JP2553159B2

JP2553159B2 - 赤血球凝集アッセイ

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Publication number: JP2553159B2
Application number: JP63231517A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ヒルヤードカーメル; ビー．ライラットデニス; イー．ケンプブルース; グレゴリーバンドゥセンピーター
Original assignee: EIJEN Ltd
Current assignee: EIJEN Ltd
Priority date: 1987-09-17
Filing date: 1988-09-17
Publication date: 1996-11-13
Anticipated expiration: 2011-11-13
Also published as: NZ226202A; DK519388D0; IL87768A; ATE116740T1; EP0308242B1; NO884131L; EP0308242A3; NO175024B; OA08953A; NO884131D0; DK519388A; NO175024C; EP0308242A2; JPH01153960A; DE3852683T2; DE3852683D1; ES2070129T3

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、赤血球凝集によりヒト又は動物の血液中の
抗原、抗体又は他の分析物を検出するための試薬及び方
法に関する。本発明はまた、試薬を含むニット及びその
試薬の調製法にも関する。

〔発明の背景〕

特定の抗原又は抗体のための血液サンプルをアッセイ
することは、アッセイする前、遠心分離及び／又は凝固
することにより血液の血清成分から細胞成分を分離する
段階を従来含む。

これは、いくつかの潜在的な問題を提示する。第１
に、そのようなアッセイは、フィールド条件下で行われ
る試験には適切でない。多くの獣医によれば、フィール
ドでの敏速な試験が、分離及びアッセイのために実験室
にサンプルを輸送する手段よりも所望される。また、遠
心機を持たない獣医は、感染性物質、たとえばイヌ糸状
虫の存在のために血液サンプルを時々アッセイする必要
がある。さらに、第III世界における病気の検出のため
に使用されるアッセイは、単純性及び低費用性が不可欠
ものである状況を示す。

第２に、ある病理学的条件においては、血液サンプル
の分離が困難になる。ヴァルデンストームマクログロブ
リン血病症の患者から採取される血液は、完全な血液に
対して行われ得るアッセイをひじょうに所望するものに
する細胞画分及び血清に分離することが困難である。

第３に、血液サンプルは、しばしば高い感染性且つ潜
在的に危険な疾病状態の存在についての試験のために使
用される。これらの場合、アッセイを行う人々への危険
性を最少にするために、できるだけ少ない操作及び加工
でサンプルを処理することが好ましい。さらに、ある条
件は、オバ−ザ−カウンターフィンガープリックアッセ
イ（over−the−counter finger−prick assay）の手段
をひじょうに所望するものにする。そのようなアッセイ
は、必然的に完全な血液に対する実施を適切なものにす
るにちがいない。

たとえばラジオイムノアッセイ（Yalow and Berson
（1959）Nature 184,1648により初めに報告された）及
び酵素イムノアッセイ又はEIA〔Engvall and Perlman
（1971）Immunochem ８,871及びVan Weeman and Schunr
s（1971）FEBS Letters 15,232により最初に報告され
た〕の技法の紹介以来、イムノアッセイは、ヒトの診断
及び獣医学に新風を引き起こして来た。

そのようなアッセイは、抗体−抗原の相互作用に基づ
かれているが、使用される検出システムは通常、複雑で
ある。使用される試薬は一般的に酵素又は放射性ラベル
された抗原、抗体又はその複合体であり、それらは、試
験されるべき分析物の存在を検出するために、特定の基
質とのインキュベーション及び視覚的に又は比色分析に
よる色のエンドポイントの測定、又は放射線カウンター
による放射性壊変の測定のいずれかを必要とする。これ
らのアッセイはまた、いくつかの洗浄段階も含む。血液
中の分析物の検出のためのほとんどのイムノアッセイ
は、一般的に自然界の力によるものである。従って、こ
れらのアッセイは敏感であるけれども、それらは、試験
下での分析物の検出のために、長い時間を必要とし、そ
して高価な装置を必要とする工程を含む。

これらのアッセイに代わるものとして、Gupta、な
ど，、（1985）Journal of Immunological Methods 80
177〜187により記載のタイプのイムノアッセイが提供さ
れる。これらは、赤血球及び抗−赤血球抗体が指示器シ
ステムに使用されるイムノアッセイである。これらのア
ッセイにおいては、外因性赤血球、たとえば羊赤血球が
使用される。

最近、ラテックスビーズに抗体を接触し、従って急速
な凝集アッセイを提供することが可能になって来た。し
かしながら、これはまだ細胞相からの血清／血漿相の分
離を伴い、そして従って遠心機又は濾過システムの使用
を必要とする。ラテックス凝集アッセイは、Castelan、
など．、J.Clin.Pathol.（1968），21,638;及びSinger
＆ Plotz AM.J.Meol.〔1956（12月）〕,888に記載され
る。

直接的及び間接的凝集イムノアッセイは、当業界で良
く知られている。これらのアッセイにおいて、抗原又は
抗体が結合される粒子の凝集を用いて、その対応する抗
体又は抗原の存在又は不在を指摘する。種々の粒子、た
とえばラテックス、木炭、カオリナイト又はベントナイ
トの粒子、及び微生物細胞及び赤血球細胞の両者が凝集
可能なキャリヤーとして使用された。アメリカ特許第4,
308,026号（モチダによる）を参照のこと。指示粒子と
しての赤血球の使用は、Patel（アメリカ特許第3,882,2
25号）により強く批評されていて、そして彼は、指示赤
血球を標準化することは難しいことを言及する。

Molinaro（アメリカ特許第4,130.634号）は、抗体被
覆の赤血球細胞を使用する抗原についてのアッセイを記
載する。彼は、赤血球に抗体を結合するために使用され
る方法は、抗体の反応性を破壊すべきでないことを強張
する。彼は、赤血球に対して特異的である抗体がこのア
ッセイのために有用でないことを明確にする。しかしな
がら、彼は、抗原に対して特異的な１つの結合部位及び
赤血球細胞に対して特異的の他の結合部位を有するハイ
ブリッド抗体を用いる可能性を言及する。

Chang（アメリカ特許第4,433,059号）は、２種の抗体
が“テイル−ツゥ−テイル”、すなわちそれらの特異性
を変えないように共有結合される凝集イムノアッセイ試
薬を開示する。１つの抗体は、指示物質、たとえば赤血
球により担持される抗体に対して特異的である。この抗
対は好ましくは、非特異的な凝集を避けるために一価で
ある。他の抗体は二価であり、そして分析物に対して特
異的である。アッセイのための用意においては、新鮮な
赤血球が接合体により被覆される。次に、二重の抗体接
合体被覆のRBCが試験血清と共にインキュベートされ
る。Changは、非凝集性抗−RBC抗体及び内因性赤血球を
用いての完全な血液サンプルのアッセイを考慮しない。

Chu（アメリカ特許第4,493.793号）は、レクチン−抗
体又はレクチン−抗原共有結合性接合体の構成を開示す
る。彼の第１表（引用により組込まれている）は、いく
つかのレクチンの炭水化物特異性を示す。彼は、レクチ
ン又は抗体受容体のいずれかを通しての赤血球へのその
ような接合体の結合を教授しない。

他の“テイル−ツゥ−テイル”免疫学的接合体は知ら
れている。Segal（アメリカ特許第4,676,980号）は、標
的細胞表面特異的抗体及び細胞素性エフェクター細胞受
容体特異的抗体の“テイル−ツゥ−テイル”接合体の構
成を示す。いくつかの架橋法（引用により導入される）
が記載される。この接合体は、免疫療法の使用に向けら
れ、ここでそれは患者の細胞免疫系による標的細胞の分
解を引き起こすであろう。もちろん、標的細胞は、宿主
に対して内因性の赤血球ではないであろう。

Li（アメリカ特許第4,661,444号）は、第１抗体のイ
ディオタイプに対して特異的な抗体及び分析物結合抗体
のテイル−ツゥ−テイル接合体の製造を示唆する。この
接合体は、イムノアッセイにおいて、不溶化された分析
物結合抗体と一緒に使用されるべきであった。

