JPH0862217A - 酵素免疫定量法用プレート - Google Patents
酵素免疫定量法用プレートInfo
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- JPH0862217A JPH0862217A JP6200232A JP20023294A JPH0862217A JP H0862217 A JPH0862217 A JP H0862217A JP 6200232 A JP6200232 A JP 6200232A JP 20023294 A JP20023294 A JP 20023294A JP H0862217 A JPH0862217 A JP H0862217A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新たな診断系を提供する。
【構成】 病原体の感染症の発見を、モノクローナル抗
体が固定化されている酵素免疫定量法用プレートにおい
て、該モノクローナル抗体が、抗原タンパク質とキャリ
アタンパク質とから本質的に構成される融合タンパク質
と、該キャリアタンパク質を介して抗原抗体反応により
結合していることを特徴を有する酵素免疫定量法用プレ
ートを用いることにより行う。
体が固定化されている酵素免疫定量法用プレートにおい
て、該モノクローナル抗体が、抗原タンパク質とキャリ
アタンパク質とから本質的に構成される融合タンパク質
と、該キャリアタンパク質を介して抗原抗体反応により
結合していることを特徴を有する酵素免疫定量法用プレ
ートを用いることにより行う。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵素免疫定量法（以下、
ＥＬＩＳＡ法という）用のプレートに関する。
ＥＬＩＳＡ法という）用のプレートに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＥＬＩＳＡ法は、抗原タンパク質の定量
・検出や感染症の診断などに広く用いられている免疫学
的手法である。このＥＬＩＳＡ法では、通常、ＥＬＩＳ
Ａ用プレートに抗原タンパク質を固定し、この抗原タン
パク質と結合する抗体を検出するが、固定する抗原タン
パク質に不要なタンパク質が混入するとこれと反応する
抗体も同時に検出されてしまうため、高度に精製された
抗原タンパク質が必要とされる。しかしながら、ＥＬＩ
ＳＡ法などで用いられる抗原タンパク質は、病原体の直
接大量培養や遺伝子組み換え法などの常法により得られ
るが、抗原タンパク質の精製には多くの精製段階を経な
ければならず、大量調製の困難さ、生産コスト上昇など
の問題があった。このようなＥＬＩＳＡ法の問題点であ
る目的外の抗体の検出を低減する目的で、ＥＬＩＳＡプ
レートに抗原タンパク質を直接固定化させる代わりに、
抗原タンパク質に対応するモノクローナル抗体を用い
る、いわゆるサンドイッチキャプチャー酵素免疫定量法
（以下、サンドイッチＥＬＩＳＡ法という）という改良
法が知られている（Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．２９６、２３８
−２４０（１９８８））。しかし、この方法では、抗原
タンパク質ごとに、対応する別のモノクローナル抗体を
得てＥＬＩＳＡプレートに固定しなければならず、安価
で簡便な方法とは言えないものであった。
・検出や感染症の診断などに広く用いられている免疫学
的手法である。このＥＬＩＳＡ法では、通常、ＥＬＩＳ
Ａ用プレートに抗原タンパク質を固定し、この抗原タン
パク質と結合する抗体を検出するが、固定する抗原タン
パク質に不要なタンパク質が混入するとこれと反応する
抗体も同時に検出されてしまうため、高度に精製された
抗原タンパク質が必要とされる。しかしながら、ＥＬＩ
ＳＡ法などで用いられる抗原タンパク質は、病原体の直
接大量培養や遺伝子組み換え法などの常法により得られ
るが、抗原タンパク質の精製には多くの精製段階を経な
ければならず、大量調製の困難さ、生産コスト上昇など
の問題があった。このようなＥＬＩＳＡ法の問題点であ
る目的外の抗体の検出を低減する目的で、ＥＬＩＳＡプ
レートに抗原タンパク質を直接固定化させる代わりに、
抗原タンパク質に対応するモノクローナル抗体を用い
る、いわゆるサンドイッチキャプチャー酵素免疫定量法
（以下、サンドイッチＥＬＩＳＡ法という）という改良
法が知られている（Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．２９６、２３８
−２４０（１９８８））。しかし、この方法では、抗原
タンパク質ごとに、対応する別のモノクローナル抗体を
得てＥＬＩＳＡプレートに固定しなければならず、安価
で簡便な方法とは言えないものであった。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、新たな診
断系を開発すべく更に鋭意研究した結果、グルタチオン
−Ｓ−トンランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴという）に
対するモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ法用プレートに
固定させ、これに抗原タンパク質とＧＳＴとの融合タン
パク質を結合させて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を行う
と擬陽性がきわめて少ない、即ち高感度な診断が可能と
なることを見いだし、本発明を完成するに到った。
断系を開発すべく更に鋭意研究した結果、グルタチオン
−Ｓ−トンランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴという）に
対するモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ法用プレートに
固定させ、これに抗原タンパク質とＧＳＴとの融合タン
パク質を結合させて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を行う
と擬陽性がきわめて少ない、即ち高感度な診断が可能と
なることを見いだし、本発明を完成するに到った。
