JP4063405B2 - 多価被検物質の免疫化学的測定 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検物質を定性的または定量的に検出するための免疫化学的方法において、第一および第二の結合パートナーを被検物質と接触させ、被検物質への結合パートナーの結合を既知方法によって検出する方法に関する。本発明によれば、両結合パートナーは、同一の宿主内において融合タンパク質の発現のために異なるベクター(V1およびV2)を用いて、すなわち第一の結合パートナーはベクターV1中で融合タンパク質F1として発現させ、第二の結合パートナーはベクターV2中で融合タンパク質F2として発現させて、組換えにより調製される。同時に数種の被検物質の測定にも使用できるこの新規な方法の利点は、その感度および特異性が既知の方法の場合に比べて優れているという事実にある。
【0002】
【従来の技術】
疾患を誘発する物質、たとえば、ウイルス、細菌、寄生虫、アレルゲン、自己抗原または特定の医薬に対する特異的抗体の形成を伴う疾患の診断のための慣用の免疫学的方法は、疾患誘発物質の抗原性構造と複合体を形成するこれらの抗体の能力に基づくものである。
【0003】
ある種のイムノアッセイ法においては、たとえば、特異的抗体(被検抗体)の含量を試験するサンプルを、疾患誘発物質の抗原性構造を適当な既知の支持材料上に固定化してその抗原性構造と接触させる。サンプル中に存在する被検抗体は、支持材料上に固定化された疾患誘発物質の抗原性構造に免疫複合体として結合し、ついで検出される。検出抗体、またはサンプルの被検抗体もしく被検物質それ自体と複合体を形成できる他の特異的受容体(たとえば、プロテインA)を検出に使用することができる。
【0004】
一般に、検出試薬は結合した抗体の量の測定を可能にする標識をもっている。一般的な標識の例には、放射活性同位元素、酵素、蛍光物質、リン光物質または化学発光物質、安定な不対電子を有する物質、赤血球、ラテックス粒子、磁性粒子および金属ゾルがある。
これらの方法を実施するためには、均一および不均一(単一工程および多重工程)試験の両実施態様が知られている。不均一実施態様の場合は、方法の各工程は分離過程(洗浄工程)で終結する。
しかしながら不均一イムノアッセイの場合、実施が極めて容易な単一工程法は疾患マーカーのすべての検出には適当ではない。技術的理由から、2工程または多重工程法を用いなければならないことが多い。
【0005】
二重抗原サンドイッチイムノアッセイまたは抗体ブリッジ試験と呼ばれる方法が知られている。これらの方法では、1種または2種以上の固相抗原、検出される特異的被検物質(単数または複数)、および1種または2種以上の標識された接合抗原を互いに接触させる。特異的被検物質の存在下には、接合抗原上の標識によって測定できる複合体が形成される。ドメインが多数のコピー中に存在する被検物質の抗原結合ドメインによって架橋される抗原の均一な提示は、複合体の形成速度および安定性に重要である。
【0006】
使用される抗原が、天然に存在する原核細胞もしくは真核細胞または組換えにより改変された原核細胞もしくは真核細胞から単離されるか、あるいは化学合成により得られる実施態様は、本技術分野の熟練者には周知である。これらの実施態様は、とくに被検物質の両結合パートナーが同一宿主から単離された場合に、これらの大部分の場合で2つの結合パートナーの抗原提示、グリコシル化の程度およびコンフォーメーションが酷似することから、極めて感度が高い。しかしながら、これらの実施態様の場合の欠点は、固定化相および標識相の両者に存在する宿主の特異的構成成分および/または不純物が、これらの宿主の特異的構成成分および/または不純物に対する受容体の存在の可能性により偽陽性反応を招くことであり得ることである。
【0007】
結合パートナーまたはそれらの抗原的に活性な残基を含まない宿主の特異的構成成分および/または不純物を添加することによりこの干渉を抑制する方法は本技術分野の熟練者には周知である。しかしながら、この干渉の抑制は低グレードの非特異的反応の場合にしか成功しない。実質的に大量の干渉抑制成分の使用が要求される強力な非特異的干渉の場合には、しかしながら、特異的なシグナルも強力に阻害されるという欠点がある。
【0008】
EP-0 307 149 には、宿主の特異的構成成分および/または不純物による干渉を可能な最大限度まで回避するための他の方法が開示されている。この特許には異なる宿主生物体から単離される組換えにより調製されるタンパク質に基づく二重抗原サンドイッチ酵素イムノアッセイが記載されている。この方法の利点は均一な不純物による干渉は極めて少ないかまたは全くない一方、用いられる2つの受容体、R1およびR2が異なる宿主生物体中で異なるフォールディングを受け、異なって提示されるという欠点がある。これは検出すべき被検物質との特異性の低い反応を招来し、その結果、二重抗原サンドイッチ酵素イムノアッセイの感度を低下させる。
