JPH0257178A - モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なモノクローナル抗体産生細胞ラインに関
するものである。この細胞ラインより産生されるモノク
ローナル抗体は、大麻の有効成分であるテトラヒドロカ
ンナビノールあるいはテトラヒドロカンナビノールの誘
導体を、血中あるいは大気中より免疫測定法によって高
感度に検知するために有用である。

従来の技術 テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカン
ナビノールの誘導体に対する抗体は例えハＪ、Ｄ、　　
ティール、エルビネ　Ｊ、　　フォアマン、Ｌ、　　Ｊ
、　　キング、エベリン　Ｍ、ピアノ及びＶ。

マークス、Ｊ、ファーム、ファーマックらによって報告
されている。しかしながら、報告されている抗体は免疫
した羊の血液を精製して得られるポリクローナル抗体で
ある。

発明が解決しようとする課題 従来の技術であるポリクローナル抗体は、これを得るま
での全体の製造行程が簡単である長所を有する。反面、
得られる抗体の特性は羊の各個体に依存するため再現性
のある抗体を提供することが困難である。また、ポリク
ローナル抗体は抗原に対するアフィニティーが様々な抗
体の混合物であるため、平均としてのアフィニティーが
低く、高感度測定には用いることができないなどの問題
を有している。

課題を解決するための手段 本発明のモノクローナル抗体産生細胞は、ラインテトラ
ヒドロカンナビノール、あるいはテトラヒドロカンナビ
ノールの誘導体とチキン由来のガンマグロブリの結合物
質からなる免疫原で感作されマウスの脾臓細胞と、骨髄
腫由来の細胞ラインとを融合後、クローニングして得ら
れ、培養上清中に産生されるイムノグロブリンが、テト
ラヒドロカンナビノール、あるいはテトラヒドロカンナ
ビノールの誘導体に特異的に結合するものである。

作用 免疫グロブリンを産生ずる細胞は膵臓内に蓄積される。

脾臓細胞はそれ自体増殖能力を持たないが骨髄腫細胞ラ
インと融合することによって、増殖しながら抗体を産生
ずるハイブリドーマ細胞ラインを作製することができる
。もっとも優れたアフィニティーを有する抗体を産生し
、かつ高い増殖能力を有するハイブリドーマ細胞１個を
選択（クローニング）シ、これを培養すると高アフィニ
ティーのモノクローナル抗体が産生される。モノクロー
ナル抗体は同一種の抗体であるため、高アフィニティー
が得られる。またハイブリドーマ細胞ラインを培養する
ことにより、永続的に一定の特性のモノクローナル抗体
を提供す慝ことができる。

実施例 発明者らは、免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫
由来細胞ラインを融合し、クローニングを行うことによ
ってテトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロ
カンナビノールの誘導体に対して高いアフィニティーを
有するモノクローナル抗体を産生ずる細胞ラインを作製
することに成功した。

本発明において、目的抗原はテトラヒドロカンナビノー
ルあるいはテトラヒドロカンナビノールの誘導体であり
、これらの物質は何れも低分子であるため、蛋白質等の
高分子に結合させることにより、初めて免疫原として作
用する。その際の蛋白質は、マウスに免疫後なるべく早
く目的の抗体を産生ずるものが望ましい。この意味にお
いて好適な蛋白質の１つであるチキン由来のガンマグロ
ブリン（以下ＣＧＧ）を用いた。

また、テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒド
ロカンナビノールの誘導体と蛋白質の結合物質からなる
免疫原で感作されるマウスは、高い力価の抗体を産生ず
るものが望ましい。この点において好適な系統であるＡ
／Ｊ系統のマウスを用いた。

以下、本発明のモノクローナル抗体産生細胞ライン及び
モノクローナル抗体を作製する実験方法を順に記載する
。

免良皿少立ｌ 以下に免疫原の合成方法をステップ毎に記して免疫原に
ついての実施例の説明を行う。

（Ａ）テトラヒドロカンナビノール（以下、ＴＨＣ）の
単離 大麻樹脂１７．３ｇから石油エーテルで５．２ｇの成分
を抽出した。この成分をシリカゲルカラム、溶媒（ジエ
チルエーテル：ヘキサン：１：　５）を用いた液体クロ
マトグラフィーにより、６８０ｍｇのＴｌＩＣを抽出し
た。テトラヒドロカンナビノールは、二重結合の位置の
差によって△９−ＴＨＣ及びΔ８−ＴＩＩＣに分別され
るが、ここで抽出されたＴｌＩＣは△９−ＴＨＣである
ことを確認した。