【０００４】かくして、本発明によれば、モノクローナ
ル抗体が固定化されている酵素免疫定量法用プレートに
おいて、該モノクローナル抗体が、抗原タンパク質とキ
ャリアタンパク質との融合タンパク質と該キャリアタン
パク質を介して抗原抗体反応により結合していることを
特徴を有する酵素免疫定量法用プレートが提供される。
本発明のプレートについて、以下に詳細に説明する。
ル抗体が固定化されている酵素免疫定量法用プレートに
おいて、該モノクローナル抗体が、抗原タンパク質とキ
ャリアタンパク質との融合タンパク質と該キャリアタン
パク質を介して抗原抗体反応により結合していることを
特徴を有する酵素免疫定量法用プレートが提供される。
本発明のプレートについて、以下に詳細に説明する。
【０００５】本発明の融合タンパク質は、実質的に抗原
タンパク質とキャリアタンパク質とからなるものであ
り、常法に従って、例えば、遺伝子組み換え法にて製造
され、キャリアタンパク質との親和性を利用するアフィ
ニティーカラムクロマトグラフィーにより容易に精製す
ることができる。遺伝子組み換え法にて融合タンパク質
を製造する場合、キャリアタンパク質をコードするＤＮ
Ａと病原体の抗原タンパク質をコードするＤＮＡとを連
結するに当たり、適当な合成リンカーを用い両者を連結
し、読み枠がずれないようにすることができる。融合タ
ンパク質の分子量が大きい場合、遺伝子組み換え技術で
融合タンパク質を製造するに当たって発現効率が悪くな
り、逆に分子量が小さいとサンドイッチＥＬＩＳＡ法で
の検出感度が低下する。このため、融合タンパク質の分
子量の上限は、通常２５０キロダルトン（以下、Ｋｄと
いう）、好ましくは２３０Ｋｄ、より好ましくは２００
Ｋｄ、更に好ましくは１８０Ｋｄであり、下限は１５Ｋ
ｄ、好ましくは２０Ｋｄ、より好ましくは３０Ｋｄであ
る。
タンパク質とキャリアタンパク質とからなるものであ
り、常法に従って、例えば、遺伝子組み換え法にて製造
され、キャリアタンパク質との親和性を利用するアフィ
ニティーカラムクロマトグラフィーにより容易に精製す
ることができる。遺伝子組み換え法にて融合タンパク質
を製造する場合、キャリアタンパク質をコードするＤＮ
Ａと病原体の抗原タンパク質をコードするＤＮＡとを連
結するに当たり、適当な合成リンカーを用い両者を連結
し、読み枠がずれないようにすることができる。融合タ
ンパク質の分子量が大きい場合、遺伝子組み換え技術で
融合タンパク質を製造するに当たって発現効率が悪くな
り、逆に分子量が小さいとサンドイッチＥＬＩＳＡ法で
の検出感度が低下する。このため、融合タンパク質の分
子量の上限は、通常２５０キロダルトン（以下、Ｋｄと
いう）、好ましくは２３０Ｋｄ、より好ましくは２００
Ｋｄ、更に好ましくは１８０Ｋｄであり、下限は１５Ｋ
ｄ、好ましくは２０Ｋｄ、より好ましくは３０Ｋｄであ
る。
【０００６】このような融合タンパク質を構成する抗原
タンパク質とキャリアタンパク質について以下に説明す
る。抗原タンパク質は、目的に合った病原体等の抗原タ
ンパク質であれば特に限定されず、如何なるものであっ
てもよい。病原体の具体例としては、ヒト免疫不全症候
群ウイルス（以下、ＨＩＶという）、Ｂ型肝炎ウイル
ス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイ
ルス、百日咳菌、インフルエンザ菌、マラリア原虫など
哺乳類への感染が主であるウイルス・細菌・原虫のほ
か、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、
マイコプラズマ、コクシジウム原虫など哺乳類以外の宿
主への感染が知られているウイルス・細菌・原虫の抗原
タンパク質などが例示され、中でもＨＩＶの抗原タンパ
ク質が好ましく、ＨＩＶのコアタンパク質とｐｏｌタン
パク質がとりわけ好ましい。このほか、ガン細胞が特異
的に発現する抗原タンパク質等であってもよい。このよ
うな抗原タンパク質の分子量の上限は通常１５０Ｋｄ、
好ましくは１２０Ｋｄ、より好ましくは１００Ｋｄであ
り、下限は通常５Ｋｄ、好ましくは１０Ｋｄ、より好ま
しくは２０Ｋｄである。
タンパク質とキャリアタンパク質について以下に説明す
る。抗原タンパク質は、目的に合った病原体等の抗原タ
ンパク質であれば特に限定されず、如何なるものであっ
てもよい。病原体の具体例としては、ヒト免疫不全症候
群ウイルス（以下、ＨＩＶという）、Ｂ型肝炎ウイル
ス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイ
ルス、百日咳菌、インフルエンザ菌、マラリア原虫など
哺乳類への感染が主であるウイルス・細菌・原虫のほ
か、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス、
マイコプラズマ、コクシジウム原虫など哺乳類以外の宿
主への感染が知られているウイルス・細菌・原虫の抗原
タンパク質などが例示され、中でもＨＩＶの抗原タンパ
ク質が好ましく、ＨＩＶのコアタンパク質とｐｏｌタン
パク質がとりわけ好ましい。このほか、ガン細胞が特異
的に発現する抗原タンパク質等であってもよい。このよ
うな抗原タンパク質の分子量の上限は通常１５０Ｋｄ、
好ましくは１２０Ｋｄ、より好ましくは１００Ｋｄであ
り、下限は通常５Ｋｄ、好ましくは１０Ｋｄ、より好ま
しくは２０Ｋｄである。
【０００７】キャリアタンパク質は、該タンパク質に対
するモノクローナル抗体を得ることができ、かつ抗原タ
ンパク質による抗体検出を実質的に阻害しないものであ
れば特に限定されないが、遺伝子組み換え技術で安定し
て多量に発現させることができるタンパク質が好まし
い。具体的には、アフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーで容易に精製されることが知られているタンパク質
（以下、精製容易なタンパク質という）のほか、抗原タ
ンパク質の由来となる病原体とは異なる生物を通常の宿
主とする他の病原体由来の抗原タンパク質（以下、単に
他の病原体由来のタンパク質という）等である。これら
のタンパク質のうち、ＧＳＴ（Ｇｅｎｅ、６７、３１−
４０（１９８８））、マルトース結合タンパク質（以
下、ＭＢＰという；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５