【0009】
二重抗原サンドイッチ酵素イムノアッセイにおける非特異的干渉の回避の可能性に関する限りでの他の選択は熟練者には周知のように、一方では組換えにより調製されたタンパク質から、他方では合成により調製されたペプチドから試験を構成することである。この場合も、2つの受容体R1およびR2の異なるフォールディングと提示により感度の低下を生じる。
【0010】
宿主システムにおける組換えタンパク質の発現については多様な選択が熟練者に周知である。既知の方法(Current Protocols of Molecular Biology, Wiley Interscience, 1995, 補遺30)は、所望の宿主中での複製が可能で、さらに、ベクター含有細胞の選択を可能にする選択可能な性質、たとえば抗生物質抵抗性をコードするいわゆるベクターに所望の抗原をコードするDNA配列をクローン化するために使用される。ベクターはまた、組換え抗原の遺伝子の5′末端に、宿主のRNAポリメラーゼ、または他の方法で利用されるRNAポリメラーゼが組換え抗原のmRNAのコピーを開始させることができる配列のプロモーター配列も包含しなければならない。理想的には、このプロモーターは、たとえばlacリプレッサーシステムにIPTGを添加することにより達成できるように特異的に誘導することが可能である。ベクターは、mRNAの翻訳を終結させるDNA配列も含有しなければならない。
【0011】
mRNAにおける翻訳開始は、この場合は、ベクターシステムによってまたは組換え抗原DNA自体によって提供されることができる。この関連で、熟練者は異種残基のないタンパク質の成熟発現を融合タンパク質の発現から区別する。この例では融合タンパク質はベクターによってコードされるペプチドまたはタンパク質(融合残基)と組換え抗原(抗原残基)から構成される融合生成物であるとして理解される。
診断における使用のための成熟発現の利点は、発現した抗原が非特異的反応を誘発する可能性がある融合残基を伴わないことである。欠点は、宿主に対して異種のタンパク質の発現の強度が極めて低いことが多く、通常、成熟タンパク質の精製に親和性クロマトグラフィーを使用できる可能性がないことである。
【0012】
これに対し、異種タンパク質を宿主内で容易に発現されるタンパク質とともに融合タンパク質として発現させると発現率の上昇を生じる。理想的には、発現率の上昇に加えて、融合残基は、親和性クロマトグラフィーによる精製の可能性も付与する。しかしながら、融合残基に結合親和性を有する物質がこの残基に結合する結果として、融合残基で望ましくない反応が起こるという欠点がある。
実施に際しては、したがって、診断試験系において非特異的反応を生じるタンパク質プレパレーションがいずれの発現方法によっても、すなわち融合残基の存在により、また融合残基の不存在下には、たとえば親和性クロマトグラフィーによる抗原の有効な精製法のない方法のいずれかによって得られることが多い。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はしたがって、組換えによって調製される結合パートナーの使用を包含する診断試験システムの能率の改善という目的に基づくものである。
驚くべきことに、2またはそれ以上の組換えにより調製した結合パートナーを用いる場合、これらの結合パートナーを融合タンパク質の発現のために異なるベクターを用いて同一の宿主内で調製させると、高い特異性と、高い有用な感度を有する免疫化学的試験システムの構築が可能であることが見出されたのである。このようなシステムは、特異性および有用な感度に関して、2またはそれ以上の結合パートナーが融合タンパク質の発現のために同一のベクターを用いて同一の宿主内で調製された既知の実施態様に比較して著しく優れている。たとえば融合タンパク質の発現のために異なるベクターを用い同一の宿主内で調製された2種の結合パートナーF1およびF2を用いる二重抗原サンドイッチ酵素イムノアッセイは、F1およびF2が融合タンパク質の発現のために同一のベクターを用いて同一の宿主内で調製された二重抗原サンドイッチ酵素イムノアッセイに比較して感度が著しく優れ、はるかに特異的であることがわかる。
【0014】