Wardlaw（アメリカ特許第4,695,553号）は、遠心分離
された完全な血液における赤血球細胞と白血球細胞との
間の界面を明確にするためにRBC凝集剤として一般的な
赤血球抗原に対するモノクローナル抗体の使用を教授す
る。彼は、グリコホリン又はＨ抗原に対する抗体の使用
を提起するのみならず、またレクチンの混合物の使用の
可能性も記載する。Guesdon（アメリカ特許第4,668,637
号）は、赤血球吸着の目的のために抗−赤血球細胞抗体
又はクレチンの使用を論議する。Bigbee〔Molecular Im
munology,20;1353〜1362（1983）〕は、グリコホリンＡ
に対する４種のモノクローナル抗体の産生及び試験を記
載する。対象（微生物）の分析物のクラスのすべてのメ
ンバーの間に共有される抗原決定基と反応する抗体をイ
ムノアッセイで使用する一般的な概念が、McLaughlin、
アメリカ特許第4,683,196号に示される。

多くの特許が、血液型判定に有用な抗体を取り扱う。
Lloyd、アメリカ特許第4,678,747号;Graham,Jr.、アメ
リカ特許第4,358,436号;Liu、アメリカ特許第4,550,017
号;Steplewski,アメリカ特許第4,607,009号;Lennox,WO8
3/03477を参照のこと。これらの抗体は、それらがある
血液細胞集団においてのみ見出される抗原に結合するの
で、血液型判定のために有用であるが、ところが本発明
の目的のためには、本質的にすべての赤血球に対して結
合する抗体（又はその混合物）を使用することが所望さ
れる。

Zuk（アメリカ特許第4,594,327号）は、完全な血液サ
ンプルに対する直接的イムノアッセイの実施の望ましい
ことを認識する。この方法においては、サンプルが不溶
性分析物特異的免疫試薬及び赤血球細胞結合剤、たとえ
ばRBC−特異的抗体又はレクチンの両者と接触せしめら
れる。分析物特異的免疫試薬及びRBC結合剤は一緒に結
合されず、そしてその開示されたアッセイは凝集アッセ
イではない。

血液サンプルに内因性の抗−赤血球抗体による赤血球
の非特異的凝集の凝集イムアッセイにおける問題は、Cz
ismas（アメリカ特許第3,639,558号）により示された。
彼は、タンパク質による粒子の被覆によりその粒子上の
すべての天然に存在する抗原性部位の除去を提案した。

Theofilopoulos（アメリカ特許第4,342,566号）;Duer
meyer（アメリカ特許第4,292.403号）及びGoldenberg
（アメリカ特許第4,331,647号）は、アッセイにおける
損なわれていない抗体のための置換体として抗体の特異
的結合フラグメントの使用を示す。異種二官能価抗体の
構成は、Auditore−Hargreaves（アメリカ特許第4,446,
233号）;Paulus（アメリカ特許第4,444,878号）；及びR
eading（アメリカ特許第4,474,893号）により教授され
る。Mochida（アメリカ特許第4,200,436号）は、あるイ
ムノアッセイにおいて一価抗体又はその結合フラグメン
トの使用を開示する。Forrest（アメリカ特許第4,659,8
78号）は、一価抗体が抗原とのダイマー又はそれ以上の
複合体を形成することができず；そのような凝集体は、
固相支持体への抗原−抗体複合体の結合を妨げることが
できることを言及する。

〔本発明の記載〕

本発明者は、完全な血液中の種々のタイプの分析物の
分析のために、実験室において及び医学的試験設備を欠
く第三次世界において使用され得る方法が必要であるこ
とを認識した。上記に指摘されたように、初期の方法
は、血清又は血漿から血液細胞の分離を必要とし、そし
て従って、そのフィールドに実施の手段を与えることは
困難であり且つ多くの場合、不可能である。

赤血球結合分子が特定の分析物結合分子に結合される
場合、その得られた接合体を使用して、血液サンプル中
に存在する内因性赤血球及び分析物の両者を結合するこ
とができる。本発明は、そのような複合体が血液サンプ
ルに暴露される場合、そのサンプルに対して内因性の赤
血球の凝固が、分析物と赤血球との架橋により適切な分
析物（通常抗原又は抗体）の存在の指示薬として作用す
るであろうことに起因する。

内因性RBCの利点ｉ）現在のアッセイ法の単純化 −サンプルを遠心分離する必要がない；適切な抗凝集体
の存在下で集められた完全な血液が血清又は血漿の代わ
りに使用される。

−感染性疾病、たとえばAIDS又は肝炎を有する患者から
のサンプルに関して、最小のサンプル操作を要する。

−設備が限定される三次世界の世界健康組織（World He
alth Organization）により行われるようなマススクリ
ーニングプログラムのために適切である。

−アッセイはひじょうに単純である；静菌剤、たとえば
0.01％（w/v）のアジ化ナトリウムの存在下で安定でき
る１種の試薬のみが存在する。

−適切な動物の赤血球細胞が種特異的MAbを産生するた
めに免疫化に使用される場合、獣医によるフィールド試
験として使用され得る。

−試験はひじょうに早い−凝集が３分以下で生じる。

−その方法は、治療薬及び患者のコンプリアンスを調節
するために使用され得る。

−それはまた、“オーバー−ザ−カウンター”自己試験
アッセイとしても使用できる。

−必要とされる設備は、混合棒、ガラス又はプラスチッ
クスライド、ランセット及びたぶん微細管だけである。

ii）外因性赤血球に対する利点は次のものを含まない： −赤血球の前処理。特許第4,433,059号は回転沈殿さ
れ、15分間抗体接合体と反応せしめられ、そしてPBSに
より３度洗浄されたＯ型血液陰性細胞を使用する。特許
第4,668,647号は、PBSにより洗浄され、そして再懸濁さ
れた羊赤血球細胞を使用する。固体支持体上で起こる反
応の後、細胞は固定される。

−サンプルの前処理。特許第4,433,059号、サンプルが
補体による介入を避けるために加熱不活性化されるべき
であることを示す。ウサギ血清及びウシアルブミンがま
た、他の特異的反応を最少にするために添加されるべき
である。これは、患者からの希釈されていない完全な血
液が試薬と直接的に反応せしめられ得る本発明のシステ
ムに関しては必要でない。この試薬は、存在するかも知
れないいずれかの抗−マウス反応を妨げるために関係の
ないモノクローナル抗体を含む。

従って、凝集アッセイにおける血清から細胞のやっか
いな分離及び支持体粒子としての使用に向けられている
外因性赤血球の感作及び固定化を実施することは可能で
ある。内因性赤血球は試薬により感作される。

本発明の凝集試薬及びアッセイのもう１つの新規観点
は、内因性赤血球と共に接合体のインキュベーション
が、分析物がまた存在しない場合、赤血球の凝集を引き
起こさないであろうような赤血球結合分子（該赤血球結
合分子は、本明細書で“非−自己凝集”と称する）の選
択である。

赤血球結合分子は好ましくは、モノクローナル抗体で
あり、そして特にヒトシステムにおいては、抗−グリコ
ホリン抗体である。この抗体は立体的理由のために自己
凝集しないように思われ；損なわれていない抗体の結合
部位のいづれかが、単に同じ赤血球上の隣接するエピト
ープを結合することができ又は２個の結合部位の１つの
みが一度にグリコホリンに結合することができる。

本発明のアッセイは、２種の接合体（１つは分析物特
異的結合分子を担持し、そして他は分析物への第１接合
体の結合により形成される新規エピトープに対して特異
的な結合分子を担持する）を用いて、反復抗原決定基を
有さない小さな抗原を検出することができる。これは、
測定されるべき抗原の存在下での架橋を可能にする。

