JP2002209579A

JP2002209579A - 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体、およびそれを産生する細胞株またはそれを含むヒトヘモグロビン検出用キット

Info

Publication number: JP2002209579A
Application number: JP2001008329A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nakayama; 浩中山; Osayuki Shigefuji; 修行重藤
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-01-16
Filing date: 2001-01-16
Publication date: 2002-07-30

Abstract

(57)【要約】【課題】ＨＢの定量を正確かつ簡便に行う手段を提供
する。【解決手段】ＨＢに特異的なモノクローナル抗体を産
生する細胞株であって、ＨＢで免疫した哺乳動物の脾臓
細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融合し
て、融合細胞を得る工程；および、ＨＢに対して特異的
なモノクローナル抗体を産生する細胞株を該融合細胞の
中からクローニングする工程であって、該融合細胞から
産生される抗体を、ＨＢ対する結合能について免疫測定
法により検定する工程を包含する方法により得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト由来のヘモグ
ロビンに特異的なモノクローナル抗体、およびこのモノ
クローナル抗体を産生する細胞株、およびこのモノクロ
ーナル抗体を含むキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】結腸と直腸の癌は、肺を除けば他のどの
解剖学的位置よりも多くの新しい症例を毎年数えている
といわれ、米国では、１９８９年には、約７５，０００
人の人々がこれらの癌で死亡している。

【０００３】ヘモグロビン（ＨＢ）は、赤血球中に存在
するタンパク質である。ヒトヘモグロビンの種類は、２
個のα鎖と２個の非α鎖（β、γ、δ鎖）からなるテト
ラマーで、α₂β₂（ＨｂＡ）、α₂γ₂（ＨｂＦ）お
よびα₂δ₂（ＨｂＡ₂）で構成される。便中のＨＢに
ついての検査は、結腸や直腸などの癌の存在を検出する
ために非常に有用である。ＨＢに対する抗体を用いて、
ＨＢ量の定量による病態スクリーニング、治療効果の確
認、予後の判定等を行なうことが出来る。

【０００４】従来、ＨＢを免疫学的手法により特異的に
検出するために、ポリクローナル抗体である抗ヒトＨＢ
血清が用いられてきた。従来の検査法のほとんどは、抗
血清とＨＢとの凝集反応による沈降線の有無または濁度
の増加によってＨＢを検査する。しかし、未精製の抗血
清は、血清中の種々の抗原に対する種々の抗体を含むこ
とが多いため、ＨＢ以外の抗原を検出する可能性があ
る。そこで、検査においてＨＢ以外の抗原を誤って検出
することを防ぐために、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどの手法を用いて抗血清中からヒト標準血清中の
タンパク質に結合する抗体を取り除くことによって、ヒ
ト標準血清においてＨＢ以外の抗原に由来する反応が起
こらないようにすることが普通である。

【０００５】しかし、抗ヒトＨＢ血清は、作製される血
清毎に得られる抗ヒトＨＢ抗体群が異なり、ＨＢとの反
応性が変動するという問題がある。さらに、抗ヒトＨＢ
血清を用いたヒトＨＢの検出は、操作が煩雑であり、ま
たＨＢの定量も容易ではない。そのため、ＨＢの定量を
より正確かつ簡便に行うための方法が望まれてきた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＨＢの定量
を正確かつ簡便に行う手段を提供することを目的とす
る。本発明は、ＨＢに特異的なモノクローナル抗体を提
供し、これを用いたサンドイッチ方式の免疫クロマトグ
ラフィーによる簡便なＨＢの定量法を提供する。

【０００７】ＨＢは、２個のα鎖と２個の非α鎖（β、
γ、δ鎖）からなるヘテロテトラマーであり、ＨＢを介
してサンドイッチ状に結合できる抗体のペアを得ること
は比較的容易である。しかし、モノクローナル抗体を用
いる場合、抗体が均一であるため、抗体の交叉反応性
は、ポリクローナル抗体のみを用いる場合と比較して非
常に大きな問題となる。ＨＢに対するモノクローナル抗
体の中には、ＨＢだけでなく、その他の成分に対しても
高い結合能を有する抗体が存在し得る。このような抗体
をサンドイッチ法に用いると、ＨＢの正確な定量に支障
をきたす恐れがある。従って、その他の成分に対する交
叉反応性が低い抗ＨＢ抗体を用いる必要がある。

【０００８】本発明は、上記問題点の解決を意図するも
のであり、ＨＢに対して高い結合能を有するが、他成分
に対する交叉反応性が低い抗体、およびこれを産生する
細胞株、ならびにこの抗体を含むＨＢ検出用キットを提
供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトヘモグロ
ビン（ＨＢ）に特異的なモノクローナル抗体を産生する
細胞株に関し、この細胞株は、ＨＢで免疫した哺乳動物
の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄腫由来の細胞とを細胞融
合して、融合細胞を得る工程；およびＨＢに対して特異
的なモノクローナル抗体を産生する細胞株を該融合細胞
の中からクローニングする工程であって、該融合細胞か
ら産生される抗体を、ＨＢに対する結合能について免疫
測定法により検定する工程を包含する方法により得られ
る。