９、１０６０６−１０６１３（１９８４））、β−ガラ
クトシダーゼ（Ｇｅｎｅ、６７、３１−４０（１９８
８））のような特定のタンパク質や糖などの化合物を担
持させ、該化合物との親和性を利用した担体を用いるア
フィニティーカラムクロマトグラフィーなどで精製され
るタンパク質は、精製の容易性のほか純度の高さの点で
も好ましく、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ガラクトース結合タンパ
ク質などがより好ましく、ＧＳＴおよびＭＢＰがとりわ
け好ましい。キャリアタンパク質の分子量の上限は１０
０キロＫｄ、好ましくは８０Ｋｄ、より好ましくは５０
Ｋｄであり、下限は１０Ｋｄ、好ましくは２５Ｋｄ、よ
り好ましくは４０Ｋｄであるのが遺伝子組み換え技術に
より融合タンパク質を発現させる場合には妥当である。
ここで用いられるキャリアタンパク質は、アミノ酸の欠
損・脱落・付加・挿入などによってキャリアタンパク質
の本来の機能が損なわれていたとしても、上記モノクロ
ーナル抗体と結合するエピトープがある限りにおいて特
に問題はない。
するモノクローナル抗体を得ることができ、かつ抗原タ
ンパク質による抗体検出を実質的に阻害しないものであ
れば特に限定されないが、遺伝子組み換え技術で安定し
て多量に発現させることができるタンパク質が好まし
い。具体的には、アフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーで容易に精製されることが知られているタンパク質
（以下、精製容易なタンパク質という）のほか、抗原タ
ンパク質の由来となる病原体とは異なる生物を通常の宿
主とする他の病原体由来の抗原タンパク質（以下、単に
他の病原体由来のタンパク質という）等である。これら
のタンパク質のうち、ＧＳＴ（Ｇｅｎｅ、６７、３１−
４０（１９８８））、マルトース結合タンパク質（以
下、ＭＢＰという；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５
９、１０６０６−１０６１３（１９８４））、β−ガラ
クトシダーゼ（Ｇｅｎｅ、６７、３１−４０（１９８
８））のような特定のタンパク質や糖などの化合物を担
持させ、該化合物との親和性を利用した担体を用いるア
フィニティーカラムクロマトグラフィーなどで精製され
るタンパク質は、精製の容易性のほか純度の高さの点で
も好ましく、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ガラクトース結合タンパ
ク質などがより好ましく、ＧＳＴおよびＭＢＰがとりわ
け好ましい。キャリアタンパク質の分子量の上限は１０
０キロＫｄ、好ましくは８０Ｋｄ、より好ましくは５０
Ｋｄであり、下限は１０Ｋｄ、好ましくは２５Ｋｄ、よ
り好ましくは４０Ｋｄであるのが遺伝子組み換え技術に
より融合タンパク質を発現させる場合には妥当である。
ここで用いられるキャリアタンパク質は、アミノ酸の欠
損・脱落・付加・挿入などによってキャリアタンパク質
の本来の機能が損なわれていたとしても、上記モノクロ
ーナル抗体と結合するエピトープがある限りにおいて特
に問題はない。
【０００８】本発明でＥＬＩＳＡ用プレートに固定化さ
れるモノクローナル抗体は、前記融合タンパク質を構成
するキャリアタンパク質に対するモノクローナル抗体で
あり、常法により得られるものでよい。このようなモノ
クローナル抗体の具体例としては本発明の日本住血吸虫
のＧＳＴに対するマウスモノクローナル抗体（後述する
実施例に記載されたものやＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、７０（３）、２９３−３０
４（１９９０）に記載されたもの）、ヒトのＧＳＴに対
するマウスモノクローナル抗体（前記公報や論文）、Ｍ
ＢＰに対するモノクローナル抗体、β−ガラクトシダー
ゼに対するモノクローナル抗体に対するモノクローナル
抗体などが例示される。これらのモノクローナル抗体の
中でも、ＧＳＴに対するモノクローナル抗体、ＭＢＰに
対するモノクローナル抗体、ガラクトース結合タンパク
質に対するモノクローナル抗体が好ましい。抗体のタイ
プは、抗原抗体反応の結合の強さからＩｇＧ型であるも
のが好ましい。
れるモノクローナル抗体は、前記融合タンパク質を構成
するキャリアタンパク質に対するモノクローナル抗体で
あり、常法により得られるものでよい。このようなモノ
クローナル抗体の具体例としては本発明の日本住血吸虫
のＧＳＴに対するマウスモノクローナル抗体（後述する
実施例に記載されたものやＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、７０（３）、２９３−３０
４（１９９０）に記載されたもの）、ヒトのＧＳＴに対
するマウスモノクローナル抗体（前記公報や論文）、Ｍ
ＢＰに対するモノクローナル抗体、β−ガラクトシダー
ゼに対するモノクローナル抗体に対するモノクローナル
抗体などが例示される。これらのモノクローナル抗体の
中でも、ＧＳＴに対するモノクローナル抗体、ＭＢＰに
対するモノクローナル抗体、ガラクトース結合タンパク
質に対するモノクローナル抗体が好ましい。抗体のタイ
プは、抗原抗体反応の結合の強さからＩｇＧ型であるも
のが好ましい。
【０００９】本発明のＥＬＩＳＡ用プレートは、いわゆ
るサンドイッチキャプチャー法に適用されるものであ
り、上述のモノクローナル抗体を固定させたプレートを
用い、他の条件は通常のサンドイッチキャプチャー法に
従えばよい。例えば、このプレートに後述する融合タン
パク質を接触させてモノクローナル抗体を融合タンパク
質とを抗原抗体反応により結合させることで、融合タン
パク質とモノクローナル抗体とをプレートに固定化させ
た本発明の酵素免疫定量法用プレートが得られる。この
プレートに患者血清を接触させ、更に酵素標識した抗体
を加え、基質により発色させ、その吸光度を測定する。
この方法において、感染症の診断をする場合、血清の由
来となる動物が、モノクローナル抗体の作製おいて免疫
動物と異種のものであれば、血清中の抗体の濃度が１０
μｇ／ｍｌ以下までは該モノクローナル抗体と血清中の
抗体との結合は見られない。通常の、ＥＬＩＳＡ法によ
る診断では、血清中の抗体濃度は１μｇ／ｍｌ程度であ