〔発明の特定の記載〕

本発明の凝集アッセイにおいて、結合部分の結合特性
を実質的に変えないで、分析物結合分子により提供され
る分析物結合部分（又は分析物類似体）に結合される赤
血球結合分子により提供される赤血球結合部分を含んで
成る試薬が提供される。その試薬は、分析物の不在下で
内因性赤血球と共にインキュベートされる場合、凝集し
ない。

赤血球結合分子赤血球膜は、種々の抗原表面成分、たとえばタンパク
質、糖タンパク質、糖脂質及びリポタンパク質を含む。
これらの成分を認識する抗体は、免疫原としてその膜、
又はその精製された成分を用いて従来の技法によって調
製され得る。これらの抗体は、天然においてモノクロー
ナル又はポリクローナルである。損なわれていない抗体
又はその特異的結合フラグメントのいづれかが、赤血球
結合分子（EBM）として使用され得る。抗体又は抗体フ
ラグメントは、多価、二価又は一価のものである。

さらに、赤血球の表面上の糖タンパク質、糖脂質及び
他の淡水化物構造体は、炭水化物に対する親和性を有す
る、レクチンとして知られている化学物質により認識さ
れる。これらのレクチンはまた、EBMとしても使用され
得る。赤血球表面に対する特異的親和性を有する他の受
容体分子もまた、使用され得る。これらはまた、膜の脂
質二重層に対する親和性を有する分子も含むことができ
る。そのような分子の例として、プロタミン、ハチの毒
の膜結合分及び他のひじょうに塩基性のペプチドを挙げ
ることができる。

本発明の好ましいEBMは、すべて又はほとんどすべて
の赤血球上に見出される赤血球膜成分を認識し、その結
果、血液サンプルに内因性の赤血球が凝集粒子として使
用され得る。そのような成分は、いわゆる“公衆抗原
（public antigens）”を含む。

赤血球膜は、タンパク質を膜内に固定し又はそれを通
過せしめることを可能にする疎水性部分又は表面上のい
ずれか種々のタンパク質を有する脂質二重層であり、そ
して細胞内に分子の一部を有することもできる。

グリコホリンＡは、細胞膜を通り抜ける分子の例であ
る。血液型特異性は、膜タンパク質に結合される炭水化
物又は糖脂質成分により与えられる。従って、EBMが、
特定の種すべての赤血球に共通する膜糖タンパク質、成
分のタンパク質部分又は他の共通の構造体のいづれかを
認識すべきであることが重要である。赤血球細胞を凝集
する二価EBMの能力は、立体因子、たとえば分子の移重
度及び脂質二重層上の結合部位の位置に依存するであろ
う。

赤血球膜のタンパク質は、グリコホリンＡ（MN,En^a,W
r^b）、グリコホリンＢ（Ss,¹N¹,U）及び少量の構成成
分、すなわち膜内在性タンパク質１（Rhesus）、膜結合
糖タンパク質C4（Chido ＆ Rodgers）、膜内在性糖タン
パク質（アニオンチャネル）、糖脂質（Lewis）、スフ
ィンゴ糖脂質（ABH,li,P,TK）、アンキリン、スペクト
リン、プロテイン４−１、Ｆ−アクチンを含む〔関連す
る血液型因子は括弧内のものである。〕。

次の出版物は引用により本明細書に組込まれる： 1. 赤血球細胞膜。S.B.Shohet ＆ E.Beutler,Hematolo
gy、第３版、出版者:Williams,Beut−ler,Erslev ＆ Li
chtman,1983（すべての赤血球膜抗原の総説）。

2. 赤血球細胞膜の概略。

V.t.marchesi.Blood,61,1〜11,1983（タンパク質概略
の総説）。

特に好ましいEMBは、１つのグリコホリンである。赤
血球シアロ糖ペプチドが膜から抽出される場合、その主
な画分（合計の約75％）は、グリコホリンである。この
分子は、16個のオリゴ糖鎖と共に131個のアミノ酸を含
んで成る。従って、これは、赤血球細胞を凝集しないで
抗体の結合を可能にする多くの成分である。それはま
た、Sigma Chemical Companyから比較的高い純度で容易
に入手できる（Fractionation of the Major Sialoglyc
opeptides of the Human Red Blood Cell Membrane"H.F
urthmayr,M.Tomita ＆ V.T.Marchesi.BBRC 65,1975,113
〜122を参照のこと）。

赤血球結合分子が、通常の抗体の場合におけるように
多価のものである場合、その分子が、豊富であり、そし
て十分に分布されている赤血球膜成分を認識し、そして
その結合部位が、細胞間の架橋が立体障害物により阻害
されるような位置に存在すべきであり、それによって未
熟赤血球細胞の凝集を回避することが所望される。

他方、架橋は、エピトープが１つのRBCにより結合さ
れるべきEBM上で結合部位のために十分に接近するため
に、十分な量で存在する表面成分を認識するEBMの選択
により阻害され得る。

すべての赤血球を実質的に認識する単一のEBMが使用
されることが好ましいが、但し必要ではない。いくつか
のEBMが同じ又は別の接合体のいづれかに使用され得、
それらのそれぞれは赤血球の特定のグループを認識する
が、しかし凝集体においては、すべての赤血球を実質的
に認識するであろう。

EBMは、赤血球の天然の表面成分を認識することが好
ましいが、EBMにより認識されるリガンドにより赤血球
を被覆し、又は通常隠れたリガンドを暴露するために赤
血球を処理することが可能である。

分析物本発明は、特定の分析物の検出に限定されない。分析
物は、血液中に通常見出される物質、たとえば血液タン
パク質又はホルモンであり、又はそれは外来性物質、た
とえば薬物（治療用薬物及び悪用薬物の両者を含む）、
又は生物体、たとえばウィルス（ウィルス被覆タンパク
質を認識することにより）、細菌、原生動物、菌類、又
は多細胞寄生虫（たとえばイム糸状虫類）である。

分析物は、１つの分析物結合分子により認識できる反
復エピトープ、又はユニークエピトープ（ここで分析物
結合分子の混合物が必要である）を有する。しかしなが
ら、単に一度に１種のABMにより結合され得る分析物も
また、検出され得る。

分析物結合分子分析物結合分子は、分析物に対して好ましい親和性を
有する物質、たとえばモノクローナル又はポリクローナ
ル抗体、レクチン、酵素又は他の結合タンパク質もしく
は物質（又はその結合フラグメント）である。分析物が
抗原である場合、ABMは通常抗体である。分析物が抗体
である場合、ABMは通常、その抗体により認識される抗
原である。検出されるべき分析物が反復エピトープを有
さない場合、分析物に対する種々の特異性を有する複数
のABMが必要とされる。この場合、試薬は、ABM1に結合
されるEBM及びABM2に結合されるEBMの混合物、又は結合
される両ABMを有するEBMのいずれかであろう。

分析物結合分子は、直接分析物に結合する必要はな
い。たとえば、成長ホルモンのためのアッセイにおいて
は、１つのABMが成長ホルモン結合タンパク質に対して
向けられ（その結合タンパク質がサンプル中に存在する
ことが既知である）、又は別々に供給され得る。

EBM及びABMの結合 EBM及びABMは、直接的又は間接的に、及び共有結合又
は非共有結合（又はその組合わせ）により一緒に結合さ
れ得る。複数のEBM又はABMが使用される場合、EBM又はA
BMは、EBMに直接結合された１又は複数のABMにより一緒
に結合され得る。次の表は、当業界に既知であるいくつ
かの共有結合法を要約する。

異種二官能価 1. SPDP （Ｎ−スクシンイミジル−3,2−（ピリジルジチオ）
プロピオネート） Neurath、など．、1981,J.Virol.,Meth.,３,155〜16
5。

2. MBS （ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル） Kitagaw、など．、1976,J.Biochem.,79,223−236。

3. SIAB （Ｎ−スクシンイミジル−４−ヨードアセチルアミノ
ベンゾエート） Weltman、など．、1983.,Bio.Techniques,１,148〜15
2。

選択的二官能価Ｐ−イソチオシアナトベンゾイルクロリドアメリカ特許第4,680,338号二官能価 1. BSOCOES ビス〔２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキ
シ）エチル〕スルホン Zarling、など．、1980,J.Immunol.,124,913〜920。