本発明の意味の範囲内において、検出される被検物質は、たとえば疾患誘導物質もしくはワクチンによって誘導される抗体、多重ハプテンもしくは多価タンパク質、たとえば疾患誘導物質それ自体とすることができる。
したがって、基盤となる目的は、組換えによって調製される結合パートナーの有利な使用を可能にすると同時に、一方では優れた診断効率を達成する診断方法を提供することにより達成される。新規な方法は、試験の特異性に関し上述した欠点を伴うことなく、この融合タンパク質の使用を可能にする。
【0015】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、第一および第二の結合パートナーを被検物質と接触させ、被検物質への結合パートナーの結合を既知の方法によって検出するサンプル中の被検物質を定性的または定量的に検出する免疫化学的方法において、2種の結合パートナーを同一の宿主内において融合タンパク質の発現のために異なるベクター(V1およびV2)を用いて組換えにより調製し、第一の結合パートナーはベクターV1中に融合タンパク質F1として発現させ、第二の結合パートナーはベクターV2中に融合タンパク質F2として発現させることからなる方法に関する。
【0016】
【発明の実施の形態】
この場合の宿主は細菌または酵母とすることが好ましい。
とくに好ましい実施態様においては、宿主生物体として大腸菌を使用する。
好ましい被検物質は抗体であり、とくに好ましい抗体はウイルス、細菌および寄生虫に対する抗体である。
上述の免疫化学的方法が、異なる被検物質、たとえばHTV1およびHTV2または、HTV1および/もしくはHTV2とHCVの同時測定に使用できるという事実は、熟練者には周知の通りである。このような実施態様も本発明に包含される。
【0017】
本発明の意味の範囲内において、結合パートナーは被検物質に対する1または2以上の生物親和性結合部位を有する特異的結合パートナーである。結合パートナーまたはこれらの結合パートナーの成分は、固相に直接または生物親和性相互作用によって結合させることができる。この場合、固相としては、マイクロタイトレーションプレート、磁性粒子、ラテックス粒子、または化学マトリックスを含有する試験エレメント、たとえば繊維もしくは膜を含有する試験モジュールを使用することが好ましい。結合パートナーまたはこれらの結合パートナーの成分はまた、直接標識すること(接合体)、または生物親和性相互作用によって標識に結合させることができる。
【0018】
結合パートナーと標識から構成されるこのような接合体の製造方法は熟練者には周知の通りである。標識は酵素(たとえば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはウレアーゼ)またはハプテン(たとえば、ビオチンまたはジゴキシゲニン)または蛍光化合物(たとえばFITC)またはルミネッセンス化合物(たとえばアクリジニウムエステルまたは金属/キレート錯化合物)または金属ゾル(たとえば金)または粒子(たとえばラテックス)とすることができる。このような接合体はたとえば、化学試薬を用いる連結によりまたは生物親和性相互作用により、それらの出発材料の生物親和性機能を維持したまま調製することができる。ハイブリッド分子はまた化学合成、ハイブリドーマ技術または遺伝子操作法によって生成させることができる。
【0019】
本発明はまた、上述の方法に使用するための試薬に関する。
被検物質を特異的に検出するための結合パートナーの組合せは、
F1:宿主システムAからの融合タンパク質であって、融合タンパク質の発現にはベクターV1を用い、方法M1により精製された融合タンパク質、
F2:宿主システムAからの融合タンパク質であって、融合タンパク質の発現にはベクターV2を用い方法M1またはM2により精製された融合タンパク質、である。
【0020】
被検物質を特異的に検出するための結合パートナーの好ましい組合せは、
F1:宿主システムAからの融合タンパク質であって、融合タンパク質の発現にはベクターV1を用い、方法M1により精製された融合タンパク質、
F2:宿主システムAからの融合タンパク質であって、融合タンパク質の発現にはベクターV2を用い方法M2によって精製された融合タンパク質、
である。
【0021】
被検物質を特異的に検出するための結合パートナーのとくに好ましい組合せは
F1:宿主システムAからの生理的緩衝液に不溶性の融合タンパク質であって融合タンパク質の発現にはベクターV1を用い、方法M1によって精製された融合タンパク質、
F2:宿主システムAからの生理的緩衝液に可溶性の融合タンパク質であって融合タンパク質の発現にはベクターV2を用い、方法M2によって精製された融合タンパク質、
である。
【0022】
