет более высокую аналитическую чувствительность, так как определяет аналит в более высоких концентрациях, чем тест-система сравнения.

Таким образом диагностическая эффективность экспериментального образца тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG» составила 100% чувствительности и 100% специфичности. Чувствительность была выше, чем в наборе сравнения «recomWeel HEV IgG» (67%). Разработанная тест-система обладает более высокой чувствительностью за счет использования мозаичного рекомбинантного белка ORF2/3_ВГЕ1/3.

Апробация экспериментального образца тест-системы для определения антител к ВГЕ на клиническом материале из РФ, РБ, КР.

С целью клинической апробации и уточнения практической значимости разработанного экспериментального образца тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG» проведено тестирование образцов сывороток крови из РБ, КР и РФ.

Серологические маркеры инфицирования вирусами гепатитов А, В, С, Е и возбудителями инфекционной патологии печени иной этиологии - цитомегаловирусом, вирусом краснухи, вирусом Эпштейн-Барр, вирусом иммунодефицита человека определяли с помощью отечественных коммерческих иммуноферментных тест-систем производства НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород, ЗАО «Вектор-Бест» г. Новосибирск, ЗАО БТК «Биосервис», г. Боровск. Все анализы проводили в соответствии с инструкциями по применению для соответствующих тест-систем.

Всего было обследовано 478 образцов сывороток крови, из них 75 - от больных ГЕ. Контрольная группа включала 403 образца, из которых 320 - от условно здоровых лиц без клинических жалоб (таблица 8), 31 - от больных с лабораторно подтвержденным диагнозом ГА (n=10), ГВ (n=11), ГС (n=10) и патологиями печени иной этиологии: ЦМВИ (n=12), ВИЧ-инфекция (n=10), вирус простого герпеса 1/2 (n=12), цитомегаловирус (n=12), ветряная оспа (n=10), корь (n=8) (таблица 9). Все обследуемые образцы были предварительно протестированы на присутствие IgG-антител к ВГЕ в тест-системе «ДС-ИФА-АНТИ-HЕV-G».

Таблица 8

n=395		«ДС-ИФА-АНТИ-HEV- G»
		положительные	отрицательные
«Скрин-ВГЕ-IgG»	положительные	73	0
	пограничные	2	2
	отрицательные	0	318

Таблица 9

Инфекция	N	Серопозитивные образцы в тест-системе «Скрин-ВГЕ-IgG»
Вирус простого герпеса 1/2 типа	12	0
Цитомегаловирус	12	0
Вирусный гепатит А	10	0
Вирусный гепатит В	11	0
Вирусный гепатит С	10	0
Вирус иммунодефицита человека	10	0
Вирус ветряной оспы	10	0
Вирус кори	8	0

Полученные результаты позволяют заключить, что разработанная тест-система позволяет выявлять антитела к ВГЕ с высокой чувствительностью и специфичностью. Учитывая высокие технико-аналитические показатели тест-системы «Скрин-ВГЕ-IgG», а также отсутствие на российском рынке наборов для количественного определения антител к ВГЕ, можно рекомендовать ее применение в клинической практике.

Разработаны проекты нормативно-технической документации на мозаичный рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотные последовательности белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов, и тест- систему «Скрин-ВГЕ-IgG»: технических условий, инструкций по применению, паспортов.

В технике не известно аналогов подобных тест-систем, разработанных с применением мозаичного рекомбинантного антигена ORF2/3_ВГЕ1/3.

ПЕРЕЧНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

MetGlyArgGlySerAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyAspSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMetTyrValSerAspThrValThr

PheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpSerLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerValSerAlaValGly

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrIleAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgAsnLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

SerGlySerGluPheAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla

GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGluSerArgValVal

IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer

ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu

TyrAspGlnSerThrTyrGlySerSerThrGlyProValTyrValSerAspSerValThr

LeuValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpThrLysVal

ThrLeuAspGlyArgProLeuSerThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeu

ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr

AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnLeuLeuValGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal

AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerIleSerAlaValAla

ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaLeuLeuGluAspThrMetAspTyrProAlaArg

AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgProLeuGlyLeuGlnGlyCysAla

PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu

LeuGluPheGluLeuMetGlySerProCysAlaLeuGlyLeuPheCysCysCysSerSer

CysPheCysLeuCysCysProArgHisArgProAlaSerArgLeuAlaAlaValValGly

GlyAlaAlaAlaValProAlaValValSerGlyValThrGlyLeuIleLeuSerProSer

ProSerProIlePheIleGlnProThrProLeuProProThrSerTyrHisAsnProGly

LeuGluLeuAlaLeuAspSerArgProAlaProSerAlaProLeuGlyValThrSerPro

SerAlaProProLeuProProValValAspLeuProGlnLeuGlyLeuArgArgIlePhe

IleGlnProThrProSerProProMetSerProLeuArgProGlyLeuAspLeuValPhe

AlaAsnProProAspHisSerAlaProLeuGlyValThrArgProSerAlaProProLeu

ProHisValValHisLeuProGlnLeuGlyProArgGluLeuArgArg

Claims (36)

1. Рекомбинантный мозаичный полипептид, предназначенный для использования в тест-системах, применяемых в серодиагностике гепатита Е, включающий в себя фрагменты белков ORF2 и ORF3 ВГЕ 1 и 3 генотипов с аминокислотной последовательностью:
2. MetGlyArgGlySerAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla
3. GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyAspSerArgValVal
4. IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer
5. ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu
6. TyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMetTyrValSerAspThrValThr
7. PheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpSerLysVal
8. ThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrValLeu
9. ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr
10. AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal
11. AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerValSerAlaValGly
12. ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrIleAspTyrProAlaArg
13. AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgAsnLeuGlyLeuGlnGlyCysAla
14. PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu
15. SerGlySerGluPheAsnGlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAla
16. GlnGlnAspLysGlyIleAlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGluSerArgValVal
17. IleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSer
18. ArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGlu
19. TyrAspGlnSerThrTyrGlySerSerThrGlyProValTyrValSerAspSerValThr
20. LeuValAsnValAlaThrGlyAlaGlnAlaValAlaArgSerLeuAspTrpThrLysVal
21. ThrLeuAspGlyArgProLeuSerThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeu
22. ProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyr
23. AsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnLeuLeuValGluAsnAlaAlaGlyHisArgVal
24. AlaIleSerThrTyrThrThrSerLeuGlyAlaGlyProValSerIleSerAlaValAla
25. ValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaLeuLeuGluAspThrMetAspTyrProAlaArg
26. AlaHisThrPheAspAspPheCysProGluCysArgProLeuGlyLeuGlnGlyCysAla
27. PheGlnSerThrValAlaGluLeuGlnArgLeuLysMetLysValGlyLysThrArgGlu
28. LeuGluPheGluLeuMetGlySerProCysAlaLeuGlyLeuPheCysCysCysSerSer
29. CysPheCysLeuCysCysProArgHisArgProAlaSerArgLeuAlaAlaValValGly
30. GlyAlaAlaAlaValProAlaValValSerGlyValThrGlyLeuIleLeuSerProSer
31. ProSerProIlePheIleGlnProThrProLeuProProThrSerTyrHisAsnProGly
32. LeuGluLeuAlaLeuAspSerArgProAlaProSerAlaProLeuGlyValThrSerPro
33. SerAlaProProLeuProProValValAspLeuProGlnLeuGlyLeuArgArgIlePhe
34. IleGlnProThrProSerProProMetSerProLeuArgProGlyLeuAspLeuValPhe
35. AlaAsnProProAspHisSerAlaProLeuGlyValThrArgProSerAlaProProLeu
36. ProHisValValHisLeuProGlnLeuGlyProArgGluLeuArgArg

Images