2. BS ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート Staros,1982,Biochemistry,21,3950〜3955。

他 1. グルタルアルデヒド Avrameas,1969,Immunochem.,６,43。

2. 過ヨウ素酸酸化 Nakane及びKawai,1974,J.Histochem,Cytochem.,22,10
84〜1091。

3. カルボジイミド共有結合の前記方法のうち、SPDPとの接合が好まし
い。

EBM及びABMはまた、たとえば（ａ）ビチオンを一方に
及びアビジン（又はストレパビシン）を他方に付着し、
（ｂ）抗−抗体を一方に付着し、（次にこれは他方に結
合する）、（ｃ）プロテインＡを一方に付着し（次にこ
れは他方のF_c部分を結合する）、そして（ｄ）糖を一方
に及び対応するレクチンを他方に付着することによって
非共有結合され得る。

EBM及びABMを結合することにおいて、その結合特性
は、可能なかぎりほとんど変化せしめられるべきでない
ことが理解されるべきである。立体障害を減じるために
EBMとABMとの間にスペーサー成分を提供することが好都
合である。

EBM/ABM接合体は、キメラ抗体、たとえば異種二官能
価抗体であり得る。そのような異種二官能価抗体を構成
する１つの方法は、次の通りである：（ａ）ペプシン消化により、選択された抗体のＦ（ab）
_２フラグメントを調製し；（ｂ）前記選択された抗体のFab′フラグメントを調製
するためにエルマン試薬によりそのフラグメントを還元
し、そして処理し；（ｃ）選択された特異的抗体又は選択された赤血球抗体
をチオール化し；そして（ｄ）キメラ性抗−赤血球抗体−抗原特異的抗体接合体
を産生するためにエルマン試薬により処理されたFab′
フラグメントにチオール化されたFab′フラグメントを
結合せしめることを含んで成る。

もう１つの方法が下記に示される：（ａ）高分子生合成の異なった部位−特異性不可逆阻害
剤により、抗−赤血球モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマ及び抗原特異性モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマを処理し；（ｂ）２種の異なったモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマとポリエチレングリコールとを融合し；（ｃ）その融合された細胞を、軟アガロース中において
又は限界希釈法のいづれかによりクローン化し；（ｄ）キメラ性抗−赤血球抗体−抗原特異的抗体を分泌
するクローン化された異種ハイブリドーマを、抗体に対
して適切なスクリーニングアッセイにより選択し；そし
て（ｅ）非ハイブリッド抗体から抗体生成物を開放する
ためにアフィニティー精製によりそれを精製することを
含んで成る。

好ましくは、阻害剤は、エメチン、アクチノマンシン
Ｄ、ヒドロキシ尿素、ウワバイン、シクロヘキシミド、
エジン及びスパルソマイシンから成る群から選択され
る。

キメラ抗体は、２つの半分子であり、１つは赤血球
（EBM）に対する特異性を有し、そして他方は分析物（A
BM）に対する特異性を有する。この場合、抗体のジスル
フィト結合、接合体を形成するためにABMをEBMに結合せ
しめる。他方、前記２つの半分子は、分析物の同じ又は
異なったエピトープに対して特異的であり得る。この２
番目の場合、キメラ抗体は実際に２つのABMであり、そ
して３分節接合体を形成するためにEBMに結合されるべ
きである。３分節接合体は、他の手段、たとえばEBM及
び２つのABMを高分子スペーサーに付着することによっ
て形成され得る。

考えられる最も単純な凝集試薬は、１つのABMへの１
つのEBMの単一接合体を含んで成るものである。この試
薬は、反復エピトープを有する抗原の検出のために適切
である。

２つの抗体分子の同時結合を可能にするのに十分に大
きな抗原分析物（反復エピトープを欠く）が知られてい
る。それらは、多くのペプチド及びタンパク質ホルモン
を含む。凝集が生じるためには、抗原は、抗原の少なく
ともいくつかの分子が隣接する赤血球の間に架橋として
作用するように試薬と相互反応すべきである。そのよう
な分析物をアッセイするためには、複数の種々の接合
体、すなわちABM1/EBM＋ABM2/EBM（ここでABM1及びABM2
は、分析物の種々の非オーバーラッピングエピトープに
結合する）を含む試薬を使用することが好ましい。その
代わりにより複雑な単一接合体、すなわちABM1/ABM2/EB
M（ここでその特定の立体配座は、同じ分析物分子への
同じ接合体分子上の両ABMの結合に関与しそうもない）
を使用することができる。

赤血球凝集アッセイ直接的及び間接的両凝集アッセイは、当業界に既知で
ある。抗原に対する従来の直接的アッセイにおいては、
赤血球細胞は抗体により被覆され、そしてサンプルと反
応せしめられる。多官能価抗原は、被覆された赤血球細
胞の間で架橋として作用し、凝集体を創造する。従来の
間接的アッセイにおいては、赤血球細胞は、抗原により
被覆され、そして可溶性抗体及びサンプルの両者と接触
される。サンプル抗原は、感作化された赤血球細胞の結
合を抗体により、及び従って凝集を競争的に阻害する。
抗体−感作されたRBCをさらに使用することも可能であ
る。Mochida、アメリカ特許第4,308,026号を参照のこ
と。

本発明の試薬は、直接的又は間接的凝集アッセイのい
づれかに使用され得る。しかしながら、従来のアッセイ
とは異なって、抗体又は抗原により赤血球を前もって被
覆することが必要でない。むしろ、本発明の試薬は、内
因性赤血球を含む血液サンプルに添加され得、この上そ
れは細胞を感作し、それらをサンプル分析物に結合でき
るようにし（直接的アッセイ）又は可溶性分析物−結合
分子分析物−結合分子のためにサンプル分析物と競争で
きるようにする（間接的アッセイ）。

いくつかの小さな循環分子、たとえば合成又は天然の
ステロイド、すなわちジゴキシン、テオフィリン、等、
又は悪用薬物、すなわちフェノバルビタール、カンナビ
ノイド、オピオイド、等に関しては、問題の分析物は、
架橋及び続く赤血球の凝集を可能にするために、抗体結
合のための２つの必要な抗原エピトープ（又は他の結合
分子による認識のための他の“エピトープ”）を提供す
るには小さ過ぎるかも知れない。

小さな分子のアッセイに関しては、いづれか他の抗原
をモニターする薬物におけるように、凝集阻害アッセイ
が好ましい。この場合、二段階試験が予定される。第１
段階は、非凝集EBMに結合された分析物又は分析物類似
体から成る試薬の添加でありそして第２段階は、非接合
性ABMの添加であろう（それらの二段階は可逆的であり
得る）。分析物が血液サンプル中に存在する場合、EBM
−分析物類似体接合体へのABMの特異的結合は阻害さ
れ、凝集の損失を導かれる。さもなければ、凝集が生じ
る。

用語“分析物類似体”とは、分析物、及びそのような
結合が分析物により競争的に阻害される場合、ABMによ
りまた特異的に結合される物質を含む。分析物類似体
は、分析物−結合抗体の抗原−結合部位に対して生じる
抗−イディオタイプ抗体である。

直接的凝集アッセイによるそのような小さな分子の検
出に関しては、少なくとも２つの特異的モノクローナル
抗体が使用され得る。小さな循環性抗原に直接的に結合
できる１つのモノクローナル抗体が、赤血球結合分子に
結合され得る。２番目のモノクローナル抗体は、上記接
合体及び分析物と共にインキュベートされ、そして前記
第１モノクローナル抗体のオーバーラップ領域から成る
新しい抗原決定基、及び第１モノクローナル抗体が抗原
を結合する場合にのみ存在する抗原に結合することがで
きるであろう。従って、第２モノクローナル抗体は、赤
血球“架橋”として作用し、最終的に凝集の存在を可能
にする種々の赤血球細胞の間に架橋を引き起こす。もち
ろん、この方法はモノエピトープ分析物に限定されな
い。

