JPH02264863A - ヒトイムノグロブリンＦｃ断片と人以外の哺乳動物抗体とのコンジユゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は自己免疫疾患の診断に用いる免疫化学的？＃ｊ
定方法に関する。詳しくは、ヒト臨床サンプル中に含ま
れる自己抗体の免疫化学的測定において有用なポジティ
ブコントロールとなる抗体コンジュゲートを提供する。

〔従来の技術〕

自己免疫疾患は種々の自己抗原に対する抗体が体内に過
剰に出現し、その結果、様々な抗原抗体反応に起因する
炎症性の疾患が体内の各所で生じる一群の病気である。

自己抗原には、単鎖ＤＮＡ　（ｓｓ−ＤＮＡ）、二重鎖
ＤＮＡ　（ｄｓ−ＤＮＡ）　、リボヌクレオプロティン
（ｒｌｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｌｎｓ又はＲＮＰ）
、ヒストン（ｈｉｓｔｏｎｓ）　、非ヒストン核蛋白（
ｎｏｎ　−ｈｉｓｔｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）等の細胞
核成分、ミクロソーム（ａｌｃｒｏｓｏｉｅ）　、ミト
コンドリア（ｓｉｔｏｃｈｏｎｄｒｌａ）等の細胞質小
器官、サイログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
）、変性免疫グロブリンＧ　（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　Ｉ
　ｇ　Ｇ）等の血漿蛋白質、及び、種々の臓器に特異的
な細胞膜のレセプター等が挙げられる。

また、これら自己抗原に対する抗体、即ち自己抗体は、
ヒトでは例えば、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅ
ｏ＋ｉｃ　Ｉｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｓａｔｏｓｕｓ）
、シエーグレン症候群（Ｓｊｏｅｇｒｅｎ’ｓ　ｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ）、全身性進行性硬化症（ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｔｖｅ　５ｙｓｔｅａ＋１ｃｓｃｌｅｒｏｓｌｓ）、慢
性関節リューマチ（ｃｈｒｏｎｉｃｒｈｃｕａ＋ａｔｏ
ｌｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）　、混合性結合織疾患（ｍ
ｉｘｅｄ　ｃｏｎｎｅｃｔｌｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｄｌ
ｓｅａｓｅｓ）、自己免疫性甲状腺疾患（ａｕｔｏｉａ
＋ｍｕｎｃ　ｔｈｙｒｏｌｄ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）等の
自己免疫疾患患者血液中に高頻度、高濃度で見出される
。

一般に、これらの自己免疫疾患の診断は血液中の自己抗
体を免疫化学的測定法により検出することによってなさ
れる。

現在までに、自己免疫疾患の診断に用いられている様々
な免疫化学的測定法の中では、細胞成分については固定
組織の免疫蛍光法（１ｍｍｕｎｏＮｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
　ａｓｓａｙ）、又、液性成分に関してはラジオアイソ
トープ標歳抗体法（ＲＩ　Ａ）が主として実施されてい
る。免疫蛍光法は、ラット肝切片、原虫のクリシブイア
、ヒト上皮細胞由来の培養細胞ＨＥｐ−２等を検出用組
織として、検体中の抗核抗体を反応させ、次いで蛍光色
素標識抗体で標識し蛍光顕微鏡下に細胞の蛍光染色パタ
ーンを観察する方法である。又、ＲＩＡによる自己免疫
疾患の診断は、定量性及び感度にすぐれており、精製あ
るいは粗精製抗原をプラスチックプレートに固定して、
それらの固定自己抗原に検体中の自己抗体反応させ、ラ
ジオアイソトープで標識した抗ヒト１ｇＧ兎ポリクロー
ナル抗体等の二次抗体により検出する方法である。

さらに、最近では、ラジオアイソトープの管理が繁雑な
ＲＩＡに替る非放射性標識法として、酵素を用いる酵素
免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ　ｉａ＋ａ＋ｕｎｏａｓｓａ
ｙ）、化学発光物質を用いる化学発光免疫測定法（ｃｈ
ｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｔｓｒｘｕｎｏａ
ｓｓａｙ）　、フリーラジカルを用いるスピンイムノア
ッセイ（ｓｐｉｎｌｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、金属を用
いるメタロイムノアッセイ（＋５ｅｔａｌｌｏ　ｌａ＋
ｍｕｎｏａｓｓａｙ）が使用されるようになってきた。