るため、モノクローナル抗体が感度を低下させる可能性
は殆どないといえる。また、この診断系では融合タンパ
ク質中のキャリアタンパク質に対する抗体を有する血清
では、キャリアタンパク質との抗原抗体反応がおこるた
め、融合タンパク質中の抗原タンパク質の抗体の有無の
みを知ることはできない。しかし、融合タンパク質の代
わりにキャリアタンパク質のみのコントロールでの吸光
度を、融合タンパク質を用いた系の吸光度から差し引け
ば、抗原タンパク質に抗体が結合したもののみを検出す
ることができる。
るサンドイッチキャプチャー法に適用されるものであ
り、上述のモノクローナル抗体を固定させたプレートを
用い、他の条件は通常のサンドイッチキャプチャー法に
従えばよい。例えば、このプレートに後述する融合タン
パク質を接触させてモノクローナル抗体を融合タンパク
質とを抗原抗体反応により結合させることで、融合タン
パク質とモノクローナル抗体とをプレートに固定化させ
た本発明の酵素免疫定量法用プレートが得られる。この
プレートに患者血清を接触させ、更に酵素標識した抗体
を加え、基質により発色させ、その吸光度を測定する。
この方法において、感染症の診断をする場合、血清の由
来となる動物が、モノクローナル抗体の作製おいて免疫
動物と異種のものであれば、血清中の抗体の濃度が１０
μｇ／ｍｌ以下までは該モノクローナル抗体と血清中の
抗体との結合は見られない。通常の、ＥＬＩＳＡ法によ
る診断では、血清中の抗体濃度は１μｇ／ｍｌ程度であ
るため、モノクローナル抗体が感度を低下させる可能性
は殆どないといえる。また、この診断系では融合タンパ
ク質中のキャリアタンパク質に対する抗体を有する血清
では、キャリアタンパク質との抗原抗体反応がおこるた
め、融合タンパク質中の抗原タンパク質の抗体の有無の
みを知ることはできない。しかし、融合タンパク質の代
わりにキャリアタンパク質のみのコントロールでの吸光
度を、融合タンパク質を用いた系の吸光度から差し引け
ば、抗原タンパク質に抗体が結合したもののみを検出す
ることができる。
【００１０】本発明の好ましい実施態様は、次の通りで
ある。 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース
結合タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼに対する
モノクローナル抗体が固定化されている酵素免疫定量法
用プレートにおいて、該モノクローナル抗体が、抗原タ
ンパク質とキャリアタンパク質とから本質的に構成され
る融合タンパク質と、該キャリアタンパク質を介して抗
原抗体反応により結合していることを特徴を有する酵素
免疫定量法用プレート。 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはマルト
ース結合タンパク質に対するモノクローナル抗体が固定
化されている酵素免疫定量法用プレートにおいて、該モ
ノクローナル抗体が、抗原タンパク質とキャリアタンパ
ク質とから本質的に構成される融合タンパク質と、該キ
ャリアタンパク質を介して抗原抗体反応により結合して
いることを特徴を有する酵素免疫定量法用プレート。 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対するモノ
クローナル抗体が固定化されている酵素免疫定量法用プ
レートにおいて、該モノクローナル抗体が、抗原タンパ
ク質とキャリアタンパク質とから本質的に構成される融
合タンパク質と、該キャリアタンパク質を介して抗原抗
体反応により結合していることを特徴を有する酵素免疫
定量法用プレート。 モノクローナル抗体が固定化されている酵素免疫定量
法用プレートにおいて、該モノクローナル抗体が、抗原
タンパク質とキャリアタンパク質とから本質的に構成さ
れる分子量約１５〜２５キロダルトンの融合タンパク質
と、該キャリアタンパク質を介して抗原抗体反応により
結合していることを特徴を有する酵素免疫定量法用プレ
ート。 モノクローナル抗体が固定化されている酵素免疫定量
法用プレートにおいて、該モノクローナル抗体が、ＨＩ
Ｖの抗原タンパク質とキャリアタンパク質とから本質的
に構成される融合タンパク質と、該キャリアタンパク質
を介して抗原抗体反応により結合していることを特徴を
有する酵素免疫定量法用プレート。
ある。 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース
結合タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼに対する
モノクローナル抗体が固定化されている酵素免疫定量法
用プレートにおいて、該モノクローナル抗体が、抗原タ
ンパク質とキャリアタンパク質とから本質的に構成され
る融合タンパク質と、該キャリアタンパク質を介して抗
原抗体反応により結合していることを特徴を有する酵素
免疫定量法用プレート。 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはマルト
ース結合タンパク質に対するモノクローナル抗体が固定
化されている酵素免疫定量法用プレートにおいて、該モ
ノクローナル抗体が、抗原タンパク質とキャリアタンパ
ク質とから本質的に構成される融合タンパク質と、該キ
ャリアタンパク質を介して抗原抗体反応により結合して
いることを特徴を有する酵素免疫定量法用プレート。 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに対するモノ
クローナル抗体が固定化されている酵素免疫定量法用プ
レートにおいて、該モノクローナル抗体が、抗原タンパ
ク質とキャリアタンパク質とから本質的に構成される融
合タンパク質と、該キャリアタンパク質を介して抗原抗
体反応により結合していることを特徴を有する酵素免疫
定量法用プレート。 モノクローナル抗体が固定化されている酵素免疫定量
法用プレートにおいて、該モノクローナル抗体が、抗原
タンパク質とキャリアタンパク質とから本質的に構成さ
れる分子量約１５〜２５キロダルトンの融合タンパク質
と、該キャリアタンパク質を介して抗原抗体反応により
結合していることを特徴を有する酵素免疫定量法用プレ
ート。 モノクローナル抗体が固定化されている酵素免疫定量