【００１０】好ましくは、上記モノクローナル抗体産生
細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号
ＦＥＲＭＢＰ−７２８８号、またはＦＥＲＭＢＰ−
７２８９号である。

【００１１】好ましくは、上記哺乳動物の骨髄腫由来の
細胞は、マウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３
株の細胞である。

【００１２】好ましくは，上記免疫測定法は、酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳＡ法）である。

【００１３】好ましくは、上記免疫した哺乳動物は、マ
ウスまたはラットである。

【００１４】好ましくは、上記免疫した哺乳動物は、Ｂ
ＡＬＢ／Ｃ系統マウスである。

【００１５】本発明は、１つの局面で、上記の細胞株に
より産生される抗ＨＢモノクローナル抗体であって、Ｈ
Ｂに高い結合能を有する、モノクローナル抗体に関す
る。

【００１６】本発明は、１つの局面で、ＨＢを検出する
ためのキットに関し、このキットは、固相に結合された
第１の抗体、および第２の抗体を含み、この第１の抗体
は、上記のモノクローナル抗体であり、そして上記第２
の抗体はＨＢに特異的に結合する標識抗体である。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、より具体
的に説明する。

【００１８】本発明においては、特に指示のない限り、
当該分野で公知である、タンパク質の分離および分析
法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの手
法は、市販の酵素、キット、抗体、標識物質などを使用
して行い得る。

【００１９】本発明の抗ＨＢモノクローナル抗体産生細
胞株の作製を、以下に作製手順に沿って説明する。

【００２０】（免疫）まず、哺乳動物をＨＢで免疫する
ことによって、動物体内で抗体産生細胞を調製する。

【００２１】「哺乳動物」の例として、マウス、ラッ
ト、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモットが挙げら
れる。哺乳動物は、好ましくはマウスおよびラットであ
り、より好ましくはマウスである。マウスの例として、
Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ／２系統、Ｃ５
７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＳＪＬ系統、ＮＺ
Ｂ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統のマウスが挙げられ
る。ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、免疫後に血清中に高
い抗体力価を示すので、ＨＢとの親和性が極めて高いモ
ノクローナル抗体を得ることが可能である。血中抗体力
価が、特異的なハイブリドーマの出来易さと関係してい
ることは公知である。また、細胞株の確立後の腹水によ
る抗体大量作製においては、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが
一般によく使用される。以上により、ＢＡＬＢ／Ｃ系統
のマウスは、ＨＢの免疫に好ましい例である。実験動物
の齢は、特に限定されないが、代表的には約４週齢〜約
１２週齢であり、好ましくは約６〜約１０週齢、より好
ましくは約７週齢のマウスまたはラットである。

【００２２】免疫に用いられるＨＢは、人工のヒトＨ
Ｂ、天然のヒトＨＢ、それらのモノマーサブユニットま
たはそれらのフラグメントであり得る。好ましくは、天
然のヒトＨＢが用いられる。ＨＢは、ヒトの血清から精
製してもよいし、市販のものを用いてもよい。ＨＢは、
通常、約８０％以上の純度、好ましくは約９０％以上の
純度、さらに好ましくは約９５％以上の純度、そして最
も好ましくは約９８％以上の純度で用いられる。

【００２３】免疫の前に、ＨＢは、免疫応答を増強させ
るためにアジュバントと混合され得る。アジュバントの
例としては、油中水型乳剤（例えば、不完全フロイント
アジュバント）、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リ
ポソーム、水酸化アルミニウムゲル、シリカアジュバン
ト、粉末ベントナイト、およびタピオカアジュバントの
他に、ＢＣＧ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｃｎｅｓなどの菌体、細胞壁およびトレハロースダイ
コレート（ＴＤＭ）などの菌体成分；グラム陰性菌の内
毒素であるリポ多糖体（ＬＰＳ）およびリピドＡ画分；
β−グルカン（多糖体）；ムラミルジペプチド（ＭＤ
Ｐ）；ベスタチン；レバミゾールなどの合成化合物；胸
腺ホルモン、胸腺ホルモン液性因子およびタフトシンな
どの生体成分由来のタンパク質またはペプチド性物質；
ならびにそれらの混合物（例えば、完全フロイントアジ
ュバント）などが挙げられる。

【００２４】これらのアジュバントは、投与経路、投与
量、投与時期などに依存して免疫応答の増強または抑制
に効果を示す。さらにアジュバントの種類によって、抗
原に対する血中抗体産生、細胞性免疫の誘導、免疫グロ
ブリンのクラスなどに差が認められる。それゆえ、目的
とする免疫応答に応じて、アジュバントを適切に選択す
ることが好ましい。選択されたアジュバントの取扱い、
例えばＨＢとの混合方法などは当該分野で公知である。