なかでも、酵素免疫測定法はその迅速性、信頼性及び操
作の簡便性から、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ　１ｉ
ｎｋｅｄ　ｉａｕ＊ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ
）等とじて種々の抗原や抗体の７１ｐＪ定に今後層も好
く使用されると考えられている。

また、標識物質を使用しない、より自動化された免疫化
学的測定法としては、従来あったラテックス凝集反応を
定量化システム化した比ろう法（ｎｅｐｈｅｒｏｔｇｅ
ｔ　ｒｙ）や比濁法（ｔｕｒｂｌｄｌｍｅｔｒｙ）があ
げられる。

〔本発明が解決しようとする問題点〕

生体試料中の自己抗体をいずれの標識物質による免疫化
学的測定法により定量する場合でも、比較対照する標準
試料（以下、ポジティブコントロール）として従来用い
られてきたのは自己免疫病、息患者から得られた患者血
清である。

自己抗体の免疫化学的測定法は次のとおりである。最初
に自己抗原をプラスチックウェル等の固体支持体に固定
する。次に、自己抗体を含む検体を固定抗原に結合させ
抗原抗体コンプレックスを形成させる。さらに酵素や放
射性抗体で標識したウサギやヤギ等の抗ヒトイムノグロ
ブリン抗体を２次抗体として先の抗原抗体コンプレック
スに結合させる。これらの標識体の結合量をポジティブ
コントロールと比較して検体中の自己抗体量を算出する
。

このポジティブコントロールは、一般に測定しようとす
る自己抗体を血清中に高濃度で含む自己免疫疾患患者血
清である。しかし、診断用キットを作成するための、充
分かつ質的に一定した自己免疫抗体を含む血清を得るこ
とは、倫理的にも、この疾患の頻度から見ても必ずしも
容易ではない。

それゆえに、患者血清以外からポジティブコントロール
を得ることが強く望まれていた。

患者血清以外から、そうしたポジティブコントロールを
得る手段として現在までに考えられているのは次のよう
な方法である。

第一の方法は、安定したヒト自己抗体産生細胞株を樹立
することである。こうした細胞株が一旦確立したら、均
一なヒト自己抗体をコンスタントに入手することができ
る。現在、ＥＢウィルス処理、マウスミエローマとの細
胞融合等により自己免疫疾患患者の抗体産生リンパ細胞
を不死化する方法がいちおう確立している。しかし、こ
の方法の難点は、効率よく抗体を産生できる細胞株の確
立の頻度はまだいぜんとして低く、かつ−度確立した細
胞株の安定性も充分でないことである。ポジティブコン
トロールの安定供給源とできるほどの細胞株を各種の自
己抗原について確立することは現在なお困難である。

他方、マウスのモノクローナル抗体を作成する技術は現
在はぼ確立している。ヒト自己抗原に対するマウスモノ
クローナル抗体の抗原認識部位をコードする遺伝子と、
ヒトイムノグロブリンの定常領域をコードする遺伝子を
、遺伝子操作により結合し、いイっゆる、ヒトマウスキ
メラ抗体を作成するのも、もう一つの方法として考えら
れる。しかし、遺伝子操作により、それぞれの自己免疫
抗体に関して充分な二を産生させることは、やはり現在
ではまだ困難である。

本発明者らは、ヒト自己抗原に対するマウスモノクロー
ナル抗体を作成し、抗体そのまま、又はその抗原認識部
位を含む変異領域、Ｆａｂを特異的なプロテアーゼで切
出し、精製分離し、また、市販品で容易に人手可能なヒ
トイムノグロブリンを同様にプロテアーゼで消化し、定
常領域Ｆｃを分離精製して、これら２つのフラグメント
を適当な架橋化合物で連結した複合分子（以下、抗体コ
ンジュゲート）を得ることを考えた。この複合分子を作
成する反応はいずれも簡略で再現性がよく、一定した質
の抗体コンジュゲートを供給することが可能である。ま
た、このようにして得られた抗体コンジュゲートは、そ
のマウス由来の抗原認識部位により、ＥＬＩＳＡプラス
チックウェル等の固定支持体に固定された抗原に結合す
ることができ、他方、そのヒト由来のイムノグロブリン
の定常領域により、標識した抗ヒトイムノグロブリン抗
体（標識二次抗体）と結合できる。即ち、自己免疫疾患
患者の血清の供給を待つことなく安定した、自己抗体の
免疫化学的測定系において充分使用できるポジティブコ
ントロールが入手可能となる。