本発明の意味の範囲内において、宿主システムは融合タンパク質を発現するベクターでトランスフォーム可能で、ついでベクターの存在について選択できて、しかもこのベクターを複製し、ベクター中にクローン化されている組換え遺伝子の転写および翻訳が可能な生物体である。
本発明の意味の範囲内において、融合タンパク質の発現のためのベクターは、適当な宿主内で複製が可能で、ベクターを含有する宿主生物体の選択を可能にする選択可能な性質をコードする核酸である。融合タンパク質を発現させるためのベクターは理想的には、その下流に組換え抗原の遺伝子をクローン化することが可能で、したがって組換え抗原の特異的な転写および翻訳を可能にする誘導性のプロモーターを有する。
【0023】
本発明の意味の範囲内において、融合タンパク質の発現のための好ましいベクターは、各宿主内で容易に発現できる構成部分に融合する標的タンパク質を発現する。
本発明の意味の範囲内において、融合タンパク質の発現のためのとくに好ましいベクターは、各宿主内で容易に発現できる2つの異なる構成部分に融合する標的タンパク質を発現する。
本発明の意味の範囲内において、融合タンパク質の発現のためのとくに極めて好ましいベクターは、各宿主内で容易に発現できる2つの異なる構成部分であって、それぞれの相当する構成部分は各融合タンパク質の異なる精製方法での精製を可能にする構成部分に融合する標的タンパク質を発現する。
【0024】
本発明の意味の範囲内において精製方法とは、宿主システム内で発現する標的タンパク質を純粋な形に調製することができる方法である。分泌される抗原が調製されていない場合には、宿主生物体はまず破壊されなければならない。これを行うための様々な方法たとえばフレンチプレスで著しい圧力差を発生させる方法は、熟練者には周知である。これに続く抗原の精製は、熟練者には周知であり、抗原の物理化学的性質たとえば溶解度、等電点、電荷、サイズおよび電気泳動移動度を使用する方法に基づいて行われる。標的タンパク質のとくに高度な濃縮はそのタンパク質が親和性クロマトグラフィーによる精製を可能にするマトリックスに特異的および可逆的に結合することができれば達成可能である。
【0025】
新規な試薬はヒトおよび動物の多数の診断方法に使用できる。これらの方法の例としては、ウイルス(たとえばA、BおよびC型肝炎ならびにHIVの様々な型のウイルス)、細菌および寄生虫病原体の構造的特徴、またアレルギー疾患に対する多様な免疫グロブリンクラスの抗体を検出するための単一工程または多重工程試験を挙げることができる。他の例には、単一工程または多重検出方法での疾患誘発物質たとえばウイルス(たとえばB型肝炎ウイルス)、細菌、寄生虫およびアレルゲン、また疾患マカー(たとえば腫瘍マーカー)の検出がある。
【0026】
【実施例】
本発明はまた以下の実施例によって分類されるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1:
HIV抗体の検出のための酵素イムノアッセイ
1a)組換えタンパク質pMAL-gp41およびpSEM-gp41の調製
HIV抗原をコードするDNAはPCRにより調製した。HIV株HIV1-BH10をPCRの鋳型とした。この場合、増幅により得られたフラグメントは、bp7209〜bp7508(図5)(配列番号:1)を包含した。そのフラグメントの5′末端に制限切断部位BamHIを、3′末端にXabIを挿入すると、発現ベクターpMAL-c2(New England Biolabs)、およびpSEM(Knappら, Biotechniques, 1990, 8(3): 280-281)へのクローニングが可能になった。組換えタンパク質を発現させて、pSEM-gp41(図1)の場合は封入体から7M尿素中により分別尿素抽出し、ついでゲルクロマトグラフィーにより精製し、pMAL-gp41(図2)の場合は製造業者の説明書に従って親和性クロマトグラフィーで精製した。両タンパク質とも1g/Lの濃度に調整した。pMAL-gp41タンパク質は50mM炭酸ナトリウム、pH8.0中に、pSEM-gp41タンパク質は50mM炭酸ナトリウム、6M尿素、pH8.0中に存在させる。
【0027】
1b)固相I(新規システム)の調製
B型マイクロタイトレーションプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)を4℃にて24時間、コーティング溶液[50mM炭酸ナトリウム、pH9.5中組換えpSEM-gp41(実施例1a記載のプレパレーション)600μg/L]100μlを各ウエルに存在させてインキュベートする。マイクロタイトレーションプレートのウエルをついで3回各回300μlの洗浄液(50mM Tris, 0.1%Tween 20, pH7.2)で洗浄する。マイクロタイトレーションプレートをシリカゲル上で乾燥すると、空気を排除した場合、約1年間安定である。