（Ｂ）テトラヒドロカンナビノール−１−０−ヘミスク
シニック酸（以下ＴＨＣ−ＣＯＯＩＩ）の合成（Ａ）項
で単離したＴＨＣを用いて、Ｊ、Ｄ、ティールらの報告
（前出）に従って合成した。無水コハク酸２ＢＯ＋ａｇ
をピリジンｊｍＬ中で還流した中に、ＴＨＣ（１３０ｍ
ｇ／４ｍＬピリジン）を加えて６時間還流した。これを
溶媒クロロホルムを用いて薄層クロマトグラフィーで展
開して、７２．５ｍｇのＴＩＩＣ−Ｃｏｏｌを抽出した
。

（Ｃ）ＣＧＧへのＴＨＣの導入 ’ｒｎｃ−ｃｏｏｎ４ｏｍｇを溶媒（ピリジン：ジオキ
サン＝１　：　２）　３ｍＬに溶かし攪はんしている中
に、ｌ−エチル＝３−（−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミドヒドロクロライド（ＩＢ、８ｍｇ／　１ｅ
Ｌリン酸バツフアー（０，１Ｍ、　　ＰＨ７））を加え
、さらに３時間撹はんを行った。冷却後、ＣＧＧ溶液（
３０ｍＬ、　　０．３４％）を４℃で攪はルしている中
に徐々に加え、さらに４℃で１晩攪はんを続けた。この
中に含まれる変性した蛋白質を遠心分離（１９０００ｒ
ｐｍ、　　４０ｍ１ｎ）で除去した後、セファデックス
Ｇ−２５（ファルマシア製）でゲル濾過し、吸光度２８
０ｎＩ１１の分画を分取し、’Ｉｎｃ−ＣＧＧを得た。

（Ｄ）ＣＧＧに導入されたＴＨＣの定量ＣＧＧにＴＨＣ
を導入した前後のアミノ基をクマシブリリアントブルー
Ｇ（和光紬薬製）で定量して、結合したＴＨＣの数を測
定した。その結果、ＴＨＣ導入前のＣＧＧのアミノ基は
４２個、導入後のＣＧＧのアミノ基は２２個であった。

したがって、０００１個当り２０個のＴＨＣが結合した
ＴＨＣ−ＣＧＧが得られた。

（Ｅ）アジュバントエマルシロンの調製合成によって得
たＴＨＣ−ＣＧＧをＰＢＳで希釈して、１ｍｇ／ｍＬ溶
液８ｍＬを得た。アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ、　
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄヒト結核死菌含、和光
紬薬製、■３７Ｒｖ）をよく攪はルしながらＢｍＬ取り
、ホモジナイザで撹はルしながら（１０，００Ｏｒｐｍ
）　ＴＨＣ−ＣＧＧ溶液溶液６登Ｌ回に分けて加えた。

十分にエマルシロン化し、少量を水の上に落としても広
がらなくなったのを確認した。

なお本実施例では、八〇−ＴＨＣを用いて免疫原を作製
したが、これは八〇−ＴＨＣおよびテトラヒドロカンナ
ビノールの誘導体例えば１１−ヒドロキシ−△９−テト
ラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−Δ８−テ
トラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−へ〇−
テトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−Δ８
−テトラヒドロカンナビ　ノール、カンナビノール、カ
ンナビジオール、カンナビジオール酸、カンナビジクロ
ール、カンナビクロメエン、８α−ヒドロキシ−へキサ
ヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシカンナビノー
ル、カンナビノール−１１−アルデヒドアセテートおよ
び８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−へキサヒドロカン
ナビノールについてもまったく同様の合成方法を用いて
、モノクローナル抗体産生細胞ライン作製のための免疫
原が作製できる。

以下、モノクローナル抗体産生細胞およびモノクローナ
ル抗体の作製方法をステップごとに示し、実施例の説明
を行う。

（Ａ）マウスの免疫 生後約８週のマウス（Ａ／Ｊ）１０匹の腹腔に実施例１
で作製した免疫原を含むアジュバントエマルシロンを１
００μＬずつ注射した。

（Ｂ）抗体産生のチエツク 免疫注射後、２８日を経過したマウスについて、眼静脈
より５０〜１００μＬの血液を遠心管に採取した。

血清を遠心分離し、抗原固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ法）（後出）によるスクリーニングを行ったところ、
全てのマウスについて抗テトラヒドロカンナビノール抗
体の産生が確認された。

（Ｃ）マウスのブースト （Ｂ）項のスクリーニングで特にタイターの高かった２
匹のマウスについて、マウスの脾臓を肥大させるために
ブースト（弱い免疫原の注射）を行った。免疫原はＴＨ
Ｃ−ＣＧＧをＰＢＳで希釈して得たｌｌｌ１ｇ／ａ＋Ｌ
溶液を、アジュバントを加えずにそのまま用いた。免疫
後２９日を経過した時点でこの免疫原を１００μＬ注射
した（ｉ、ｐ、）。