〔発明のｈｓ”ｉ成〕

本発明による、自己免疫疾患診断のための臨床サンプル
中の自己抗体の定量的な免疫化学的ｉ’１ｌｌｌ定方法
及び機器は、ポジティブコントロールとしてヒトイムノ
グロブリンのＦｃ断片とヒト自、己抗原に特異性を有す
るヒト以外の哺乳動物の抗体を、化学的架橋試薬により
共角゛結合させて作成したヒト−動物抗体コンジュゲー
トを使用することを特徴とする。

本発明におけるヒトイムノグロブリンのＦｃ断片は、市
販されているＦｃ断片（例えば、ミドリ十字■から入手
できる）を使うこともできるし、市販のヒトイムノグロ
ブリン（例えば、ヘキストジャバン沖やミドリ十字■か
ら入手できる）をパパインやペプシン等のプロテアーゼ
で消化し得られたＦｃ断片を精製して使用することもで
きる。

また、ヒト自己抗原に特異性を有する咽乳動物の抗体と
しては、ヒト自己抗原に特異性を有するウサギ、ヤギ、
ヒツジ、ラット又はマウス等から得られる抗体が使用で
きる。好ましくは、半永久的な安定した供給が可能であ
ることで、ヒト自己抗原で感作したマウス肺臓及び適当
なミエローマ細胞を細胞融合させて作成し選抜されたハ
イブリドーマにより生産されるヒト自己抗原に特異的な
モノクローナル抗体を使用することができる。使用でき
る精製ヒト自己抗原としては、単鎖ＤＮＡ若しくは二重
鎖ＤＮＡ等の核酸、Ｕｌ−ＲＮＰ。

Ｓ１若しくはＲｏ／５Ｓ−Ａ等のりボヌクレオプロテイ
ン、ヒストン、及びＪｏ−１、ＰＣＮＡ若しくはＭｌ−
１等の非ヒストン核蛋白等の細胞核成分、ミクロソーム
及びミトコンドリア等の細胞質小器官、サイログロブリ
ン等の血漿蛋白質、種々の臓器、例えば甲状腺、膵臓、
副腎等の細胞膜のホルモンレセプター等が挙げられる。

また、化学的架橋剤としては蛋白質分子のアミノ基、チ
オール基又はその他の部位に反応できる二価の活性部位
を持つ市販の種々の化学的架橋剤が使用できる。例えば
、γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド（γ−
ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕＬｙｒｙｌｏｘｙｓｕｃｃｌｎ
ｉｍｉｄｏ　：　Ｇ　Ｍ　Ｂ　Ｓと略）、ビスマレイミ
ドメチルエーテル（ｂｌｓ−ｍａｌｅｂｎｉｄｏｍｅｔ
ｈｙｌｅｔｈｅｒ：　Ｂ　Ｍ　Ｍ　Ｅ　ｃ！：略）、（
ＣＭＢＳ及びＢ　Ｍ　Ｍ　Ｅはへスキトジャパン■等か
ら入手できる。）やＮ−スクシンイミヂル（４−ヨード
アセチル）アミノベンゾエイト（Ｎ−ｓｕｃｃｌｎｉｍ
ｌｄｙｌ　（４−１ｏｄｏａｃｃｔｙｌ）ａｍｌｎｏｂ
ｅｎｚｏａｔｅ　：　Ｓ　Ｉ　Ａ　Ｂと略。米国ピアス
社等から入手できる。）等が使用できる。

本発明による、自己免疫疾患診断のための臨床サンプル
中の自己抗体の定量的な免疫化学的、９ノ定方法として
は、ラジオアイソトープ標識抗体法、酵素免疫測定法、
化学免疫発光測定法、スピンイムノアッセイ、メタロイ
ムノアッセイ等の種々の標識抗体法がある。なかでも、
迅速性、信頼性及び操作の簡便性という利点を有する酵
素免疫測定法のなかのＥＬ　Ｉ　ＳＡによる化１定にお
いて使用できる。

本発明を用いた自己免疫疾患の診断装置は例えば、全身
性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性進行
性硬化症、慢性関節リューマチ、混合性結合織疾患、皮
膚筋炎ＣｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓＩｔｒｓ）、多発性筋
炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｊｔｉｓ）又は自己免疫性甲状腺
疾患等の診断に使用できる。