【００２５】哺乳動物の免疫は、当該分野で公知の方法
に従って行われる。例えば、抗原であるＨＢは、哺乳動
物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射され得る。
免疫応答は、免疫される哺乳動物の種類および系統によ
って異なるので、免疫スケジュールは、使用される動物
に合わせて適切に変更され得る。抗原投与は、最初の免
疫の後に、何回か繰り返される。追加免疫は、例えば、
最初の免疫から４週間後、６週間後、および半年後に行
われ得る。

【００２６】（抗体産生の確認）免疫後、哺乳動物から
採血し、得られた血液をＨＢ結合活性の存在についてア
ッセイすることにより、哺乳動物の体内でＨＢに対する
抗体が産生されていること、および免疫末期にはＩｇＭ
からＩｇＧへのクラススイッチが起こっていることを確
認する（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴ
ＩＢＯＤＩＥＳ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵ
ＡＬ、ＣＯＬＤＳＰＲＩＮＧＨＡＲＢＯＲＬＡＢ
ＯＲＡＴＯＲＹ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）を参照
のこと）。適切なアッセイ方法の例として、酵素免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射免疫アッセイ法（ＲＩ
Ａ）、蛍光抗体法が挙げられる。本発明では、ＨＢに対
して高親和性を有する抗ＨＢモノクローナル抗体を得る
ことが望ましい。高親和性のモノクローナル抗体産生細
胞を得るためには、抗血清の時点で高い抗体価を示して
いる必要がある。

【００２７】（ブースト）ＨＢ結合性抗体の産生を確認
した後、脾臓を肥大させるために、ブースト（免疫原の
追加注射）を行い得る。ブーストで投与されるＨＢの量
は、最初に免疫されるＨＢの量の約４〜５倍の量が望ま
しいがこれに限定されない。

【００２８】ブーストは、代表的には、ＨＢと不完全フ
ロイントアジュバントとのエマルジョンを用いて行われ
る。ただし、最終免疫（細胞融合数日前の免疫原の追加
注射）で投与されるＨＢとしては、アジュバントを加え
ず純粋品を用いることが好ましい。投与経路は、皮下、
皮内、静脈、または腹腔内それぞれの投与によって、Ｈ
Ｂの異なった部位を認識する抗体が得られる可能性があ
ることを考慮して、適宜決定される。

【００２９】（細胞融合）最終免疫後、免疫した哺乳動
物から脾臓細胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞株の細胞と
細胞融合する。

【００３０】融合細胞の増殖能力は、細胞融合時に用い
られる骨髄腫由来の細胞株の種類に依存するので、細胞
融合には、増殖能力の優れた細胞株を用いることが好ま
しい。また、骨髄腫由来の細胞株は、融合する脾臓細胞
の由来する哺乳動物と適合性があることが好ましい。骨
髄腫由来の細胞株は、新たに調製してもよいし、市販の
ものを使用してもよい。マウスの骨髄腫由来の細胞株と
しては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／Ｏ−Ａ
ｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／５．ＸＸ０ＢＵ．l、
Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１などが挙げられる。抗体
の断片を産生せず、かつ融合細胞の増殖能力が優れたも
のとなるため、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３の使用が好
ましい。ラット骨髄腫由来の細胞株としては、２１０、
ＲＣＹ３．Ａｇ．１．２．３、ＹＢ２／０などが挙げら
れる。

【００３１】細胞融合は、当該分野で公知の方法に従っ
て行われる（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、
Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５［１９７５］、Ｋｏｓｂ
ｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ
４：７２、Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２０２６、Ｃｏ
ｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ
ＡＮＤＣＡＮＣＥＲＴＨＥＲＡＰＹ、ＡｌａｎＲ
ＬｉｓｓＩｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、７７
−９６頁［１９８５］などを参照のこと）。細胞融合法
の例として、例えば、ポリエチレングリコール法、セン
ダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などが
挙げられる。細胞毒性も比較的少なく、融合操作も容易
で再現性が高いため、ポリエチレングリコール法が好ま
しい。

【００３２】得られた融合細胞は、当該分野で公知の条
件に従って増殖させ得る。産生される抗体の結合能に基
づいて、所望の融合細胞を選択し得る。

【００３３】（細胞選別およびクローニング）融合細胞
から産生される抗体の結合能は、当該分野で公知の方法
に基づいてアッセイされ得る。本発明においては、ＨＢ
に高い結合能を有し、その他の成分に対して結合能を有
さないか、もしくは低い結合能を有する抗体を産生する
融合細胞を得るために、ＨＢに対する結合能に基づく選
別を利用して、目的の細胞株をクローニングする。従っ
て、本明細書中で用語「ＨＢに対して特異的なモノクロ
ーナル抗体」とは、ＨＢに高い結合能を有し、その他の
成分に対して結合能を有さないか、もしくは低い結合能
を有する抗体を意味する。ＨＢに高い結合能を有し、そ
の他の成分に対して「結合能を有さない」抗体は、交叉
反応性がない。