（Ｄ）細胞融合 ブースト後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出し、
平均分子量１．５００のポリエチレングリコールを用い
た常法により、マウス骨髄腫由来細胞うイン（Ｐ３ＸＢ
３−Ａｇ８　、Ｂ５３）と融合した。フィーダー（成長
因子を供給する細胞）として同じマウスの脾臓細胞を用
い、９８ウ工ルプレート２枚の上で１０％のウシ胎児血
清を含む■ＡＴ培地で培養した。１週間後、１５％のウ
シ胎児血清を含むＨＴ培地と交換した。

（Ｅ）クローニング ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを行い、タイターの
高いものから上位１２ウエルを選択した。ウェルあたり
１ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６
ウエルのマイクロプレート１２枚に分注した。フィーダ
ーとして生後５週のマウス（Ｂａ１ｂ／ｃ）の胸腺細胞
を用いて初期増殖を促した。

プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時上清に
ついてＥＬＩＳ＆によるスクリーニングを繰り返し、Ｔ
ＨＣに対して高いタイターを示し、かつ良好な増殖を示
している細胞ラインを最終的に選別し、２００ｍ１中で
５ｘ１０５ケ／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた。

（Ｆ）最終的に選別された細胞ラインは上清を遠心分離
し、５Ｘ　１０Ｂ／ｍＬの濃度でＦＣＳ　：　ＤＭＳＯ
：９　：　１の溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で凍結
した後、液体窒素内に移して長期保存状態にした。

（Ｇ）プロティンＡ　結合’ｒ’ル（ファルマシア製Ｐ
ｒｏｔ、ｅｉｎ　Ａ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂ
）を用いたアフィニティークロマトグラフィにより細胞
培養上清からモノクローナル抗体を精製した。このモノ
クローナル抗体はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、標準蛋白との比較から、精製抗体は分子量的
５０，０００の■鎖と約２０，０００のし鎖からなるＩ
ｇＧであることを確認した。

なお本実施例では、八９−ＴＢＣを用いた免疫原を使用
したが、これは△８−Ｔｉｃおよびテトラヒドロカンナ
ビノールの誘導体例えば１１−ヒドロキシ−Δ９−テト
ラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−へ８−テ
トラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△９−
テトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−へ８
−テトラヒドロカンナヒ゛　ノール、カンナビノール、
カンナビジオール、カンナビジオール酸、カンナビジク
ロール、カンナビクロメエン、８α−ヒドロキシ−ヘキ
サヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシカンナビノ
ール、カンナビノール−１１−アルデヒドアセテートお
よび８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−へキサヒドロカ
ンナビノールを用いた免疫原としてもよい。この場合も
同様にモノクローナル抗体産生細胞ラインが作製できる
。

１直方基 上述のように作製したモノクローナル抗体を用いたＴＨ
ＣおよびＴＨＣ誘導体の検出方法について、その操作法
を以下に記載する。

（Ａ）抗原のコーティング △９−ＴＩＩＣ−ＣＧＧと同様の合成法によって得た、
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　１分子あたりＴｌＩＣ
が５分子結合したコンジュゲー）　（ＴＨＣ−ＵＳＡ）
を１％ＢｓＡおよび０．０４％のアジ化ナトリウムを含
むリン酸緩衝すリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅ
ｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ　（ＰＢＳ）　）で希釈して（Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ）　ＢＳＡの濃度として０．１ｍｇ
／ｍＬの抗原溶液を調製した。

マイクロプレート（塩化ビニル製９６ウエルプレーＬ　
　Ｃ０５ＴＡＲ社製）に抗原溶液を１００μＬ／ウェル
注入し、２０℃で１夜保存した。アスピレータで抗原溶
液を除去した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで
残存するＰＢＳを除去した。

（Ｂ）ブロッキング ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを２５０μＬ／ウエル注入し、１
時間室温で放置した。その後、アスピレータでＢＳＡ−
ＰＢＳ−ＡＺを除去した。即日に以降の実験を行わない
ときは、この状態で、水で湿したろ紙と共に４℃で保存
した。

（Ｃ）抗体の反応 ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで適時希釈した抗体（血清、培養
上清、精製抗体等）■００μＬ／ウェルを注入した。イ
ンヒビシｅンの実験を行うときはインヒビタ溶液５０μ
Ｌ／ウエルを注入し、振とうしながら抗体溶液５０μＬ
／ウエルをさらに加えた。常温で３時間保存した後、ア
スピレータで抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、
アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。