本発明の効果を以下の参考例及び実施例により説明する
。

以下の参考例および実施例において用いられる５Ｓ−Ｂ
／Ｌａは、ある種の手積リボ核酸蛋白（ｓｍａｌｌ　ｎ
ｕｃｌｅａｒ　ＲＮＡ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）であり分子
量は４７ｋＤである。この抗原に対する自己免疫抗体は
、例えば、全身性エリテマトーデスやシエーグレン症＃
Ｆｃ群の自己免疫疾患患者血液中にしばしば見出され、
自己免疫疾患の診断法のひとつとしてすでに用いられて
いる。５Ｓ−Ｂ／Ｌａはウサギや仔牛の胸＃細胞から分
離精製することが知られている。また仔牛胸腺由来の５
Ｓ−Ｂ／Ｌａを従来法により精製し、抗原としてモノク
ローナル抗体を作成した例としてはＪ、　Ｂ、　ｌ１ａ
ｒｌｅｙ　（Ｊ、　Ｃｌ１ｎＩｎｖＣｓｔ、、　　７［
ｆ、　８０１−８ＯＬ　（１９８５））やＥ、　Ｋ、　
Ｌ。

Ｃｈａｎ　（Ｊ、　Ｈｘｐ、　Ｍｅｄ、、　ＩＧＯ，１
Ｉｉ２７−１８４０．　（１９８７））の報告がすでに
知られている。

参考例　１　　抗５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原モノクローナル抗
体の作成 （１，）　　Ｓ　Ｓ　−Ｂ／Ｌａ抗原の精製ウサギ胸腺
細胞アセトン粉末（ベルフリーズ社。

米国）にＯ，０１Ｍリン酸緩衝１ｆｆｌｏ、１５Ｍ　　
Ｎ　ａ　ＣΩｐＨ７，２（ＰＢＳ）を加え、１８時間、
４℃で攪拌し、その後８０００ｒｐｍで４０分間遠心分
離した。分離後、上清の硫酸アンモニウム２５〜７５％
飽和分画を１２０００ｒｐａ＋で３０分間遠心分離し、
沈渣をＰＢＳに溶解した。この溶液を抗５Ｓ−Ｂ／Ｌａ
抗体高力価患者由来のＩｇＧ吸着セファロース４Ｂカラ
ムに１８時間、４℃で反応させ、カラムをＰＢＳ及び０
　、０１　Ｍリン酸緩衝液Ｉ　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＲｐＨ
７，２で充分に洗浄した後、３Ｍチオシアン酸カリウム
溶液で特異抗体と反応した５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原を溶出し
た。溶出した抗原はウサギ抗ヒトＩｇＧと反応する成分
を含むため、さらにウサギ抗ヒトＩｇＧ吸着セファロー
ス４Ｂカラムによりその成分を吸収させ、カラムを素通
りした両分を集めた。この抗原を含む素通り画分はＰＢ
Ｓで１８時間、４℃で透析し、−８０℃で凍結保存した
。

（２）　　免疫マウス牌細胞の調製 ７週令のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ雌マウスにフロイント
コンプリートアジュバントと前記の方法と同様に調製し
た５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原１０μｇ／匹を腹腔内投与し免疫
した。以後・、２週問おきにＳ　Ｓ　−Ｂ／Ｌａ抗原１
０μｇ／匹を静脈内に投与し追加免疫を行った。２回目
の免疫以降、免疫の１０〜１４日後に眼底静脈叢より採
血し、血清中の抗５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原抗体価を固相法に
よる酵素免疫Δｐ１定法により調べた。血清中の５Ｓ−
Ｂ／Ｌａ抗原に対する抗体価が１０３倍以上のマウスに
、更にｓｓＢ　／　Ｌ　ａ抗原Ｌｏｔ１ｇ／匹を静脈内
に投与して追加免疫を行い、３日後にこのマウスから牌
細胞を調製して細胞融合に用いた。

（３）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−ＵｌをＲ
ＰＭＩ−１６４０にグルタミン１．５ｍＭ及び牛胎児血
清１５％を加えた培地に培養（３７℃。