【００３４】用語「高い結合能を有する」とは、下記の
実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質
的に同一の条件での測定においてインヒビションがかか
り、インヒビションの半値が約１０^-6Ｍ以下であること
をいう。用語「低い結合能を有する」とは、同じ測定に
おいてインヒビションがかかるが、インヒビションの半
値が約１０^-5Ｍ以上（例えば、１０^-4Ｍ、１０^-3Ｍな
ど）であることをいう。用語「結合能を有さない」と
は、同じ測定においてインヒビションがかからないこと
をいう。用語「インヒビションがかかる」とは、固相に
固定されたＨＢに結合する抗体の量が、競合物質（イン
ヒビター）の存在下で、インヒビターの不存在下と比較
して減少することをいう。用語「インヒビションがかか
らない」とは、固相に固定されたＨＢに結合する抗体の
量が、インヒビターの存在下および不存在下で実質的に
同等であることをいう。「インヒビションの半値」と
は、インヒビターの不存在下での吸光度（抗体結合量を
反映する）の半分の吸光度が測定されるインヒビターの
濃度をいう。

【００３５】抗体の結合能は、抗体産生の確認に関して
上述したのと同様に、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗
体法などの方法を用いてアッセイされる。簡便に感度よ
く抗体を検出し得ることから、ＥＬＩＳＡ法が好まし
い。

【００３６】融合細胞のクローニングには、当該分野で
公知の方法が用いられ得る。クローニングの方法の例と
しては、限界希釈法、軟寒天法などが挙げられる。操作
も容易で数多くの実績があり、再現性が高いため、限界
希釈法が好ましい。

【００３７】細胞融合により得られた多くの融合細胞の
中から、効率よく有用な細胞を選択するために、細胞選
別は、クローニングの初期の段階から行うことが好まし
い。

【００３８】このようにして、望ましい結合能を有する
抗体を産生する融合細胞株が最終的に選別される。選別
された細胞株は、液体窒素中で半永久的に保存され得
る。

【００３９】（抗体の精製）上記のようにして選別され
たモノクローナル抗体産生細胞株を大量培養することに
より、ＨＢに対して特異的なモノクローナル抗体を大量
に産生し得る。モノクローナル抗体産生細胞株の大量培
養方法として、インビボおよびインビトロでの培養が挙
げられる。インビボでの大量培養の例としては、哺乳動
物の腹腔内に融合細胞を注射して増殖させ、腹水中に抗
体を産生させる方法が挙げられる。インビトロでの培養
では、融合細胞が培地中で培養され、抗体が培地中に産
生される。

【００４０】大量培養により得られた腹水または培養上
清から、当該分野で公知の方法を用いて、本発明のモノ
クローナル抗体を精製し得る。精製のためには、例え
ば、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画
法、エタノール分画法などが適宜組み合わせて用いられ
る。本発明の抗体は、通常、約９０％の純度、好ましく
は約９５％の純度、より好ましくは約９８％の純度とな
るように精製される。

【００４１】（抗体の評価）精製されたモノクローナル
抗体の結合能を評価することにより、得られたいくつか
の抗体の中から、ＨＢ上の異なるエピトープを認識する
抗体の組合せを選択し得る。異なるエピトープを認識す
る、任意の２種の抗体の組合せは、サンドイッチ法のた
めに有用である。

【００４２】本発明においては、ＨＢを検出するための
キットが提供される。本発明のキットは、例えば、抗原
抗体結合反応に基づいて水性試料中の抗原を検出する免
疫クロマトグラフィーを実施するために提供され得る。
本発明のキットは、固相に結合された第１の抗体および
移動相に含められて用いられる第２の抗体を含む。

【００４３】固相に結合される第１の抗体としては、受
託番号ＦＥＲＭＢＰ−７２８８号または受託番号ＦＥ
ＲＭＢＰ−７２８９号の細胞株により産生されるモノ
クローナル抗体が使用され得る。好適には、受託番号Ｆ
ＥＲＭＢＰ−７２８８号の細胞株により産生されるモ
ノクローナル抗体が第１の抗体として使用され得る。

【００４４】第２の抗体としては、ＨＢに高い結合能を
有する限り任意の抗体を使用し得、これは、ポリクロー
ナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であっ
てもよい。好ましくはモノクローナル抗体が用いられ
る。第２の抗体として受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７２８
８号または受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７２８９号の細胞
株により産生されるモノクローナル抗体が好適に用いら
れる。この場合、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７２８８号
および受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７２８９号の細胞株に
より産生されるモノクローナル抗体を第１の抗体および
第２の抗体の一組のペアとして用い、それによってサン
ドイッチアッセイを実施し得る。

【００４５】第２の抗体として、その他の抗体を用いる
場合、上記受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７２８８号または
ＦＥＲＭＢＰ−７２８９号の細胞株により産生される
モノクローナル抗体が結合するエピトープに結合能を有
さない抗体であることが好ましい。

【００４６】第２の抗体は、当該分野で公知の方法によ
り任意の標識により標識され得る。標識の例としては、
酵素標識、色素標識、磁性標識、放射性標識、色の付い
た粒子（金コロイド、ラテックスなど）による標識など
が挙げられる。