【0028】
1c)固相II(対照システム)の調製
B型マイクロタイトレーションプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)を4℃にて24時間、コーティング溶液[50mM炭酸ナトリウム、pH9.5中組換えpMAL-gp41(実施例1a記載のプレパレーション)600μg/L]100μlを各ウエルに存在させてインキュベートする。マイクロタイトレーションプレートのウエルをついで3回各回300μlの洗浄液(50mM Tris, 0.1%Tween 20,pH7.2)で洗浄する。マイクロタイトレーションプレートをシリカゲル上で乾燥すると、空気を排除した場合、約1年間安定である。
【0029】
1d)接合体の調製
10倍モル過剰のN−γ−マレイミドブチリル−スクシンイミドを組換えpMAL-gp41(実施例1a記載のプレパレーション)10mgに加え、混合物を1時間室温でインキュベートする。未反応のヘテロ二官能性試薬をゲル濾過(Sephdex G-25)により100mMリン酸ナトリウム、5mMニトリロ酢酸、pH6.0を用いて分離する。
西洋ワサビペルオキシダーゼ(Boehringer Mannheim, Mannheim, FRG)10mgを10mMリン酸ナトリウム、100mM食塩、pH8.0中、10倍モル過剰の2−イミノチオランとともに室温で1時間インキュベートする。遊離の修飾試薬をついでゲル濾過(Sephdex G-25)により100mMリン酸ナトリウム、5mMニトリロ酢酸、pH6.0を用いて分離する。
2つの溶出液(SH−活性化ペルオキシダーゼおよびマレイミド−修飾HIV1タンパク質)を合わせて室温で一夜インキュベートする。100mM N−エチルマレイミド1/10容で反応を停止させたのち、接合体を非反応HIV1タンパク質からゲル濾過(Sephdex G-25)によって精製する。濃縮(2mg/ml)したのち、接合体は−20℃で保存する。
【0030】
1e)HIV1抗体を検出するための酵素イムノアッセイ
抗−HIV1抗体を検出するための酵素イムノアッセイは以下のように実施する:25μlのサンプル緩衝液(0.3M Tris/HCl, 1%アルブミン、2%Tween 20, pH7.2)を実施例1aおよび1bに記載のように調製したマイクロタイトレーションプレートのウエル中100μlのヒト血清と37℃で30分間インキュベートする。プレートを50mM PBS、0.1%Tween 20で4回洗浄したのち実施例1cに記載のようにして調製した接合体125μl(0.1M Tris/HCl,1mMグリシン,0.2%アルブミン,0.4%Pluronic F64,pH8.1中1:1000)をピペットで加える。30分のインキュベーション(+37℃)をさらに4回の洗浄工程によって停止させる。結合した抗−HIV1抗体の量に正相関する結合したペルオキシダーゼ活性を、H2O2/テトラメチルベンチジンの添加により測定する。室温に30分置いたのち0.5M硫酸を加えて基質の変換を停止させる。吸光は450nmで測定する。
抗−HIV1陽性血清、正常な抗−HIV1陰性血清および対照システムにおいて偽陽性である選ばれた抗−HIV1陰性血清を、対照システムおよび新規な酵素イムノアッセイの両者で検討した。
検討の結果(吸光単位)を表1に示す。
【0031】
【表1】
【0032】
2つの試験システムにおけるシグナルには、とくに抗−HIV陰性サンプルの場合に著しい差が認められる。抗−HIV陽性血清は、2つの試験システムにおいて同様に反応する。
【0033】
実施例2:
T.pallidum抗体の検出のための酵素イムノアッセイ
2a)組換え抗原の調製
T.pallidum抗原をコードするDNAはPCRによって調製した。この場合、T.pallidummのNicholas株のゲノムDNAをPCRの鋳型とした。PCRプライマーはタンパク質TpN17の全リーディングフレーム(図6)(配列番号:2)が増幅され、BamHI切断部位およびXbaI切断部位が増幅配列のそれぞれ5′および3′末端に導入されるように設計された。これにより、制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIを使用して、発現ベクターpMAL-c2(New England Biolabs)およびpSEM(Knappら, Biotechniques, 1990, 8(3): 280-281)へのクローニングが可能になった。組換えタンパク質を発現させてpSEM-TpN17(図3)の場合は封入体から7M尿素中での分別尿素抽出、ついでゲルクロマトグラフィーにより精製し、pMAL-TpN17(図4)の場合は製造業者の説明書に従って親和性クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質は1g/Lの濃度に調整した。pMAL-TpN17タンパク質は、50mM炭酸ナトリウム、pH8.0中、pSEM-TpN17タンパク質は50mM炭酸ナトリウム、6M尿素、pH8.0中に存在させる。