ＣＯ２５％）し、２　Ｘ　１０７個以上の細胞を得た。

（４）ハイブリドーマの調製 ＲＰＭＩ−１６４０でよく洗浄した免疫マウス牌細胞１
．２Ｘ１０８個とマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕｌ、２．４
　Ｘｌ０７個とを混合し、１２００ｒｐｒａで１５分間
遠心分離した。分離後肺細胞とＰ３−Ｕｌの混合した細
胞群をよくほぐした後、攪拌しながら３７℃ポリエチレ
ングリコール１５４０　（和光純薬玉業■より入手）４
ｇとＲＰＭＩ　−１６４０６ｍｌの混液Ｑ、５ｍｌを１
分間かけて加え、その後２００〜８００ｒｌ）Ｉｌｌで
４分間遠心分離した。分離後、３７℃、　ＲＰＭＩ　−
１６４０６ｍ１を５分間かけて攪拌しながら徐々に加え
、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。分離後上清を捨
て、ゆるやかに細胞をほぐした後、ＨＡＴ培地（上記培
地にヒボキサンチン１０−’Ｍ、チミジン１．６×１０
　　Ｍ及びアミノプテリン４　Ｘ　ｌｏ’Ｍを加えた培
地）８０ｍｌを加え、メスピペットでゆるやかに細胞を
懸濁した。懸濁液を９６穴培養用プレートに２００μｇ
／穴ずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２インキユベータ中
で７〜１０日間培養した。コロニー状に生育してきた融
合細胞のみられる穴について培地約半分を捨て、）（Ａ
Ｔ培地を１００μＱ加え培養を続けた。以後、２［１お
きに２〜３回、同様に培地の交換を行い、その後、培養
上清の一部を採取し、抗５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原抗体価を上
記の固相酵素免疫測定法により１ｌｐ１定した。抗体価
の認められた穴については、限界希釈法によりクローニ
ングを行い、安定に抗体価の認められたクローン、ＩＣ
３−Ｎ７を抗５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原モノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ株として選択した。

（５）モノクローナル抗体の生産と精製フロイントコン
プリートアジュバント処理（０，５ｍｆ／匹を細胞投与
の２〜３週間前及び前日に腹腔内投与したもの）した３
０週令ＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに上記で得られたハイプリ
ドーマ株５×１０６細胞／匹を腹腔内投与した。７〜２
１日後に腹水のたまったマウスから腹水５〜１５ｍ１／
匹を採取し、遠心分離して固形物を除去した。上清をプ
ロティンＡ−セファロースを用いたアフィニティクロマ
トグラフィーを行い、０．１Ｍクエン酸バッファー、ｐ
Ｈ５，５で溶出し精製モノクローナル抗体を得た。

（６）モノクローナル抗体ＩＣ３−Ｎ７の抗原特異性モ
ノクローナル抗体ＩＣ３−Ｎ７の特異性をウェスタンブ
ロッティング法により検討した。

抗原としては、上記（１）の方法により得られた５Ｓ−
Ｂ／Ｌａ抗原を用い、ポジティブコントロールとして、
膠原病患者より得た抗５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原抗体陽性血ｍ
Ａ及びＢを用いた。患者血清Ａ、Ｂともに分子ｍ　４７
　ｋ　Ｄの５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原及びその分解産物の分子
ｆｆ１２７ｋＤ及び４０〜４４ｋＤの抗原と反応した。

また、モノクローナル抗体ＩＣ３−Ｎ７は患者血清と同
様に、分子量４７ｋＤの５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原及びその分
解産物である４０〜４４ｋＤの抗原と反応したが、２７
ｋＤの分解産物とは反応しなかった。

実施例　１　　抗体コンジュゲートの作成ツ考例１で作
成されたモノクローナル抗体ＩＣ３−Ｎ７　　ｌｆｆ１
ｇを０．５ｍｌの１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む５０ｍ　Ｍ
リン酸緩衝液（ｐｌ＋７．５）（以下バッファーＡとす
る）に溶解した。溶液中の抗体に対してモル比で２５０
倍に相当するγ−マレイミドブチリルオキンスクシンイ
ミド（γ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏ−ｂｕｔｙｌ　１ｌｏｘ
ｙｓｕｃｃｉｎｉＩＩｌｉｄｃ　：　Ｇ　Ｍ　Ｂ　Ｓと
略）　　９３３ｕｇを１２．５μ２のＮ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミド（以下ＤＭＦと略）に溶解し上述の抗体水
溶液に加え、室温にて２時間攪拌した。過剰の反応を防
ぐためＩＭＭリン酸緩衝液加え、生じたＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド及び過剰のＣＭＢＳをＰＤ−１０（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０：ファ、ルマシア社製）による
ゲルろ過によって除去した。このＰ　Ｄ　−１ｆｌカラ
ムは予めＮ２ガスによって脱酸素化されたバッファーＡ
によって平衡化しておく。Ｐ　Ｄ　−１０より回収され
た蛋白画分を以下の実験に用いた。

一方ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント（凍結乾燥品として
ミドリ十字社より販売されている。）２ｍｇを１ｍｌの
１００ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｃ１、１００ｍＭホウ酸。