【００４７】本発明のキットは、当該分野で公知の方法
により適切に作製され得る。本発明のキットは、１つま
たはそれ以上の容器中に上記第１の抗体および上記第２
の抗体を含み得る。キットはまた、ＨＢのサンドイッチ
アッセイにおける、抗体の使用を教示する説明教材を含
み得る。キットは、標識の検出のため、または陽性コン
トロールおよび陰性コントロールを検出するための適切
な試薬、洗浄溶液、希釈緩衝液などを含み得る。

【００４８】上記のように、第１の抗体は、通常、固相
に固定化されており、そして第２の抗体は標識されてい
る。ＨＢの測定にあたっては、まず、第２の抗体を液相
でＨＢと反応させ、標識−抗体−ＨＢ複合体を形成させ
る。そして、この複合体を含む反応液を移動相として固
体化された第１の抗体と反応させる。その結果、第１の
抗体および第２の抗体は、ＨＢを介してサンドイッチ状
に結合する。従って、ＨＢが存在する場合にのみ、ＨＢ
を介して固相上に標識が固定化される。

【００４９】受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７２８８号の細
胞株により産生される抗ＨＢモノクローナル抗体は、Ｈ
Ｂに高い結合能を有し、他の成分には結合能を有しな
い。受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７２８９号の細胞株によ
り産生される抗ＨＢ抗体も同様に、ＨＢに高い結合能を
有し、他の成分には結合能を有しない。

【００５０】本発明による「抗ＨＢモノクローナル抗
体」には、その結合特性を保持した機能性の断片もまた
含まれる。これらの断片は、それらが由来するインタク
トな抗体とＨＢへの特異的結合について競合し得、少な
くとも１０⁷、１０⁸、１０⁹Ｍ^- ¹、または１０¹⁰Ｍ^-1の
親和性で結合し得る。抗体の断片は、免疫グロブリンの
重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（ａｂ’）₂、Ｆａｂ
ｃおよびＦｖを含み得る。抗体の断片は、インタクトな
免疫グロブリンの酵素的または化学的分離によって生じ
得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂断片は、Ｈａｒｌｏｗお
よびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＡＬＡＢＯＲ
ＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ、ＣＯＬＤＳＰＲＩＮＧ
ＨＡＲＢＯＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ（１９８８）に記載されたような標準的な方法を用
い、ｐＨ３．０〜３．５においてペプシンでタンパク質
消化することによってＩｇＧ分子から得ることができ
る。Ｆａｂ断片は、限定的還元によってＦ（ａｂ’）₂
断片から、あるいは還元剤の存在下パパイン消化によっ
て全抗体から得ることができる（Ｐａｕｌ、Ｗ．編、Ｆ
ＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ第２版
ＲａｖａｎＰｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、第７章
を参照のこと）。

【００５１】

【実施例】以下、本発明のモノクローナル抗体産生細胞
株の作製についてさらに具体的に説明する。本発明は以
下の実施例によって限定されるものではない。

【００５２】＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞以下
の実施例においては、得られた抗血清、培養上清および
モノクローナル抗体の評価は、ＥＬＩＳＡ法により行な
った。その操作法を以下に記載する。

【００５３】（Ａ）抗原（ＨＢ）のコーティングＨＢを、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ
（０．０４重量％ナトリウムアジドＰＢＳ溶液にウシ血
清アルブミン（以下ＢＳＡという）を０．１ｍｇ／ｍＬ
の濃度で溶解したもの）を用いて２μｇ／ｍＬの濃度に
調製した。マイクロプレート（ポリスチレン製高結合型
平底＃２５８０、コスター社製）に抗原溶液を１００μ
ｌ／ウェル注入し、室温で飽和水蒸気中に一晩保存し
た。実験直前に、アスピレータで抗原溶液を除去した。

【００５４】（Ｂ）ブロッキング１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ（Ａｚ：アザイドナトリ
ウム塩）を２００μｌ／ウェル注入し、３０分間室温で
放置した。その後、アスピレータで１重量％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ−Ａｚを除去した。以降の実験を即日に行わないと
きは、この状態で、飽和水蒸気中に４℃で保存した。

【００５５】（Ｃ）抗体の反応１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで種々の濃度に希釈した
抗体溶液（抗血清、培養上清、精製抗体等）を５０μｌ
／ウェル、および１重量％ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを５０
μｌ／ウェルで注入した。相対的な親和性を測定する目
的でインヒビション（阻害）実験を行うときは、インヒ
ビター溶液（ＨＢを含む溶液）を５０μｌ／ウェル注入
した後、抗体溶液５０μｌ／ウェルをさらに加え、振盪
した。常温で１時間半放置した後、ＰＢＳで３回洗浄
し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。

【００５６】（Ｄ）第２抗体の反応０．２μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来
の抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡ
のＰＢＳ溶液に溶解したもの、または０．２μｇ／ｍＬ
のペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＭ
抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶
解したものを５０μｌ／ウェル注入し、常温で３０分放
置した。ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残
存するＰＢＳを除去した。