特定の立体配座のためにに関しては、単一の第二抗体
分子が２種の接合体：分析物複合体に同時に結合するこ
とは難しいかも知れない。従って、第二抗体と赤血球結
合分子とを接合することが好ましい。

サンプルが多くの試薬と共にインキュベートされるべ
きであることを言及する場合、接触は、接触の特別な順
序又は期間に限定されないで、同時又は連続的であり得
ることが理解されるべきである。

例１−赤血球結合分子（抗−グリコホリン抗体）の調製免疫化及びスクリーニング法マウスを、ヒト赤血球細胞により免疫化し、そしてモ
ノクローナル抗体を、免疫化された動物の脾臓細胞とマ
ウス骨髄腫細胞とを融合することによって生成した。抗
体を回転凝集アッセイ及び酵素イムノアッセイの両者に
よりスクリーンし、ここでグリコホリンがマイクロタイ
タープレートに結合された。回転凝集は、Wyatt ＆ Str
eet,Aust.J.Med.Lab.Sci,4,48〜50の変法により行われ
た。細胞培養物の上清液50μを、マイクロタイタープ
レート中で１％赤血球細胞懸濁液50μと混合した。こ
の例のためには、グリコホリンを結合するが、しかし凝
集しない抗体が選択された。モノクローナル抗体及びグ
リコホリンの反応を、酵素イムノアッセイにより決定し
た。マイクロプレートを、10μg/mlのヒトグリコホリン
〔Sigma Cat.No.G7389〕により被覆し、そして洗浄し、
次にモノクローナル抗体の一連の希釈溶液と共にインキ
ュベートした。さらに洗浄した後、結合された抗体の存
在を、酵素ラベルされた抗−マウス抗体の添加、続いて
基質の添加により決定した。その力価を、モノクローナ
ル抗体の最も高い希釈溶液に対して決定し、そしてそれ
はバックグラウンド上で1.0OD単位よりも高いA420読み
を与えた。

384個のウェルのうち、40個ウェルの一次クローンを
選択した。これらは、陽性の回転凝集アッセイ、EIAに
基づいてのグリコホリンに対する応答又は両者のいずれ
かを与えた。 EIA 回転凝集クローンの数陰性陽性４陽性陽性 20 陽性陰性 16 続く吸収研究が、抗体が赤血球細胞表面上に暴露され
たグリコホリンドメインを認識することを確かめるため
に行われた。

腹水に対するスクリーニングアッセイの結果が下記に
列挙される： RAT 1C3/86を、ブダペスト条約に基づいて、ATCC（Am
erican Type Culture Collection,12301 Parklawn Driv
e,Rockville MD,20852,USA）に1988年９月７日寄託し、
そして寄託番号HB9893,G26.4.1C3/86を得た。

RAT 1C3/86の精製モノクローナル抗体を、ヒドロキシルアパタイトを充
填するクロマトグラフィーにより腹水から均質に精製し
た（Stanker、など．、J.Immunol.Methods 76,157,198
5）。

例２−HIVペプチド−Ab接合体の調製ヒト免疫欠損ウィルス（HIV−１）の流行は、主な全
世界の健康問題に成って来た。現在、この疾病のための
治療又はワクチンはまた存在しない。感染された個人の
診断は、ウィルスの広がりを減じる試みにおける主要因
子である。さらに、血液生成物の汚染を防ぎ、そして個
人の健康を保護する必要性が、抗−HIV抗体の存在のた
めの単純で、迅速で、安価な特定の試験についての需要
を高めて来た。

抗−HIV抗体のため可能性ある検出システムを提供す
るためには、患者自身の赤血球細胞の使用を行ってき
た。これは、ヒト赤血球細胞に対する非凝集性モノクロ
ーナル抗体を選択することによって達成されて来た。こ
の抗体と合成HIVペプチド抗原とを化学的に架橋するこ
とは、この抗原に対する抗体の存在下で患者の赤血球細
胞の特異的凝集を可能にした。HIV−１のgp41（残基579
〜602）に由来する合成ペプチド抗原が、Wellingの方法
〔FEBS LETT.188:215（1985）〕に基づいて選択され、
そしてAIDS患者のおよそ98％からの抗体により認識され
る主要エピトープとして同定される領域に一致する。
〔Wangなど．、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83:6529（198
6）〕。

合成ペプチドを、製造者により供給された二重結合循
環を用いるApplied BiosystemsのModel430合成器の助け
により、Merrifieldの方法〔RS Hodges and RB Merrifi
eld,Anal.Biochem.65,241（1975）〕を用いて合成し
た。Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ酸誘導体
を、Protein Research Foundation（大阪，日本）から
得た。側鎖の保護は、Applied Biosystemsにより供給さ
れたものと同じであった。但し、オメガ−NO₂誘導体が
アルギニンのために使用されたことが異なる。鎖アセン
ブリィーを、ニンヒドリンを用いて調節した〔V Sarin
など．、Anal.Biochem.117,147（1981）〕。アセンブリ
ィーされたペプチドを、同時に開裂し、そして10％（v/
v）アニソールを含む無水HFを用いて保護解除した〔JM
Stewart and JD Young,Solid Phase Peptide Synthesi
s,pp44及び66,WH Freeman,San Francisco（1966）〕。
その粗ペプチドをジエチルエーテルにより沈殿せしめ、
エチルアセテートにより洗浄し、そして0.1％（v/v）の
トリフルオロ酢酸中、60％（v/v）アセトニトリルによ
り抽出した。合成ペプチドを、0.1％のトリフルオロ酢
酸中、０〜60％アセトニトリルの1,000mlグラジェント
により溶離する分離用逆相クロマトグラフィー（Amicon
C₁₈樹脂、250A孔サイズ、25×400mm）により精製し
た。その合成ペプチドは、分析用逆相HPLCにより及び酸
加水分解の後、アミノ酸の定量分析により評価する場
合、約95％の純度であった。

1. 赤血球結合Ab（RAT 1C3/86）のSPDPラベリング 13.8mg/mlのRAT 1C3/86の0.25mlに、ジメチルホルム
アミド中、2mg/mlのSPDP12.5μを添加し、そしてその
反応を25℃で１時間進行せしめた。反応されなかったSP
DPを、Sephadex G25を充填するゲル濾過により除去し、
そしてSPDPラベリングのレベル（1.4モル／モル）を決
定した。

2. ペプチド3.2の還元ペプチド3.2（HIV1の主なコートタンパク質の残基579
〜601に対応する配列RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGK）を、10
0mMのTris HCl,1mMのEDTA（pH8.0）溶液1ml中に溶解
し、そして40℃で45分間２−メルカプトエタノール10μ
と反応せしめた。その反応を、三弗素酢酸（TFA）４
滴及び水性0.1％TFA1mlの添加により停止した。その混
合物を、60％アセトニトリル20mlにより処理され、そし
て0.1％TFAにより平衡化されているSep−pak（Waters）
C18カートリッジに適用した。その還元されたペプチド
を、0.1％TFA20mlにより洗浄する前、Sep−pakを通して
２度循環せしめた。その還元されたペプチドを、60％ア
セトニトリル、0.1％TFAの溶液2mlにより２度Sep−pak
から溶離した。そのサンプルを、結合する前、回転蒸発
により乾燥せしめた。

3. 接合ペプチドを、100mMのリン酸カリウム、100mMの塩化ナ
トリウム及び4MのグアニジンHClを含む緩衝液（pH7.4）
0.2ml中に溶解し、そして同じ緩衝液（但しグアニジンH
Clを含まない）中で、SPDPラベルされた抗体2.2mgと共
に混合した。そのフラスコを、25℃で一晩インキュベー
トした。