５０ｍＭクエン酸、２ｍＭ　　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ５
，５）（以下バッファーＢとする）に溶解し、これにジ
チオスレイトール（以下ＤＴＴという）を最終濃度が２
０ｍＭとなるように加えた。室温にて９０分間攪拌した
のち上述のごとく前処理されたＰ　Ｄ　−１０カラムに
より過剰のＤＴＴを除いた。精製されたモノクローナル
抗体ＩＣ３ｌＣ５−Ｈ７−Ｇ付加物と、ＤＴＴ処理され
たヒトＦｃフラグメントを５℃にて終夜攪拌した。

得られた反応溶液は、モノクローナル抗体ＩＣ３−Ｈ７
・ヒトＦｃフラグメントハイブリッド抗体、及び、未反
応のモノクローナル抗体ＩＣ３−Ｈ７とヒトＦｃフラグ
メントの混合物である。

この混合液は必要に応じてミニコンＣ９１５（アミコン
社製）またはウルトラフリーＣ３ＧＣ（ミリポア社製）
にて濃縮する。

実施例　２　　作成した抗体コンジュゲートのアッセイ １）　Ｓ　Ｓ　−Ｂ／Ｌａ抗原の精製 ウサギ胸腺アセトン粉末（Ｐｅｔ　−１’ｒｅｅｚｅ社
）に０．０１Ｍリン酸緩衝液、　　０．１５Ｍ　　Ｎａ
　Ｃ（１、ｐＨ７，２（ＰＢＳ）、　　０．５ｍＭ（ｐ
−アミノジフェニル）メタンスルフォニルフルオライド
塩酸塩、０．１％Ｎ　ａ　Ｎ　３（以下Ａｌ夜）を９０
＋ｎｇ／ｍｌとなるよう加え、１８時間、４℃で静かに
攪拌した。８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離して得た
上清分画を飽和硫酸アンモニウム処理し、その２５〜７
５％分画を１２００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離した。

その沈渣をＡ液に対して１８時間。

４℃で透析を行ないＰＢＳ可溶化分画とした。

コンジュゲートに用いた抗５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原抗体（Ｉ
Ｃ３−Ｈ７）はＰ　ｒｏｔｃｉｎ　　Ａカラムにより精
製したものを、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂカラム
に予め吸着させた。前述のＰＢＳ可溶化分画をＩＣ３−
Ｈ７吸着セファロース４Ｂカラムに１８時間、４℃で反
応させ、Ａ液及びＯ，０１Ｍリン酸緩衝液、ＩＭ　　Ｎ
ａＣΩ、　ｐＨ７，２で充分に洗浄した後、３Ｍ　　Ｋ
ＳＣＮ溶液で溶出した。この溶出液はＡ液に対し、１８
時間、４℃で透析を行なった後−８０℃で凍結保存した
。

精製された５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原はウェスタンブロッティ
ングでＩＣ３−Ｈ７とよく反応し、その分子量は４７ｋ
Ｄ及びその分解産物である４０〜４４ｋＤであった。

また、この５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原をウェスタンブロッティ
ングにより患者由来のコントロール血清（抗５Ｓ−Ｂ／
Ｌａ抗体、抗５Ｓ−Ａ／Ｒｏ抗体抗ＲＮＰ抗体、抗Ｓｍ
抗体、抗５ｃＪ７−７０抗体）及び正常人血清と反応さ
せたところ、抗ＳＳＢ／Ｌａ抗体とのみ、反応した。

２）ウェスタンブロッティングによるＩＣ３−Ｆｃコン
ジュゲートのアッセイ ５ＤＳ−ＰＡＧＥは７．５％のポリアクリルアミドゲル
を使用し、ＳＤＳ存在下でＩＣ３−Ｈ７、ヒトＩｇＧ　
　Ｆｃ鎖及び作成された抗体コンジュゲート（ＩＣ３−
Ｆｃコンジュゲート）を分離した。

これらのサンプルは予め、１％ＳＤＳ、　５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ６，８、１０％ショ糖（以下Ｂ液）
中で３７℃、１時間処理あるいは１％−２メルカプトエ
タノール、Ｂ液中で１００℃、２分間の処理を行なった
。

分離後の蛋白質はＧＯＶ、２時間１５分でニトロセルロ
ース膜へ転写した。ニトロセルロース膜は５％ＦＣ８−
ＰＢＳによりブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標
識ウサギ抗−マウスイムノグロブリンズあるいはペルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗−ヒトイムノグロブリンＦｃ鎖と
反応させ、検出はＯ−ｄｌａｎｉｓｉｄｉｎｅで行なっ
た。また、蛋白の染色はアミドブラックにより行なった
。