【００５７】（Ｅ）基質の反応と停止Ｏ−フェニレンジアミン（生化学用）４０ｍｇを１０ｍ
Ｌのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、
使用直前に３０重量％過酸化水素水４μＬを加えた溶液
（基質溶液）を１００μｌ／ウェル注入し、室温放置し
た。約３分後、４Ｎ硫酸を２５μｌ／ウェル注入して反
応を停止した。

【００５８】（Ｆ）測定マイクロプレートリーダ（東洋ソーダ社製）を用いて４
９２ｎｍの吸光度を測定した。

【００５９】なお、本実施例では免疫測定法として酵素
免疫測定法を用いたが、他にＲＩＡ法、蛍光抗体法等を
用いてもよい。

【００６０】＜実施例＞本実施例においては、本発明者
らの研究所で実績があること、およびモノクローナル抗
体産生細胞株確立後の腹水による抗体大量培養において
はＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスが最もよく使用されることを
考慮に入れ、ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスを免疫に使用し
た。

【００６１】（免疫）免疫原であるヘモグロビン（Ｈ
Ｂ）（ＳｉｇｍａＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン
酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍＬに調製した。
このＨＢのＰＢＳ溶液に、同体積のアジュバント（ヒト
結核死菌含有完全フロイントアジュバント、和光純薬
製、Ｈ３７Ｒｖ）を添加し、ホモジナイザで回転数１０
００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含む
アジュバントエマルジョンを得た。

【００６２】生後約７週間の雌のマウス（ＢＡＬＢ／
Ｃ）１５匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョン
を１００μｌずつ腹腔内、あるいは皮下に注射した。２
週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍＬに調製したＨＢ溶
液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバント
をホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＢＡＬＢ
／Ｃマウスに前回と同じ部位に１００μｌずつ注射し
た。

【００６３】その後、免疫開始より４週間後、６週間
後、および半年後に、２週間後の免疫と同じ組成、濃度
のＨＢを含む不完全フロイントアジュバントエマルジョ
ンを、マウスに１００μｌずつ前回と同じ部位に注射し
た。２回目の注射の１週間後と４回目の注射の１週間後
にそれぞれ採血し、以下に示す抗体産生を確認した。

【００６４】（抗体産生の確認）採取した血液から血清
を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。固相として
０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで調製した２
μｇ／ｍＬ・ＨＢを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、
室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。第
二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗
体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を
使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中に
ＨＢに結合する抗体が存在することが確認される。

【００６５】その結果、１５匹すべてのマウスにおいて
抗ＨＢ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウ
スにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＧから
ＩｇＭへシフトしていることが確認され、４回目の注射
後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上でありクラススイ
ッチが充分起こっていることを確認した。

【００６６】（細胞融合）免疫したマウスの中で特に力
価の高かった３匹の脾臓を肥大させるために、最終免疫
を行なった。免疫開始から６ヶ月後、免疫原のＨＢを、
ＰＢＳを用いて５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、アジュバ
ントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射した。

【００６７】最終免疫後３日を経過したマウスのうち１
匹の脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリ
エチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞と
マウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５
３）とを融合させ、融合細胞を得た。

【００６８】融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清
（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキ
サンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に
浮遊させた後、９６ウェルプレート１枚にまいた（２０
０μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始
時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓
細胞を用いた。ＣＯ₂インキュベータ（ＣＯ₂濃度：５体
積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始し
た。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条
件で培養を行なった。

【００６９】（細胞選別およびクローニング）１週間
後、融合細胞の培養上清を１００μｌ採取した後、融合
細胞を含む残りの培養液を４枚の２４ウェルプレートに
継代し、各ウェルに１ｍｌの１５重量％のＦＣＳを含む
ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。融合
細胞を２４ウェルプレートに継代した４日後、細胞培養
上清を１５０μｌ／ウェルずつ採取した。この培養上清
と、培養開始後１週間目に採取した培養上清を用いて以
下に示すＥＬＩＳＡ法により、ＨＢに対する結合能を測
定した。

【００７０】固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ−Ａｚで２μｇ／ｍＬの濃度に調製したＨＢを、１
００μｌ／ウェルずつ使用した。抗体液として、細胞培
養上清を使用した。第二抗体としてペルオキシダーゼ標
識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。

【００７１】２回採取した培養上清のＥＬＩＳＡ法結果
を合わせて、ＨＢに対して高い結合能を有する、増殖状
態の良い１０ウェルを確認した。第１段階の選択とし
て、これらのウェルの細胞を、すべて２枚の６ウェルプ
レートに継代し、各ウェルに４ｍｌの１５重量％のＦＣ
Ｓを合むＨＴ培地を加えた。

【００７２】第１段階の細胞選別の２日後、培養上清を
採取し、以下に示すＥＬＩＳＡ法（インヒビションＥＬ
ＩＳＡ法）によりＨＢに対する結合能を測定した。

【００７３】固相として０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ−Ａｚで２μｇ／ｍＬの濃度に調製したＨＢを、１
００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＨＢ
を使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。第
二抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗
体を使用した。細胞培養上清中に、ＨＢに結合する抗体
が存在すると、インヒビターとして添加された可溶性Ｈ
Ｂと結合してインヒビションがかかる（固相ＨＢへの結
合が阻害される）ので、ウェル中の発色は確認されな
い。