【0034】
2b)固相I(新規システム)の調製
B型マイクロタイトレーションプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)を4℃にて24時間、コーティング溶液[50mM炭酸ナトリウム、pH9.5中組換えpSEM-TpN17(実施例2a記載のプレパレーション)3mg/L]100μlを各ウエルに存在させてインキュベートする。マイクロタイトレーションプレートのウエルをついで3回各回300μlの洗浄液(50mM Tris, 0.1%Tween 20, pH7.2)で洗浄する。マイクロタイトレーションプレートをシリカゲル上で乾燥すると、空気を排除した場合、約1年間安定である。
【0035】
2c)固相II(対照システム)の調製
B型マイクロタイトレーションプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)を4℃にて24時間、コーティング溶液[50mM炭酸ナトリウム、pH9.5中組換えpMAL-TpN17(実施例2a記載のプレパレーション)3mg/L]100μlを各ウエルに存在させてインキュベートする。マイクロタイトレーションプレートのウエルをついで3回各回300μlの洗浄液(50mM Tris, 0.1%Tween 20, pH7.2)で洗浄する。マイクロタイトレーションプレートをシリカゲル上で乾燥すると、空気を排除した場合、約1年間安定である。
【0036】
2d)接合体の調製
10倍モル過剰のN−γ−マレイミドブチリル-スクシンイミドを組換えpMAL-TpN17(実施例2a記載のプレパレーション)10mgに加え、混合物を1時間室温でインキュベートする。未反応のヘテロ二官能性試薬をゲル濾過(Sephdex G-25)により100mMリン酸ナトリウム、5mMニトリロ酢酸、pH6.0を用いて分離する。
【0037】
西洋ワサビペルオキシダーゼ(Boehringer Mannheim, Mannheim, FRG)10mgを10mMリン酸ナトリウム、100mM食塩、pH8.0中、10倍モル過剰の2−イミノチオランとともに室温で1時間インキュベートする操作を、2回実施する。遊離の修飾試薬をついでゲル濾過(Sephdex G-25)により100mMリン酸ナトリウム、5mMニトリロ酢酸、pH6.0を用いて分離する。
【0038】
溶出液(SH−活性化ペルオキシダーゼおよびマレイミド−修飾T.pallidumm タンパク質)を合わせて室温で一夜インキュベートする。100mM N−エチルマレイミド1/10容で反応を停止させたのち、接合体を非反応T.pallidummタンパク質からゲル濾過(Sephdex G-25)によって精製する。濃縮(2mg/ml)したのち接合体は−20℃で保存する。
【0039】
2e)抗−T.pallidumm抗体を検出するための酵素イムノアッセイ
抗−T.pallidumm抗体を検出するための酵素イムノアッセイは、以下のように実施する:25μlのサンプル緩衝液(0.3M Tris/HCl, 1%アルブミン,2%Tween 20, pH7.2)を実施例2aおよび2bに記載のように調製したマイクロタイトレーションプレートのウエル中100μlのヒト血清と37℃で30分間インキュベートする。プレートを50mM PBS、0.1%Tween 20で4回洗浄したのち実施例1cに記載のように調製した接合体125μl(0.1M Tris/HCl,1mMグリシン,0.2%アルブミン,0.4%Pluronic F64,pH8.1中1:1000)をピペットで加える。30分のインキュベーション(+37℃)をさらに4回の洗浄工程によって停止させる。結合した抗−T.pallidumm抗体の量に正相関する結合したペルオキシダーゼ活性を、H2O2/テトラメチルベンチジンの添加により測定する。室温に30分置いたのち、0.5M硫酸を加えて基質の変換を停止させる。吸光は450nmで測定する。