その結果を第１図に示した。

第１図−Ａ及び第１図−Ｂは合成した抗体コンジュゲー
トの、それぞれ、還元条件下及び非還元条件下でのウェ
スタンブロッティングのパターンを示す。図中、上段の
ＩＣ３及びＦｃはそれぞれ反応に使用したモノクローナ
ル抗体及びヒトイムノグロブリンＦｅ断片の染色パター
ンを示す。

また、０１１０及び０１１１はそれぞれ使用した架橋剤
ＧＭＢＳの瓜のみが異なる架橋反応により作成された抗
体コンジュゲートのパターンを示す。０１１１が最終的
に採用された架橋反応の条件下、即ちＧＭＢＳ／モノク
ローナル抗体のモル比−２５０でのパターンである。さ
らに下段の１はアミドブラックによる。全蛋白質の染色
パターン、２はペルオキシダーゼで標識したヤギのヒト
イムノグロブリンＦｃ断片に対する抗体による染色パタ
ーン、３はペルオキシダーゼで標識したウサギのマウス
イムノグロブリンに対する抗体による染色パターンを示
す。

ＩＣ３−Ｆｃｍンジュゲートは、ＧＭＢＳ／モノクロー
ナル抗体のモル比を２５０にすることによりその溶液中
にＦ　ｒａｅのＩＣ３を残すことなく全てがヒトＩｇＧ
Ｆｃ鎖と結合し、また１つのモノクローナル抗体に対し
ていくつものＦｃが結合していることが明らかとなった
。

３）ＥＬＩＳＡによるＩＣ３−Ｆｃコンジュゲート中の
マウスイムノグロブリン量のアッセイウサギ抗マウスイ
ムノグロブリンズ（ＤＡＫＯ社。

米国）をＰＢＳにより１０００倍希釈を行なった後、５
０μＱずつをＥＬＩＳＡプレートに感作した。

予めＢＣＡプロティンアッセイ試薬ＣＰＩＥＲＣＥ社。

米国）により蛋白定量を行なった抗５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原
抗体（ＩＣ３−Ｈ７）をスタンダードとして、０．０１
Ｍ　トリス−塩酸緩衝液、　０．１５ＭＮ　ａ　ＣＲ、
ｐＨ７，４（Ｔ　Ｂ　Ｓ）　、　２７．５％カゼインに
より順次希釈して用いた。ペルオキシダーゼ標識ウサギ
抗マウスイムノグロブリンズ（ＤＡＫＯ）を２７．５％
カゼイン−ＴＢＳに１０００倍希釈してモノクローナル
抗体及びＩＣ３−Ｆｃコンジュゲートに反応させた。発
色はｔｅｔｒａ−５ｅｔｈｙｌ　ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（
ＴＭＢ）により行ない、ＯＤ　　　　で検出した。

４）ＥＬＩＳＡによるＩＣ３−Ｆｃコンジュゲートの抗
５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原活性のアッセイ前述１）の項で精製
した５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原を１．８　Ｘｌ０−２％カゼイ
ン−ＰＢＳで希釈し、５０ｎｇ／νｃｌｌをＥＬＩＳＡ
プレートに感作した。蒸留水で３回洗浄した後Ｎ２ガス
置換を行ない、４℃に保存しこれを抗原感作プレートと
した。

予め３）の項で定量したマウスイムノグロブリンズ量を
基に、ＩＣ３〜Ｆｃコンジユゲート中のマウスイムノグ
ロブリンズ量を１μｇ／ｍｌとなるよう調製し、順次希
釈を行なった後、抗原感作プレートに反応させた。コン
トロールとして抗５Ｓ−Ｂ　／　Ｌ　ａ抗原抗体（ＩＣ
３−Ｈ７）、及びネガティブコントロールとして、抗Ｃ
ＥＡ抗体−Ｆｃコンジュゲート（ＣＡ２０８−　Ｆｃコ
ンジュゲート）を用いた。

ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン
ズ又はペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト１ｇＧ　　Ｆｃ
鎖（Ｃａｐｐｅ　ｌ　）を２２．５％カゼイン−ＴＢＳ
に希釈し、各々をモノクローナル抗体及びコンジュゲー
トと反応させＴＭＢにより発色させた。