【００７４】この結果、第２段階の選択として、ＨＢに
対して高い結合能を有し、インヒビションＥＬＩＳＡ法
においてインヒビションがかかったウェルを、5ウェル
選別した。これらのウェルの細胞を、それぞれ、中フラ
スコ（容量５０ｍｌ）に継代した。培地は１５重量％の
ＦＣＳを含むＨＴ培地を４５ｍｌずつ加えた。

【００７５】第２段階の選択を受けた細胞の継代３日
後、培養上清を採取し、以下に示すＥＬＩＳＡ法により
ＨＢに対する結合能を測定した。

【００７６】固相として、０．１ｍｇ／ｍＬ・ＢＳＡ−
ＰＢＳ−Ａｚで２μｇ／ｍＬの濃度に調製したＨＢを、
１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＨ
Ｂを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。
第二抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ
抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結
合する抗体が存在するとインヒビションがかかるので、
ウェル上の発色は確認されない。ＨＢでのみインヒビシ
ョンがかかった２ウェル選別した。

【００７７】上記２ウェルの細胞について、１５重量％
のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２ケ
の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェ
ルのマイクロプレート各２枚に分注した。フィーダーと
して生後４週の雌のマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の胸腺細胞
を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げな
がら培養を進め、適時細胞培養上清について上記のＥＬ
ＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。ＨＢに対
して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞
株を最終的に選別し、２００ｍＬの培地中で５×１０⁵
細胞／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。最終的に、
ＨＢに対して高い結合能を有した株を１株選定した。

【００７８】ＨＢに対して高い結合能を示した株を細胞
株名：Ｈｂ1と命名し、工業技術院生命工学工業技術研
究所に平成１２年８月３１日に国内寄託した（受託番号
ＦＥＲＭＢＰ−７２８８号）。

【００７９】同様に、ＨＢに対して高い結合能を有した
もう一つの株を細胞株名：Ｈｂ２と命名し、生命研に平
成１２年８月３１日に国内寄託した（受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７２８９号）。

【００８０】ＨＢ1株およびＨＢ２株の産生する抗体
を、それぞれ、ＨＢ1抗体およびＨＢ２抗体と称する。

【００８１】（細胞の保存）最終的に選別された細胞株
は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０⁷細胞／ｍ
Ｌの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１
（体積比）の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で予備凍
結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。

【００８２】（抗体の精製）選択した２株を、それぞ
れ、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養
し、その上清を遠心分離した。また、選択した２株を、
それぞれ、雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に注射して
増殖させ、腹水を蓄積させた。蓄積した腹水を採取し
た。各株の培養上清あるいは腹水を、プロテインＡ結合
ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア
製）を用いたアフィニティークロマトグラフィにかけ、
以下の条件で各モノクローナル抗体（ＨＢ1抗体および
ＨＢ２抗体）を精製した。

【００８３】プロテインＡ結合ゲルを充填したカラム
を、結合緩衝液（１．５Ｍグリシン・３ＭＮａＣ
ｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水
を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラ
ムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍで
モニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラ
ムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１０
０ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流
速：約２０ｃｍ／時間）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収し
た。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で
２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光
係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。

【００８４】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる標準タンパク質との比較から、これらのモノクロー
ナル抗体（ＨＢ1およびＨＢ２）の精製分画は、いずれ
も分子量約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖
からなるＩｇＧであることを確認した。なお、電気泳動
上で、不純物の混入は検出限界以下であった。

【００８５】（抗体の評価）上記のアフィニティークロ
マトグラフィにより精製した２種類のモノクローナル抗
体について、ＨＢの希釈系列を用いて、上記第２段階の
選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法と同一条件で
抗体評価を行った。

【００８６】図１は、ＨＢ1抗体について、図２は、同
様にＨＢ２抗体について、それぞれＨＢに対する結合能
を測定した結果を示すグラフである。図１、２におい
て、縦軸は吸光度を、横軸は各抗原の濃度（ｍｏｌｅ／
Ｌ、以下Ｍ、又はｍｇ／ｍｌ）の対数値を示す。

【００８７】図１に示すように、ＨＢ1抗体では、イン
ヒビションの半値が約２×１０^-7Ｍであり、約１０^-8Ｍ
のＨＢを検出し得る可能性が示された。

【００８８】図２に示すように、ＨＢ２抗体では、イン
ヒビションの半値が約１０^-7Ｍであり、１×１０^-8Ｍ以
上のＨＢの検出感度を持つ可能性が示された。

【００８９】（サンドイッチ反応）ＥＬＩＳＡ法におい
てＨＢ1抗体をプレートにコートし、ＨＢを結合させ、
酵素ラベルしたＨＢ２抗体を反応させた後に余分な抗体
を除去し、発色基質を添加してインキュベートしたとこ
ろ、充分な発色が得られた。つまり、ＨＢ1抗体と、Ｈ
Ｂ２抗体またはポリクローナル抗体との組合せは、免疫
クロマトグラフィーなどのサンドイッチ反応を利用した
検査方法に有用であることが確認できた。