法用プレートにおいて、該モノクローナル抗体が、ＨＩ
Ｖの抗原タンパク質とキャリアタンパク質とから本質的
に構成される融合タンパク質と、該キャリアタンパク質
を介して抗原抗体反応により結合していることを特徴を
有する酵素免疫定量法用プレート。
【００１１】
【発明の効果】本発明のプレートを用いれば、抗原タン
パク質を代えても、わざわざ対応するモノクローナル抗
体を新たに作製することなく、きわめて簡便にサンドイ
ッチＥＬＩＳＡ法を行うことができる。また本発明のプ
レートは、簡単・迅速・正確な感染症の診断を可能にす
るばかりでなく、その他のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を
用いた臨床検査測定試薬や癌などの基礎研究用試薬など
としても有用である。また、融合タンパク質の抗原タン
パク質を複数とすることで、より検出感度を向上させる
ことができると期待される。
パク質を代えても、わざわざ対応するモノクローナル抗
体を新たに作製することなく、きわめて簡便にサンドイ
ッチＥＬＩＳＡ法を行うことができる。また本発明のプ
レートは、簡単・迅速・正確な感染症の診断を可能にす
るばかりでなく、その他のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を
用いた臨床検査測定試薬や癌などの基礎研究用試薬など
としても有用である。また、融合タンパク質の抗原タン
パク質を複数とすることで、より検出感度を向上させる
ことができると期待される。
【００１２】
【実施例】以下、本発明を参考例および実施例によって
具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明の
範囲を限定するものではない。 （実施例） （１）ＥＬＩＳＡ用抗原タンパク質の調製 プライマー１（GCTAGAAGGATCGAGAGATGGGTGCGTCA）、プ
ライマー２（GCTGACACAGGATCCACAGCAATCAGGTC）、プラ
ーマー３（ATAGTGCAGAATTCATCCAGGGGCAA）およびプラー
マー４（GTTTTGGCTGAATTCGCAATGAGCCAA）を合成した。
プライマー１と２は、ＢａｎＨＩサイトを有し、プライ
マー３と４はＥｃｏＲＩサイトを有する。プライマー１
と３およびプラーマー２と４を組み合わせたＰＣＲ法に
より、ＨＩＶのＬＴＲ配列を除く全てのＤＮＡ配列を含
むプラスミドｐＢＨ１０（Ｎａｔｕｒｅ、３１３、２７
７−２８９（１９８５年））から、ＨＩＶ由来のＤＮＡ
のクローニングを行い、得られたＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩとＥｃｏＲＩとで切断した。ＨＩＶのコアタンパ
ク質Ｐ１７をコードするＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片は、４２６ｂｐであり、Ｐ２４をコードする
ＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片は、７２８ｂ
ｐであった。この断片をそれぞれ、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐ
ＧＥＸ−２Ｔ（共にファルマシア社製：いずれのプラス
ミドにもＧＳＴをコードするＤＮＡが含まれている）の
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、常法により連
結して得られたプラスミドをそれぞれｐＧＥＸ−Ｐ１７
およびｐＧＥＸ−Ｐ２４と命名した。また、特開平４−
１５８７８７号公報第５頁左下段第５〜１５行目に記載
されているＨＩＶのエンドヌクレアーゼをコードするＤ
ＮＡのなかの約８００ｂｐ（このＤＮＡ断片は、両端が
平滑末端となっている）をｐＧＥＸ−３ＸのＳｍａＩサ
イトに挿入し、常法により連結して得られたプラスミド
をｐＧＥＸ−ＩＮ３２と命名した。このようにして得ら
れた３種類のプラスミドｐＧＥＸ−Ｐ１７、ｐＧＥＸ−
Ｐ２４およびｐＧＥＸ−ＩＮ３２は、それぞれＨＩＶ由
来の抗原タンパク質の一部をコードするＤＮＡの５’側
にＧＳＴをコードするＤＮＡが連結したハイブリッドＤ
ＮＡを有するものである。
具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明の
範囲を限定するものではない。 （実施例） （１）ＥＬＩＳＡ用抗原タンパク質の調製 プライマー１（GCTAGAAGGATCGAGAGATGGGTGCGTCA）、プ
ライマー２（GCTGACACAGGATCCACAGCAATCAGGTC）、プラ
ーマー３（ATAGTGCAGAATTCATCCAGGGGCAA）およびプラー
マー４（GTTTTGGCTGAATTCGCAATGAGCCAA）を合成した。
プライマー１と２は、ＢａｎＨＩサイトを有し、プライ
マー３と４はＥｃｏＲＩサイトを有する。プライマー１
と３およびプラーマー２と４を組み合わせたＰＣＲ法に
より、ＨＩＶのＬＴＲ配列を除く全てのＤＮＡ配列を含
むプラスミドｐＢＨ１０（Ｎａｔｕｒｅ、３１３、２７
７−２８９（１９８５年））から、ＨＩＶ由来のＤＮＡ
のクローニングを行い、得られたＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩとＥｃｏＲＩとで切断した。ＨＩＶのコアタンパ
ク質Ｐ１７をコードするＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片は、４２６ｂｐであり、Ｐ２４をコードする
ＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片は、７２８ｂ
ｐであった。この断片をそれぞれ、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐ
ＧＥＸ−２Ｔ（共にファルマシア社製：いずれのプラス
ミドにもＧＳＴをコードするＤＮＡが含まれている）の
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、常法により連
結して得られたプラスミドをそれぞれｐＧＥＸ−Ｐ１７
およびｐＧＥＸ−Ｐ２４と命名した。また、特開平４−
１５８７８７号公報第５頁左下段第５〜１５行目に記載