抗−T.pallidumm陽性血清、正常な抗−T.pallidumm陰性血清、対照システムおよび新規な酵素イムノアッセイの両者で検討した。
検討の結果(吸光単位)を表2に示す。
【0040】
【表2】
【0041】
【表3】
【0042】
2つの試験システムにおけるシグナル形成には、とくに抗−T.pallidum陰性サンプルの場合に著しい差が認められる。一部の抗−T.pallidum陰性血清は、対照システムでは偽陽性の反応を与えるが、新規なシステムではこのようなことはない。抗−T.pallidum陽性血清は2つの試験システムで同様に反応する。
【0043】
【配列表】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【図面の簡単な説明】
【図1】発現ベクターpSEM-gp41の構造を示す。
【図2】発現ベクターpMAL-gp41の構造を示す。
【図3】発現ベクターpSEM-TpN-17の構造を示す。
【図4】発現ベクターpMAL-TpN-17の構造を示す。
【図5】HIV抗原をコードするDNA配列と対応するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図6】 T.pallidum抗原をコードするDNA配列と対応するタンパク質のアミノ酸配列を示す。
Claims (15)
- 第一および第二の結合パートナーを被検物質と接触させ、被検物質への結合パートナーの結合を既知方法を用いて検出することによりサンプル中の被検物質を定性的または定量的に検出する免疫化学的方法において、2種の結合パートナーを同一の宿主において融合タンパク質の発現のために異なるベクター(V1およびV2)を用いて組換えにより調製し、第一の結合パートナーはベクターV1中で融合タンパク質F1として発現させ、第二の結合パートナーはベクターV2中で融合タンパク質F2として発現させることからなる方法。
- 少なくとも2種の被検物質を定性的または定量的に検出し、1種の被検物質あたり2種の結合パートナーを用い、これらの2種の結合パートナーは、異なる宿主中で異なる被検物質の結合パートナーの発現を可能にする、同一の宿主において融合タンパク質の発現のために異なるベクターを用い組換えにより融合タンパク質として調製する請求項1記載の方法。
- 1種または2種以上の結合パートナーを固相上に固定化する請求項1または2記載の方法。
- 二重抗原サンドイッチイムノアッセイ法である請求項3記載の方法。
- 宿主は真核細胞生物体である請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 宿主は原核細胞生物体である請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 宿主は細菌である請求項6記載の方法。
- 細菌は大腸菌である請求項7記載の方法。
- 発現に関連して、融合タンパク質F1またはF2の一方は可溶性分画から大量に得られ、融合タンパク質F1またはF2の他方は不溶性分画から大量に得られる請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 検出される被検物質を、固相上に固定化された融合タンパク質F1および検出可能な免疫複合体が生成するように標識できる可溶性融合タンパク質F2と接触させ、この場合、融合タンパク質の発現のための宿主には細菌たとえば大腸菌を使用し、F1は不溶性分画から大量に得られ、F2は細菌溶解物の可溶性分画から大量に得ら
れる請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 - F1はベクターpSEM中で発現させ、F2はベクターpMAL中で発現させる請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 被検物質(単数または複数)は抗体である請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 抗体はウイルス、細菌、寄生虫、アレルゲン、自己抗原もしくは医薬または上述の抗原の部分に対する抗体である請求項12記載の方法。
- 抗体はHIV1および/またはHIV2または T.pallidumに対する抗体である請求項12記載の方法。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の少なくとも2種の結合パートナーおよびそれに記載された方法の実施に必要な付加成分から構成されるテストキット。
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