抗体の置換の程度は、接合体の溶解性に影響を与え
た；接合体１モル当たりペプチド20モルは不溶性に成っ
た。抗体１モル当たりペプチド５〜７モルの範囲が最適
であった。赤血球細胞を結合する接合体の能力は、ウサ
ギ抗マウス抗体及びHIV陽性の完全な血液による凝集試
験を用いて調節された。

4. ゲル濾過クロマトグラフィー反応されなかったペプチド及びSPDP副生成物をリン酸
緩衝溶液中、Superose6カラム（Pharmacia）を充填する
ゲル濾過クロマトグラフィーにより除去し、そして抗体
含有画分をプールし、そして保存剤として0.01％のアジ
化ナトリウムの添加の後、４℃で保存した。

5. アッセイのための試薬の調製接合体２体積と、Bundesen、など．、Vet.Immun.,Imm
unopath.８,245〜260,1985に記載のようにして調製され
た非関連モノクローナル抗体（Bruce5）の10mg/ml溶液
１体積とを混合した。

アッセイ方法アッセイのために、ヘパリン化された完全な血液10μ
を、ガラススライド上に置いた。試薬30μを添加
し、そして混合した。そのスライドを３分までの間、揺
り動かし、そして凝集の存在又は不在が示された。

９種の独立したペプチド／抗体接合体が調製され、そ
して血漿陽性患者の赤血球細胞を凝集することにおいて
活性であることが見出された。活性接合体はまた、架橋
剤として、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルを用いても調製された。

結果は、類似する抗原を用いる酵素イムノアッセイに
より観察される結果に少なくとも正確に匹敵した（第１
表）。

血液サンプルの比較試験が、赤血球アッセイにより得
られる陽性物及び陰性物を確認するためにELISAにより
行われた。

対照の血液サンプルは、ELISA陰性血液サンプル及び
感染された患者からのELISA陽性サンプルを含んで成
る。HIV陽性患者は、Victorian State Reference Labor
atoryによりウェスターンブロットが陽性であることが
確かめられた。フェアーフィールド病院の患者は、ウェ
スターンブロット又はEIA（Abboto Laboratories）のい
ずれも陰性であった。血液供与者をEIA（Genetic Syste
ms）により試験した。誤った陽性又は陰性値は、かっこ
内に示され、そしてEIA又はウェスターンブロット分析
により確認された。

試験の特異性を評価するために、HIV−１エンベロー
プタンパク質の他の領域に対応する一連の合成ペプチド
を、凝集反応を阻害するそれらの能力について試験した
（第２表）。非関連ペプチドは競争せず、そして必須カ
ルボキシ末端エピトープ領域を欠く合成gp41フラグメン
ト、すなわち残基572〜591は、凝集を阻害しなかった。
合成遊離抗原による凝集の阻害は、時おりの弱い陽性サ
ンプルを確認することにおいて有用であった。合成ペプ
チドの添加が凝集を阻害しそこなう場合、それは抗−赤
血球細胞抗体に関連する誤った陽性を示すであろう。

合成ペプチド（0.125mg/ml）を、完全な血液の添加の
前、接合された抗体に添加した。その凝集試験を、上記
のようにして行った。共通配列は下線が引かれる。

例３−キメラ抗体（抗−グリコホリン／抗−ヒトＤ−ダ
イマー）の調製及びＤ−ダイマーのためのアッセイへの
使用モノクローナル抗体RAT 1C3/86（抗−ヒト赤血球細
胞）及びDD−1C3/108（Rylatt、など．、1983,Thrombos
is Res.,31,767〜778に記載のような抗−ヒトＤ−ダイ
マー）を、Hackman、など．、1981,Immunology,15,429
〜436による記載のようにしてペプシンにより消化し、
そしてTSK−3000SWカラムによるクロマトグラフィーに
より精製した。2mgのRAT 1C3/86を、0.1Mの酢酸、70mM
の塩化ナトリウムを含む緩衝液（pH3.5）中において１
％w/wペプシンにより45分間消化した。その間に、2mgの
DD−1C3/108を、同じ緩衝液中において２時間１％w/wペ
プシンにより消化した。それらの反応を、1.5MのTrisの
添加により停止し、pHを８に高めた。Ｆ（ab）_２フラグ
メントを、TSK−3000SWカラムによるゲル濾過クロマト
グラフィーにより精製した。

Ｆ（ab）_２の還元及びFabフラグメントの続くブロッ
キングを、Brennan、など．、1985,Science 229,81〜83
に記載のようにして行った。3mg/mlのＦ（ab）_２調製物
を、10mMの亜砒酸ナトリウムの存在下で、16時間25℃で
1mMのメルカプトエチルアミンにより処理した。Fabフラ
グメントを、5,5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸）（Ellman試薬）により25℃で３時間反応せしめるこ
とにより安定化した。次に、Fabフラグメントを、TSK−
3000SWカラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにより
精製した DD−1C3/108のチオール形を、25℃で30分間の10mMの
メルカプトエルアミンによる反応により再生した。過剰
の試薬を、TSK−3000SWカラムによるゲル濾過クロマト
グラフィーにより除去した。チオールDD−1C3/108及びE
llman試薬により処理されたRAT 1C3/86の混合物を、Bre
nnan、などにより記載されているようにして25℃で16時
間インキュベートした。最後に、キメラ抗体を、TSK−3
000SWカラムによるゲル濾過クロマトグラフィーにより
精製した。

試薬の調製 0.1mg/mlのキメラ抗体２体積と、7.5mg/mlの非関連モ
ノクローナル抗体（Bruce5）１体積とを混合した。

アッセイ方法アッセイのために、ヘパリン化された完全な血液10μ
をガラススライド上に置いた。試薬30μを添加し、
そして混合せしめた。スライドを３分間振動せしめ、そ
してＤ−ダイマーの存在下で凝集を観察した。

例４−SPDP−接合ジゴキシン／抗−グリコホリン抗体接
合体の調製ジゴキシン/Ab接合体の調製１）過ヨウ素酸酸化されたジゴキシンの調製。

100mMの過ヨウ素酸ナトリウム2mlを、ジゴキサン（Si
gma）40mgに滴下し、95％エタノール2ml中に懸濁し、そ
してその反応を37℃で30分間続けた。その反応を、IMエ
タンジオール60μの添加により停止せしめた。最後
に、シップ塩基中間体を、40mMのシスチンの添加（30
分:37℃）及び続く15mg/mlの水素化硼素ナトリウム1ml
による反応（16時間:25℃）により安定化した。

２）シスチン／ジゴキシン接合体の還元。

シスチン／ジゴキシン接合体3mlを、メルカプトエタ
ノール40μの添加により還元し（40分:37℃）、そし
てその生成物を、例１におけるペプチドの還元について
記載のようにしてWaters Sep−pak C18カートリッジに
よるクロマトグラフィーにより精製した。回転蒸発の
後、サンプルを、SPDPラベルされたRAT 1C3/86〔例１に
記載のようにして５プロピルジチオピリジン基／抗体に
よりラベルされている（16時間:25℃）〕と反応せしめ
た。最後に、ジゴキシン／抗体接合体を、Superose12を
充填するゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。

例５−HIVペプチド／抗−グリコホリンＦ（ab）_２接合
体の調製抗−HIV抗体のためのもう１つの試薬は、抗−グリコ
ホリン抗体のＦ（ab）_２誘導体を使用する。

RAT 1C3/86（70mMの酢酸塩、100mMの塩化ナトリウム
（pH3.5）中において2mg/ml）を、10μg/mlのペプシン
（Sigma P6887）により37℃で40分間消化し、そして反
応を、1.5MのTris塩基1/10体積の添加により停止せしめ
た。5mMのリン酸ナトリウムを含む緩衝液（pH8.0）への
一晩の透析の後、抗体フラグメントを、リン酸ナトリウ
ム（pH8.0）の５〜300mMグラジェントに基づいて、DEAE
セルロースを充填するイオン交換クロマトグラフィーに
より精製した。