されているＨＩＶのエンドヌクレアーゼをコードするＤ
ＮＡのなかの約８００ｂｐ（このＤＮＡ断片は、両端が
平滑末端となっている）をｐＧＥＸ−３ＸのＳｍａＩサ
イトに挿入し、常法により連結して得られたプラスミド
をｐＧＥＸ−ＩＮ３２と命名した。このようにして得ら
れた３種類のプラスミドｐＧＥＸ−Ｐ１７、ｐＧＥＸ−
Ｐ２４およびｐＧＥＸ−ＩＮ３２は、それぞれＨＩＶ由
来の抗原タンパク質の一部をコードするＤＮＡの５’側
にＧＳＴをコードするＤＮＡが連結したハイブリッドＤ
ＮＡを有するものである。
【００１３】大腸菌ＭＶ１１９０株のコンピテント細胞
に上記で得た３種類の組み換えプラスミドを導入し、Ｐ
１７、Ｐ２４、ＩＮ３２の各遺伝子が導入された形質転
換大腸菌３種類を得た。更に同様の操作によりＧＳＴの
みを有する組み換えプラスミドで形質転換した形質転換
大腸菌を得た。続いて、このようにして得た形質転換大
腸菌４種類の各１コロニーを５０μｇ／ｍｌのアンプシ
リンを含むＬＢ培地２５ｍｌで一晩振盪培養後、更に１
ｌの同ＬＢ培地で３時間振盪培養（３７℃）した後、イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、
ＩＰＴＧという）濃度が１ｍＭになるように加え、更に
４時間培養し続けた。この培養液を７，０００×ｇで１
０分間遠心分離し、各形質転換大腸菌を回収し、リン酸
緩衝生理食塩水溶液（以下、ＰＢＳという；ｐＨ７．
５）で２回洗浄した。回収し洗浄された各形質転換大腸
菌を最終濃度０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカラ
イ・テスク社製）を加えた４ｍｌのＰＢＳに懸濁し、３
０秒間５回超音波破砕した。更に、１０，０００×ｇ、
１０分間遠心分離し、その上清をグルタチオンセファロ
ースアフィニティークロマトグラフィー（Ｇｌｕｔａｃ
ｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ使用：ファルマシ
ア社製）により、形質転換大腸菌が発現した各融合タン
パク質を粗精製した。バイオ・ラッド社製のタンパク質
量測定キットを用いて融合タンパク質量５００μｇ／ｍ
ｌになるように、各粗融合タンパク質をＰＢＳで希釈
し、サンドイッチＥＬＩＳＡ用抗原タンパク質を得た。
に上記で得た３種類の組み換えプラスミドを導入し、Ｐ
１７、Ｐ２４、ＩＮ３２の各遺伝子が導入された形質転
換大腸菌３種類を得た。更に同様の操作によりＧＳＴの
みを有する組み換えプラスミドで形質転換した形質転換
大腸菌を得た。続いて、このようにして得た形質転換大
腸菌４種類の各１コロニーを５０μｇ／ｍｌのアンプシ
リンを含むＬＢ培地２５ｍｌで一晩振盪培養後、更に１
ｌの同ＬＢ培地で３時間振盪培養（３７℃）した後、イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、
ＩＰＴＧという）濃度が１ｍＭになるように加え、更に
４時間培養し続けた。この培養液を７，０００×ｇで１
０分間遠心分離し、各形質転換大腸菌を回収し、リン酸
緩衝生理食塩水溶液（以下、ＰＢＳという；ｐＨ７．
５）で２回洗浄した。回収し洗浄された各形質転換大腸
菌を最終濃度０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカラ
イ・テスク社製）を加えた４ｍｌのＰＢＳに懸濁し、３
０秒間５回超音波破砕した。更に、１０，０００×ｇ、
１０分間遠心分離し、その上清をグルタチオンセファロ
ースアフィニティークロマトグラフィー（Ｇｌｕｔａｃ
ｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ使用：ファルマシ
ア社製）により、形質転換大腸菌が発現した各融合タン
パク質を粗精製した。バイオ・ラッド社製のタンパク質
量測定キットを用いて融合タンパク質量５００μｇ／ｍ
ｌになるように、各粗融合タンパク質をＰＢＳで希釈
し、サンドイッチＥＬＩＳＡ用抗原タンパク質を得た。
【００１４】（２）モノクローナル抗体の調製 ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）で大腸菌ＭＶ１１９０株
を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を免疫動物であ
るマウスに投与し、最終免疫後、５日経過後にリンパ球
を採取した。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８／６５３株を用い、常法により細胞融合を行い、得ら
れたハイブリドーマ株から常法に従って、目的とするハ
イブリドーマ株を選択し、常法に従って、ＧＳＴに対す
るモノクローナル抗体を得た。
を形質転換し、得られた形質転換大腸菌を免疫動物であ
るマウスに投与し、最終免疫後、５日経過後にリンパ球
を採取した。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ
８／６５３株を用い、常法により細胞融合を行い、得ら
れたハイブリドーマ株から常法に従って、目的とするハ
イブリドーマ株を選択し、常法に従って、ＧＳＴに対す
るモノクローナル抗体を得た。
【００１５】（３）サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＨ
ＩＶ抗体の検出 上記モノクローナル抗体は、ファルマシア社製の抗体精
製キットを用いて精製され、該モノクローナル抗体は１
ｍｇ／ｍｌになるように最終濃度０．０５％のＮａＮ3
を含むＰＢＳで希釈した。さらに使用時には該モノクロ
ーナル抗体を炭酸緩衝液（水１ｌ中に１．６ｇ Ｎａ2Ｃ
Ｏ3、２．９ｇ ＮａＨＣＯ3、０．１６ｇ ＮａＮ3を含
む）で１μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈して各ウェルに５
０μｌずつ加え、４℃で一晩静置した。ＥＬＩＳＡプレ
ートを０．０５％のＴｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎという）で３回洗浄した後、０．５
％のオブアルブミン、２％のスキムミルクを含むＰＢＳ
を各ウェルに１５０μｌずつ加え、室温で３時間静置