その結果を第２図に示した。

第２図−Ａ及び第２図−Ｂは自己抗原である精製５Ｓ−
Ｂ／Ｌａ抗原を固定したマルチウェルプラスチックプレ
ート（以下、感作プレート）に架橋反応に用いたモノク
ローナル抗体又は下記の種々違う反応ロフトの抗体コン
ジュゲートを順次希釈して加え感作プレート上で抗原抗
体コンプレックスを形成させたのち、さらに、それぞれ
、ペルオキシダーゼで標識したウサギのマウスイムノグ
ロブリンに対する抗体及びペルオキシダーゼで標識した
ヤギのヒトイムノグロブリンＦｃ断片に対する抗体を一
定量ずつ加えて順次希釈した抗体の定量性を解析したパ
ターンである。図中、１２０７、０１１１．０１１２及
び０１１３はＧＭＢＳ／モノクローナル抗体のモル比が
２５０の架橋反応による反応生成抗体コンジュゲートを
示し、０１１０は量比が２５の架橋反応による反応生成
抗体コンジュゲートを示す。また、ＩＣ３は架橋反応に
用いたモノクローナル抗体を示す。

ＩＣ３−Ｆｃコンジュゲートは過剰量のＦｃが結合する
（第１図）ことにより、５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原に対する活
性はＦ　ｒｅＱの抗体に比べ劣ったが（第２図−Ａ）、
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト１ｇＧ　　Ｆｃ鎖によ
る検出では少量のＦｃ鎖がモノクローナル抗体に結合し
た場合よりもむしろ良好の結果を得た（第２図−Ｂ）。

実施例　３　　本発明のコンジュゲートと従来のヒト由
来自己抗体のポジティ ブコントロールとの比較 実施例２−４）で調製した抗原感作プレートに、ＩＣ３
−Ｆｃコンジュゲート及び抗ＳＳＢ　／　Ｌ　ａ抗原抗
体陽性ＳＬＥ患者血清７例のｔｉｔｒａｔｉｏｎを比較
した。ＩＣ３−Ｆｃｍンジュゲートはマウスイムノグロ
ブリン二で１μｇ／ｍ＋から、又患者血清は１００倍希
釈から順次希釈を行ない、ペルオキシダーゼ標讃ヤギ抗
ヒトＩｇＧＦｃ鎖を用いてＴＭＢにより発色させた（第
３図）。その結果、ＩＣ３−Ｆｃコンジュゲートのｔｉ
ｔｒａｔｉｏｎカーブは抗５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原抗体陽性
血清７例のｔ！ｔｒａＮｏｎカーブと同一のカーブを描
くことが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図−Ａ及び第１図−Ｂは合成した抗体コンジュゲー
トの、それぞれ、還元条件下及び非還元条件下でのウェ
スタンブロッティングのパターンを示す。 第２図−Ａ及び第２図−Ｂは自己抗原である精製ＳＳ　
−Ｂ／Ｌａ抗原に対する抗体コンジュゲートの定量性を
解析したパターンである。図中、１２０７、０１１１．
０１１２及び０１１３はＣＭＢＳ／モノクローナル抗体
のモル比が２５０の架橋反応による反応生成抗体コンジ
ュゲートを示し、０１１０は同化が２５の架橋反応によ
る反応生成抗体コンジュゲートを示す。また、ＩＣ３は
架橋反応に用いたモノクローナル抗体を示す。 第３図は本発明で作成した抗体コンジュゲート（図中Ｉ
Ｃ３−Ｆｃ）と従来のポジティブコントロールである抗
５Ｓ−Ｂ／Ｌａ抗原陽性全身性エリテマトーデスの患者
血清（図中Ｅｎｏｍｏｔｏ。 Ｍｉｙａｔａ、　Ｎｏ、１７．　Ｎｏ、３０．　Ｎｏ、
４９．　Ｎｏ、５０及び５ｕｚｕｋ　ｉ　）による希釈
曲線を示す。 特許出願人　　へキストジャバン株式会社（外２名） Ｆｃ３ ０１１゜ Ｆｃ 第 図 １ｃ３ 第 図 ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒトイムノグロブリンのＦｃ断片とヒト自己抗原に
   特異性を有するヒト以外の哺乳動物抗体を化学的架橋試
   薬により共有結合させて作成したヒト−動物抗体コンジ
   ュゲート。 ２）ヒト自己抗原に特異性を有するヒト以外の哺乳動物
   の抗体がマウスモノクローナル抗体である請求の範囲１
   項の抗体コンジュゲート。 ３）請求の範囲１及び２項記載の抗体コンジュゲートを
   ポジティブコントロールとして用いる自己抗体の免疫化
   学的定量方法。