【００９０】（免疫クロマトグラフィーにおける検出感
度）常法に従ってＨＢ1抗体を濾紙上に固定化し、金コ
ロイド標識したＨＢ２抗体を移動相に置いて、免疫クロ
マトグラフィー装置を作製した。種々の濃度でＨＢを含
むサンプルをアプライしたところ、この免疫クロマトグ
ラフィー装置の最高検出感度は、約７×１０^-8Ｍであっ
た。

【００９１】一般に、健常人の血中ＨＢレベルは、約１
０^-4Ｍであることが知られている。従って、本発明の抗
体を用いて作製された免疫クロマトグラフィー装置は、
血中ＨＢを検出するために十分な感度を有する。

【００９２】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体産生細胞株
の作製方法によれば、細胞株のクローニングにおいて、
融合細胞から産生される抗体のＨＢに対する結合能を検
定し、目的の細胞を選別する。そのため、細胞融合の
後、初期に存在する多くの細胞から、効率よく有用な細
胞を選択し得る。そして、ＨＢに対する高い親和性を達
成しながら、特異性の高い抗体を産生する細胞株を作製
し得る。

【００９３】免疫測定法が酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ
法）である場合、抗体の結合能を簡便に感度よく検定し
得る。

【００９４】哺乳動物の骨髄腫由来の細胞株が、マウス
骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３である場合、抗
体の断片を産生せず、さらに得られる融合細胞の増殖能
力が特に優れているため、短時間に多くの細胞を検定し
得る。

【００９５】免疫する哺乳動物がマウスまたはラットで
ある場合、動物の取り扱い、免疫感作の点で都合がよ
い。免疫する哺乳動物がＢＡＬＢ／Ｃ系統マウスである
場合、ＨＢとの親和性が極めて高いモノクローナル抗体
を得ることが可能となる。

【００９６】本発明のモノクローナル抗体産生細胞株に
よれば、それを培養することによりＨＢに対する高い親
和性を有し特異性の高い抗ＨＢモノクローナル抗体を半
永久的に提供し得る。

【００９７】本発明のモノクローナル抗体である、ＨＢ
1抗体とＨＢ２抗体とを組み合わせて、あるいは、本発
明のモノクローナル抗体と、抗ＨＢポリクローナル抗体
とを組み合わせてサンドイッチ法に使用すれば、高感度
かつ高特異的なＨＢ検出キットを提供し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＢ1抗体を用いた、インヒビションＥＬＩＳ
Ａ法の結果を示すグラフである。グラフのデータは、本
発明の抗ＨＢモノクローナル抗体（ＨＢ1抗体）のＨＢ
に対する結合能を示す。

【図２】ＨＢ２抗体を用いた、インヒビションＥＬＩＳ
Ａ法の結果を示すグラフである。グラフのデータは、本
発明の抗ＨＢモノクローナル抗体（ＨＢ1抗体）のＨＢ
に対する結合能を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 GA03 GA09 GA18 GA27 HA03 4B064 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 CD30 CE12 DA01 DA13 4B065 AA91X AC14 AC15 BA08 BA24 BB01 BC01 BD14 CA25 CA44 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 GA26 HA03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトヘモグロビン（ＨＢ）に特異的なモ
ノクローナル抗体を産生する細胞株であって、ＨＢで免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、哺乳動物の骨髄
腫由来の細胞とを細胞融合して、融合細胞を得る工程；
および、ＨＢに対して特異的なモノクローナル抗体を産生する細
胞株を該融合細胞の中からクローニングする工程であっ
て、該融合細胞から産生される抗体を、ＨＢに対する結
合能について免疫測定法により検定する工程を包含する
方法により得られる、細胞株。
【請求項２】工業技術院生命工学工業技術研究所受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−７２８８号、またはＦＥＲＭＢ
Ｐ−７２８９号である、請求項１に記載のモノクローナ
ル抗体産生細胞株。
【請求項３】前記哺乳動物の骨髄腫由来の細胞が、マ
ウス骨髄腫由来Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３株の細胞で
ある、請求項１に記載の細胞株。
【請求項４】前記免疫測定法が、酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ法）である、請求項１に記載の細胞株。
【請求項５】前記免疫した哺乳動物が、マウスまたは
ラットである、請求項１に記載の細胞株。
【請求項６】前記免疫した哺乳動物が、ＢＡＬＢ／Ｃ
系統マウスである、請求項１に記載の細胞株。
【請求項７】請求項1に記載の細胞株により産生され
る抗ＨＢモノクローナル抗体であって、ＨＢに高い結合
能を有する、モノクローナル抗体。
【請求項８】ＨＢを検出するためのキットであって、
固相に結合された第１の抗体、および第２の抗体を含
み、該第１の抗体が請求項７に記載のモノクローナル抗
体であり、そして該第２の抗体がＨＢに特異的に結合す
る標識抗体である、キット。