（Ｄ）第２抗体の反応 ０．２μｇ／ｍＬのヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マ
ウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ　Ｃａｔ、１４１８０１ｉ　ｌ
ｏｔ、ＨＬＩＯ−５）を１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶解
したもの（第２抗体溶液）２５μＬ／ウエル注入し、常
温で３０分放置した。アスピレータで第２抗体溶液を除
去し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存
するＰＢＳを除去した。

（Ｅ）基質の反応と停止 ０−フェニレンジアミン（生化学用）　４０ｍｇを１０
ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し
、使用直前に３０％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（
基質溶液）を１００μＬ／ウエル注入し、室温放置した
。

１０分後、４Ｎ硫酸を２５μＬ／ウエル注入して反応を
停止した。

（Ｆ）測定 東洋ソーダマイクロプレートリーダを用いて４３２ｎｍ
以上の吸光度を測定した。通常第１列は純水を注入して
参照値とし、適時（Ｃ）項のみを省いたブランク値を使
用した。

以上の方法によって、各濃度のＴＨＣを検出した例を図
に示す。同図において、縦軸は吸光度、横軸はＴＨＣ濃
度（Ｍ）対数に−１を乗じた値である。

この検出方法では、インヒビシロン法を用いているので
、ＴＨＣの濃度が高くなるほど吸光度が下がる。図に示
しているように、本条件において、１０−８ＭのＴＨＣ
を検出することができた。なお、モノクローナル抗体は
、通常免疫原と類似の構造を有している物質にたいして
もアフィニティーを示すことが知られている。したがっ
て、実施例１に示したようにΔ９−ＴＩＩＣを用いて免
疫をおこなったモノクローナル抗体を用いてもＴＨＣの
誘導体を、やや感度が低下するものの、検出することが
できる。以下、八〇−ＴＨＣおよびテトラヒドロカンナ
ビノールの誘導体についてお本実施例と同様の方法で検
出を行ったときの相対感度を以下に列挙する。

ここで相対感度は八〇−ＴＨＣの最低検出濃度を１とし
たときの各物質の最低検出濃度を示し、従って数が高く
なるほど低感度である。

八〇−ＴＩＩＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　４
１１−ヒト°ロキシー△トチトラヒト°ロカンナピノー
ル、　　　　　　　５５１１−ヒト°ロキシー△８−テ
トラヒト°ロカンナピノール、　　　　　　　７０８β
−ヒドロキ汁Δ９−テトラヒト■カンナビノール、　　
　　　　６０８β−ヒトＵキ汁Δ８−テトラヒドロカン
ナビノールカンナビノール、　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１　３カンナビジ
オール、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２　０カンナビジオール酸、　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　５カンナ
ビシクトル、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　４　５カンナピクロメＩン、　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４　０
８α−ヒト°Ｕキシーヘキ号ヒト°Ｕカンナヒ゛ノール
、　　　　　　　　　　６　０１１−ヒトＵキシカンナ
ビノール、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２　０カンナビノール−１１−アルテ°ヒト　アセテー
ト　　　　　　　　　　１　４　０８−γｔトキシート
ｋ）’　０キシ−へ４ｇヒト°Ｕカンナビノール　　　
１　６　０発明の効果 本発明によれば、テトラヒドロカンナビノールあるいは
テトラヒドロカンナビノールの誘導体に対して高いアフ
ィニティーを有するモノクローナル抗体を提供すること
が可能となる。

【図面の簡単な説明】

図は、本発明の一実施例におけるモノクローナル抗体を
用いて、ＥＬＩＳＡ法によってＴＨＣを検出した結果を
示すグラフである。 代理人の氏名　弁理士　粟野重孝　ばか１名１　γ　１

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）テトラヒドロカンナビノールまたはテトラヒドロ
   カンナビノールの誘導体と、チキン由来のガンマグロブ
   リの結合物質からなる免疫原で感作されマウスの脾臓細
   胞と、骨髄腫由来の細胞ラインとを融合後、クローニン
   グして得られ、培養上清中に産生されるイムノグロブリ
   ンが、テトラヒドロカンナビノールまたはテトラヒドロ
   カンナビノールの誘導体に特異的に結合することを特徴
   とするモノクローナル抗体産生細胞ライン。
2. （２）免疫原が、ヒト結核死菌を含むフロイントの完全
   アジュバントの混合物からなることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体産生細胞ライ
   ン。
3. （３）骨髄腫由来の細胞ラインがＰ３Ｘ８３−Ａｇ８．
   ６５３であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載のモノクローナル抗体産生細胞ライン。
4. （４）特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体
   産生細胞ラインの培養上清を精製して得られるイムノグ
   ロブリンであって、テトラヒドロカンナビノールまたは
   テトラヒドロカンナビノールの誘導体に特異的に結合す
   ることを特徴とするモノクローナル抗体。