Ｆ（ab）_２フラグメントのSPDPラベリング、ペプチド
3.2の還元、ペプチド3.2のＦ（ab）₂RAT 1C3/86への接
合、そのペプチド接合体の精製、アッセイのための試薬
の調製及び試験方法を、完全な抗体接合体について記載
のようにして行った。

他の赤血球又は分析物結合抗体のＦ（ab）_２接合体
を、同様にして調製し、そしてHIVペプチド以外の分子
に結合することができる。

例６−HIVペプチド／抗−グリコホリンFab′接合体の調
製もう１つの試薬は、EBMとして一価のFab′フラグメン
トを使用する。

リン酸緩衝溶液中、Ｆ（ab）₂RAT 1C3/86を、室温で
１時間、10mMのメルカプトエタノールと共にインキュベ
ートした。次に15mMのヨードアセトアミドを添加し、そ
してその反応を暗やみ中で15分間進行せしめた。最後
に、その反応を、リン酸緩衝溶液100体積中への透析に
より停止せしめた。

ｓ−カルボキシメチル化されたFab′のSPDPラベリン
グ、ペプチド3.2の還元、ペプチド3.2のRAT 1C3/86のFa
b′−TNB（チオニトロベンゾイル）RATフラグメントへ
の接合、そのペプチド接合体の精製、アッセイのための
試薬の調製及び試験方法を、完全な抗体接合体について
記載したようにして行った。

例７−代わりのEBMとしてのメリチンの調製ハチの毒からのペプチド、すなわちメリチン（CVLTTG
LPALISWIKRKRQQ）を、赤血球結合性モノクローナル抗体
に代わるものとして使用した。このペプチドは、細胞を
溶解しないで赤血球表面に結合する（Degrado WF,Kezdy
FJ,Kaiser ET.J.Am.Chem.Soc.1981;103;679〜81）。そ
のペプチドを、Merrifieldの方法（Hodges,Merrifield.
Anal.Biochem.1975;65;241）により合成した。

EBMとしてメリチンを使用することの１つの利点は、
それが及びペプチドタイプABMが単一の単位として合成
され得ることである。

例８−EBM及びABMを結合するためにアビジン−ビオチン
結合の使用 ABM及びEBMは、共有結合される必要はない。１つの代
用手段は、アビジン−ビオチン結合である。

ビオチンによりラベルされたメリチンの調製メリチンペプチド（10mg）を、例１における3.2ペプ
チドについて記載しているようにしてメルカプトエタノ
ールにより還元した。回転蒸発した後、サンプルを0.1M
のTris−HCl,5mMのEDTA（pH8.0）の溶液2ml中に再懸濁
し、そしてＮ−ヨードアセチル−Ｎ−ビチオニルヘキシ
レンジアミン（Pierce）4.3mgを含むジメチルスルホキ
シド（DMSO）1mlと反応せしめた。これを室温で15分間
反応せしめ、そしてビチオニル化された誘導体を、Seph
adex G10カラムにより副生成物から分離した。