し、ブロッキングした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄
後、前記の融合タンパク質をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで各１
μｇ／ｍｌになるように希釈し、各ウェルに５０μｌ加
え、４℃で一晩静置した。また、融合タンパク質の代わ
りに、ＧＳＴのみを加えた系をコントロールとした。測
定サンプルは、ＨＩＶ感染者３４名から１４９サンプル
の血清、および４６名の健康人の４６サンプル血清を用
いた。各血清は、０．５％ 牛血清アルブミン、０．５
％ オブアルブミン、２％ スキムミルクを含むＰＢＳで
１：１００に希釈した後、４℃で一晩非特異的な抗体を
吸収させた。更に使用直前に６０℃で１時間加熱処理を
加えたものを用いた。
ＩＶ抗体の検出 上記モノクローナル抗体は、ファルマシア社製の抗体精
製キットを用いて精製され、該モノクローナル抗体は１
ｍｇ／ｍｌになるように最終濃度０．０５％のＮａＮ3
を含むＰＢＳで希釈した。さらに使用時には該モノクロ
ーナル抗体を炭酸緩衝液（水１ｌ中に１．６ｇ Ｎａ2Ｃ
Ｏ3、２．９ｇ ＮａＨＣＯ3、０．１６ｇ ＮａＮ3を含
む）で１μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈して各ウェルに５
０μｌずつ加え、４℃で一晩静置した。ＥＬＩＳＡプレ
ートを０．０５％のＴｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎという）で３回洗浄した後、０．５
％のオブアルブミン、２％のスキムミルクを含むＰＢＳ
を各ウェルに１５０μｌずつ加え、室温で３時間静置
し、ブロッキングした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄
後、前記の融合タンパク質をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで各１
μｇ／ｍｌになるように希釈し、各ウェルに５０μｌ加
え、４℃で一晩静置した。また、融合タンパク質の代わ
りに、ＧＳＴのみを加えた系をコントロールとした。測
定サンプルは、ＨＩＶ感染者３４名から１４９サンプル
の血清、および４６名の健康人の４６サンプル血清を用
いた。各血清は、０．５％ 牛血清アルブミン、０．５
％ オブアルブミン、２％ スキムミルクを含むＰＢＳで
１：１００に希釈した後、４℃で一晩非特異的な抗体を
吸収させた。更に使用直前に６０℃で１時間加熱処理を
加えたものを用いた。
【００１６】融合タンパク質またはＧＳＴを加え、一晩
放置したプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、
さきに用意した希釈したサンプルをこのプレートに５０
μｌずつ加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、Ｐ
ＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いでアルカリフォス
ファターゼ標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体をＰＢ
Ｓ／Ｔｗｅｅｎで１：１０，０００で希釈後、各分析ウ
ェルに５０μｌずつ加え、３７℃で１時間反応させた。
反応後のプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した
後、基質緩衝液（水１ｌに、最終濃度１ｍｇ／ｍｌのｐ
−ニトロフェノールフォスフェイト）を各分析ウェルに
１００μｌずつ加え、室温で４０分間反応後、マイクロ
プレート用の吸光度測定装置を用いて、各ウェルの４０
５ｎｍにおける吸光度を測定し、抗原抗体反応の有無を
調べた。
放置したプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、
さきに用意した希釈したサンプルをこのプレートに５０
μｌずつ加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、Ｐ
ＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次いでアルカリフォス
ファターゼ標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体をＰＢ
Ｓ／Ｔｗｅｅｎで１：１０，０００で希釈後、各分析ウ
ェルに５０μｌずつ加え、３７℃で１時間反応させた。
反応後のプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した
後、基質緩衝液（水１ｌに、最終濃度１ｍｇ／ｍｌのｐ
−ニトロフェノールフォスフェイト）を各分析ウェルに
１００μｌずつ加え、室温で４０分間反応後、マイクロ
プレート用の吸光度測定装置を用いて、各ウェルの４０
５ｎｍにおける吸光度を測定し、抗原抗体反応の有無を
調べた。
【００１７】ここで用いたアルカリフォスファターゼ標
識ヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体は用いた条件下では
固定化してあるマウスの該モノクローナル抗体はまった
く認識していなかった。このことから観察された抗原抗
体反応はすべて血清中に含まれる抗体の反応を示してい
るといえる。各融合タンパク質ごとの各サンプルの吸光
度の平均値とその標準偏差を表１に示した。
識ヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体は用いた条件下では
固定化してあるマウスの該モノクローナル抗体はまった
く認識していなかった。このことから観察された抗原抗
体反応はすべて血清中に含まれる抗体の反応を示してい
るといえる。各融合タンパク質ごとの各サンプルの吸光
度の平均値とその標準偏差を表１に示した。
【００１８】
【表１】
【００１９】表１から、各血清サンプルの吸光度を測定
したところ、ＧＳＴのみのコントロールにも反応する血
清があることが判る。このことから測定された吸光度に
は、ＧＳＴは抗原タンパク質への反応のほかにＧＳＴに
対する反応も含まれていると考えられる。即ち、実際の