アビジンによりラベルされたペプチド3.2の調製 3.2ペプチドを、それが例１において抗体に結合され
たのと同じ態様でアビジンに結合する。

アッセイアビジンによりラベルされたペプチドの半凝集投与量
を赤血球細胞に添加する。

注釈アビシン化され且つビチオニル化された分子は、交換
され得ることが理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、それぞれ抗原の存在及び不在下で抗体複合体
による陽性及び陰性の凝集結果を示す赤血球の図的な表
示である。第２図は、それぞれ抗−抗原抗体の存在及び不在下で抗
体及び抗原の複合体による陽性及び陰性の凝集結果を示
す赤血球の図的な表示である。第３図は、赤血球凝集及び分析物又は抗原の存在による
赤血球凝集の阻害を示す図的な表示である。第４図は、オーバーラッピング抗原アッセイと共に凝集
／非凝集の機構を示す図的な表示である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号１４３３４３ (32)優先日 1988年１月13日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ）審判番号平7−10962 (72)発明者デニスビー．ライラットオーストラリア国，クイーンズランド, 4064，ロザリー，ハワードストリート 106 (72)発明者ブルースイー．ケンプオーストラリア国，ビクトリア 3101, キュー，ケレットグローブ 20 (72)発明者ピーターグレゴリーバンドゥセンオーストラリア国，クイーンズランド, 4069，フィグトゥリーポケット，ゲイムズストリート 15 (56)参考文献特開昭58−55759（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−203919（ＪＰ，Ａ) 特表昭61−501418（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】赤血球を含む血液サンプル中の分析物の直
接的な検出のための凝集試薬であって、分析物結合分子
に連結される赤血球結合分子を含んで成り、ここで前記
赤血球結合分子が、その結合分子の結合特性が前記連結
により変えられないような態様で前記分析物結合分子に
連結され、且つ前記赤血球結合分子が血液サンプルに内
因性の赤血球を結合するが、しかし分析物の不在下での
内因性赤血球を凝集しないことを特徴とする試薬。
【請求項２】前記赤血球結合分子が、非一価抗−赤血球
抗体；非一価抗−赤血球抗体の非一価フラグメント；非
一価抗−赤血球抗体のフラグメント；抗−赤血球抗体の
Ｆ（ab）_２フラグメント；抗−赤血球抗体のFab′フラ
グメント；赤血球膜のための親和性を有するが、しかし
赤血球を溶解することはできないペプチド；赤血球膜の
ための親和性を有するが、しかし赤血球を溶解すること
ができず且つ抗体又はレクチンに由来しないペプチド；
赤血球を単独では凝集しないプロタミンの非溶解性赤血
球結合フラグメント；メリチン；メリチンの特異的結合
フラグメント；レシチン；レシチンの特異的結合フラグ
メント；抗−グリコホリン抗体；抗−グリコホリンの特
異的結合フラグメント；抗−グリコホリンＡ抗体及び抗
−グリコホリンＡ抗体の特異的結合フラグメントから成
る群から選択される請求項１記載の試薬。
【請求項３】前記赤血球結合分子が抗−赤血球抗体、又
はそのＦ（ab）_２又はFab′フラグメントを含んで成
り、そして前記抗体又はそのＦ（ab）_２又はFab′フラ
グメントがグリコホリンＡ、グリコホリンＢ、膜内在性
タンパク質１、膜結合糖タンパク質C4、膜内在性糖タン
パク質、アンキリン、スペクトリングリコホリン、糖脂
質、スフィンゴ糖脂質、プロテイン４−１又はＦ−アク
チンに対して生ぜしめられる請求項１記載の試薬。
【請求項４】前記赤血球結合分子が、ATCC寄託番号第HB
9893号を有する細胞系G26.4.IC3/86により生成される非
一価抗−赤血球抗体又はその抗体のＦ（ab）_２又はFa
b′フラグメントを含んで成る請求項１記載の試薬。
【請求項５】前記赤血球結合分子が抗−赤血球抗体に由
来する一価フラグメントを含んで成り、そして前記分析
物結合分子が抗−分析物抗体に由来する一価フラグメン
トを含んで成る請求項１〜３のいづれか１項記載の試
薬。
【請求項６】前記分析物がHIVに対する抗体を含んで成
る請求項１〜３のいづれか１項記載の試薬。
【請求項７】前記分析物結合分子がHIV−１ペプチド又
は肝炎ウィルスペプチド、ジゴキシン、又はヒトＤ−ダ
イマー又は肝炎ウィルスに対して生ぜしめられた抗体又
はそのＦ（ab）_２又はFab′フラグメント、又は抗−イ
ディオタイプ抗体を含んで成る請求項１〜３のいづれか
１項記載の試薬。
【請求項８】前記HIV−１ペプチドがgp41ペプチドを含
んで成る請求項７記載の試薬。
【請求項９】前記赤血球結合分子が共有結合により分析
物結合分子に結合される請求項１〜８のいづれか１項記
載の試薬。
【請求項１０】前記試薬が多くの異なった型の接合体を
含んで成り、そして前記個々の型の接合体の分析物結合
分子がその分析物の異なったエピトープに結合する請求
項１〜４のいづれか１項記載の試薬。
【請求項１１】前記赤血球結合分子が、赤血球膜のため
の親和性を有するが、しかし赤血球を溶解することがで
きず、且つ抗体又はレクチンに由来しないペプチドを含
んで成る請求項１記載の試薬。
【請求項１２】前記ペプチドがハチ毒様ペプチドを含ん
で成る請求項11記載の試薬。
【請求項１３】前記赤血球結合分子が表面タンパク質又
は糖タンパク質を結合するが、しかし前記分析物結合分
子はそれを結合しない請求項１記載の試薬。
【請求項１４】前記赤血球結合分子が赤血球膜のための
親和性を有するペプチドを含んで成り、そして前記分析
物結合分子がペプチド又はタンパク質であり、そして前
記赤血球結合分子及び分析物結合分子が単純なペプチド
結合により接合される請求項１記載の試薬。
【請求項１５】前記赤血球結合分子が、赤血球を単独で
は凝集しないメリチンの非溶解性赤血球結合フラグメン
トに対応する請求項14記載の試薬。
【請求項１６】異種二官能価抗体又は抗体の異種二官能
価結合フラグメントを含んで成り、前記抗体又はフラグ
メントが赤血球を結合するがしかし分析物を結合しない
赤血球結合分子及び分析物を結合するがしかし赤血球を
結合しない分析物結合分子を含んで成り、前記赤血球結
合分子が１又は複数のジスルフィド結合によるが、異種
二官能価カップリング剤にはよらないで前記分析物結合
分子に接合され、前記抗体又はフラグメントが同種二官
能価赤血球結合抗体及び同種二官能価分析物結合抗体の
異種二官能価ハイブリッドを形成することによって調製
されることを特徴とする請求項１記載の試薬。
【請求項１７】前記赤血球結合分子がグリコホリンを結
合する請求項16記載の試薬。
【請求項１８】前記赤血球結合分子がグリコホリンに対
する抗体又はその特異的結合フラグメントを含んで成る
請求項17記載の試薬。
【請求項１９】前記分析物結合分子がヒトＤ−ダイマー
を結合する請求項16記載の試薬。
【請求項２０】異種二官能価Ｆ（ab）_２を含んで成る請
求項16記載の試薬。
【請求項２１】前記分析物結合分子がイヌ糸状虫（hear
tworm）に関連する抗原を結合する請求項１記載の試
薬。
【請求項２２】前記分析物への前記分析物結合分子の結
合により形成されるオーバーラッピングエピトープを特
異的に認識する、第二抗体又はその特異的結合フラグメ
ントをさらに含んで成る請求項１記載の試薬。
【請求項２３】前記第二抗体が赤血球結合分子に結合さ
れる請求項22記載の試薬。
【請求項２４】前記赤血球がヒト赤血球である請求項１
〜23のいづれか１項記載の試薬。
【請求項２５】赤血球を含む血液サンプル中の分析物の
間接的な検出のための凝集試薬であって、分析物類似体
に連結される赤血球結合分子を含んで成り、ここで前記
赤血球結合分子が、その結合分子の結合特性が前記連結
により変えられないような態様で前記分析物類似体に連
結され、且つ前記赤血球結合分子が血液サンプルに内因
性の赤血球を結合するが、しかし分析物結合試薬の不在
下で内因性赤血球を凝集しないことを特徴とする試薬。
【請求項２６】前記赤血球結合分子が、非一価抗−赤血
球抗体；非一価抗−赤血球抗体の非一価フラグメント；
非一価抗−赤血球抗体のフラグメント；抗−赤血球抗体
のＦ（ab）_２フラグメント；抗−赤血球抗体のFab′フ
ラグメント；赤血球膜のための親和性を有するが、しか
し赤血球を溶解することはできないペプチド；赤血球膜
のための親和性を有するが、しかし赤血球を溶解するこ
とができず且つ抗体又はレクチンに由来しないペプチ
ド；赤血球を単独では凝集しないプロタミンの非溶解性
赤血球結合フラグメント；メリチン；メリチンの特異的
結合フラグメント；レシチン；レシチンの特異的結合フ
ラグメント；抗−グリコホリン抗体；抗−グリコホリン
の特異的結合フラグメント；抗−グリコホリンＡ抗体及
び抗−グリコホリンＡ抗体の特異的結合フラグメントか
ら成る群から選択される請求項25記載の試薬。
【請求項２７】前記赤血球結合分子が項−赤血球抗体、
又はそのＦ（ab）_２又はFab′フラグメントを含んで成
り、そして前記抗体又はそのＦ（ab）_２又はFab′フラ
グメントがグリコホリンＡ、グリコホリンＢ、膜内在性
タンパク質１、膜結合糖タンパク質C4、膜内在性糖タン
パク質、アンキリン、スペクトリングリコホリン、糖脂
質、スフィンゴ糖脂質、プロテイン４−１又はＦ−アク
チンに対して生ぜしめられる請求項26記載の試薬。
【請求項２８】前記赤血球結合分子が、ATCC寄託番号第
HB9893号を有する細胞系G26.4.IC3/86により生成される
非一価抗−赤血球抗体又はその抗体のＦ（ab）_２又はFa
b′フラグメントを含んで成る請求項25記載の試薬。
【請求項２９】前記分析物がHIVに対する抗体を含んで
成る請求項25〜28のいづれか１項記載の試薬。
【請求項３０】前記赤血球結合分子が、赤血球膜のため
の親和性を有するが、しかし赤血球を溶解することがで
きず、且つ抗体又はレクチンに由来しないペプチドを含
んで成る請求項26記載の試薬。
【請求項３１】前記ペプチドがハチ毒様ペプチドを含ん
で成る請求項30記載の試薬。
【請求項３２】前記赤血球結合分子が共有結合により分
析物類似体に結合される請求項25〜31のいづれか１項記
載の試薬。
【請求項３３】前記赤血球結合分子が赤血球膜のための
親和性を有するペプチドを含んで成り、そして前記分析
物類似体がペプチド又はタンパク質であり、そして前記
赤血球結合分子及び分析物類似体が単純なペプチド結合
により接合される請求項26記載の試薬。
【請求項３４】前記赤血球結合分子が、赤血球を単独で
は凝集しないメリチンの非溶解性赤血球結合フラグメン
トに対応する請求項30又は33記載の試薬。
【請求項３５】前記赤血球がヒト赤血球である請求項25
〜34のいづれか１項記載の試薬。
【請求項３６】赤血球を含む血液サンプル中の分析物の
存在についての直接的な凝集アッセイ法であって、前記
サンプルと請求項１〜24のいづれか１項記載の凝集試薬
とを、分析物及び赤血球に生じる結合が凝集を引き起こ
すのに十分な時間、混合し；赤血球が凝集されるかどう
かを観察し、そしてその観察される凝集の程度から前記
分析物の存在を決定することを含んで成るアッセイ法。
【請求項３７】赤血球を含む血液サンプル中の分析物の
存在又は量についての間接的な凝集アッセイ法であっ
て、請求項25〜35のいづれか１項記載の凝集試薬及び可
溶性分析物結合試薬と共に前記サンプルをインキュベー
トし、それによって前記凝集試薬が前記分析物結合試薬
の分析物結合部位のためにサンプル分析物と競争し、こ
こで前記インキュベーションは凝集を妨げるために前記
分析物類似体への前記分析物結合試薬の結合を妨げるの
に十分な時間であり、凝集が生じるかどうかを観察し、
そして凝集の程度の逆数から前記分析物の存在又は量を
決定することを含んで成るアッセイ法。
【請求項３８】前記サンプル及び接合体がサンプルに内
因性の赤血球とのみ実質的に接触される請求項36又は37
記載のアッセイ法。
【請求項３９】請求項１〜35のいづれか１項記載の凝集
試薬及び既知量の分析物を含む対照溶液を含んで成る凝
集アッセイ試験キット。