各抗原タンパク質との反応は、各吸光度からコントロー
ルとしてのＧＳＴのみの系での吸光度を差し引いた値と
して得られる考えられる。実際、各サンプルのＧＳＴに
対する反応性を差し引いた値を表２に示す。
したところ、ＧＳＴのみのコントロールにも反応する血
清があることが判る。このことから測定された吸光度に
は、ＧＳＴは抗原タンパク質への反応のほかにＧＳＴに
対する反応も含まれていると考えられる。即ち、実際の
各抗原タンパク質との反応は、各吸光度からコントロー
ルとしてのＧＳＴのみの系での吸光度を差し引いた値と
して得られる考えられる。実際、各サンプルのＧＳＴに
対する反応性を差し引いた値を表２に示す。
【００２０】
【表２】
【００２１】表２から、健常者と感染者とでは明らかな
差異が見られ、擬陽性が出現する可能性がきわめて低い
ことが判った。
差異が見られ、擬陽性が出現する可能性がきわめて低い
ことが判った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 小島 朝人 埼玉県久喜市東１−28−16 (72)発明者 佐藤 隆則 神奈川県川崎市川崎区夜光１−２−１ 日 本ゼオン株式会社内
Claims (1)
- 【請求項１】 モノクローナル抗体が固定化されている
酵素免疫定量法用プレートにおいて、該モノクローナル
抗体が、抗原タンパク質とキャリアタンパク質とから本
質的に構成される融合タンパク質と、該キャリアタンパ
ク質を介して抗原抗体反応により結合していることを特
徴を有する酵素免疫定量法用プレート。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6200232A JPH0862217A (ja) | 1994-08-01 | 1994-08-01 | 酵素免疫定量法用プレート |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6200232A JPH0862217A (ja) | 1994-08-01 | 1994-08-01 | 酵素免疫定量法用プレート |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0862217A true JPH0862217A (ja) | 1996-03-08 |
Family
ID=16421013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6200232A Pending JPH0862217A (ja) | 1994-08-01 | 1994-08-01 | 酵素免疫定量法用プレート |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0862217A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009082798A1 (en) * | 2008-01-02 | 2009-07-09 | Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De Minas Gerais - Fapemig | Method and kit for quantifying of allergen-especific human igg subclasses for the control and attendance of specific immunotherapy |
| CN101936998A (zh) * | 2010-08-19 | 2011-01-05 | 武汉中博生物股份有限公司 | 犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒 |
| CN101936997A (zh) * | 2010-08-19 | 2011-01-05 | 武汉中博生物股份有限公司 | 人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒 |
| CN101968483A (zh) * | 2009-07-27 | 2011-02-09 | 深圳市菲鹏生物股份有限公司 | 一步半双抗原夹心免疫检测法 |
| CN103777021A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法 |
-
1994
- 1994-08-01 JP JP6200232A patent/JPH0862217A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009082798A1 (en) * | 2008-01-02 | 2009-07-09 | Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De Minas Gerais - Fapemig | Method and kit for quantifying of allergen-especific human igg subclasses for the control and attendance of specific immunotherapy |
| CN101968483A (zh) * | 2009-07-27 | 2011-02-09 | 深圳市菲鹏生物股份有限公司 | 一步半双抗原夹心免疫检测法 |
| CN101936998A (zh) * | 2010-08-19 | 2011-01-05 | 武汉中博生物股份有限公司 | 犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒 |
| CN101936997A (zh) * | 2010-08-19 | 2011-01-05 | 武汉中博生物股份有限公司 | 人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒 |
| CN103777021A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 狂犬疫苗糖蛋白含量的检测方法 |
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