JPH01273582A

JPH01273582A - モノクローナル抗体産生細胞ライン及びモノクローナル抗体及び免疫原

Info

Publication number: JPH01273582A
Application number: JP63103026A
Authority: JP
Inventors: Keiko Takahashi; 高橋　系子; Kimimasa Miyazaki; 仁誠宮崎; Tadayasu Mitsumata; 光亦　忠泰
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1988-04-26
Publication date: 1989-11-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はモノクローナル抗体、特に大麻の有効成分であ
るテトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカ
ンナビノールの誘導体を、血中あるいは大気中より免疫
測定法によって高感度に検知するために有用なモノクロ
ーナル抗体に関するものである。

従来の技術テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカン
ナビノールの誘導体に対する抗体は、例えばＪ、　　Ｄ
、　　ティール、エルビネ　Ｊ、フォアマン、Ｌ、　　
Ｊ、　　キング、エペリン　Ｍ、ビアル及びＶ、マーク
ス、Ｊ、ファーム、ファーマツクらによって報告されて
いる。しかしながら、報告されている抗体は、免疫した
羊の血液を精製して得られるポリクローナル抗体である
。

発明が解決しようとする課題ポリクローナル抗体は、これを得るまでの全体の製造行
程が簡単である長所を有する。反面、得られる抗体の特
性は羊の各個体に依存するため再現性のある抗体を提供
することが困難である。また、ポリクローナル抗体は抗
原に対するアフィニティーが様々な抗体の混合物である
ため、平均としてのアフィニティーが低く、高感度測定
には用いることができないなどの問題を有している。

課題を解決するための手段テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒドロカン
ナビノールの誘導体と蛋白質の結合物質からなる免疫原
で感作されたマウスの隣臓細胞と、骨髄腫由来の細胞ラ
インとを融合後、クローニングして得られたモノクロー
ナル抗体産生細胞ラインの培養上清を精製して得られる
イムノグロブリンによりモノクローナル抗体を構成する
。

作用免疫グロブリンを産生ずる細胞は脾臓内に蓄積される。

脾臓細胞はそれ自体増殖能力を持たないが骨髄腫細胞ラ
インと融合することによって、増殖しながら抗体を産生
ずるハイブリドーマ細胞ラインを作製することができる
。もつとも優れたアフィニティーを有する抗体を産生じ
、かつ高い増殖能力を有するハイブリドーマ細胞１個を
選択（クローニング）し、これを培養すると高アフィニ
ティーのモノクローナル抗体が産生される。モノクロー
ナル抗体は同一種の抗体であるため、高アフィニティー
が得られる。またハイブリドーマ細胞ラインを培養する
ことにより、永続的に一定の特性のモノクローナル抗体
を提供することができる。

実施例本発明において、目的抗原はテトラヒドロカンナビノー
ルあるいはテトラヒドロカンナビノールの誘導体であり
、これらの物質は何れも低分子であるため、蛋白質等の
高分子に結合させることにより、初めて免疫原として作
用する。その際の蛋白質は、被免疫動物と動物学上なる
べく遠く分類される生物由来のものが、免疫刺激を高め
る上で望ましい。この意味において好適な蛋白質の１つ
としてスカシ貝由来のヘモシアニン（以下ＫＬＨ）を用
いることができる。

また、テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒド
ロカンナビノールの誘導体と蛋白質の結合物質からなる
免疫原で感作されるマウスは、高い力価の抗体を産生ず
るものが望ましい。この点においてＡ／Ｊ系統のマウス
は好適である。

以下、本発明のモノクローナル抗体産生細胞ラインを作
製する実験方法を順に記載する。

実施例１以下に免疫原の合成方法をステップ毎に記して免疫原に
ついての実施例の説明を行う。

（Ａ）テトラヒドロカンナビノール（以下、ＴＨＣ）の
単離大麻樹脂１２．８ｇから石油エーテルで４．５ｇの成分
を抽出した。この成分をシリカゲルカラム、溶媒（ジエ
チルエーテル：ヘキサン＝ｌ：５）を用いたン夜体クロ
マトグラフィーにより、６００ｍｇのＴＨＣを抽出した
。テトラヒドロカンナビノールは、二重結合の位置の差
によってΔ９−ＴＩＩＣ及びΔＢ−Ｔ）Ｉｃに分別され
るが、ここで抽出されたＴＨＣは△９−ＴＨＣであるこ
とを確認した。

（Ｂ）テトラヒドロカンナビノール−１０−へミスクシ
ニック酸く以下Ｔ）ＩＣ−ＣＯＯＨ”）の合成（Ａ）項
で単離したＴＨＣを用いて　Ｊ、Ｄ、ティールらの報告
（前出）に従って合成した。無水コハク酸２６０＋ｎｇ
をピリジンＡｍＬ中で還流した中に、刊Ｃ（１１６ｍｇ
／４ｍＬピリジン）を加えて６時間還流した。これを溶
媒クロロホルムを用いて薄層クロマトグラフィーで展開
して、６１．５ｍｇのＴ）Ｉｃ−Ｃｏｏｌを抽出した。

（Ｃ）ＫＬＨへのＴＨＣの導入ＴＨＣ−ＣＯＯｔ１４３ｍｇを溶媒（ピリジン：ジオキ
サン＝１　：　２）　３ｍＬに溶かし攪はんしている中
に、■−エチル−３−（−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミドヒドロクロライド（１６，８ｍｇ／　ｌ畦
すン酸バッファー（０，団、ｐ＋＋７））を加え、さら
に３時間攪はんを行った。冷却後、ＫＬＨ溶ｔａ　（３
０ｍｌ４．　０−３４％：）を４℃で攪はんしている中
に徐々に加え、さらに４℃で１晩攪はんを続けた。この
中に含まれる変性した蛋白質を遠心分離（１９０００ｒ
ｐｍ、４０ｍ１ｎ）で除去した後、セファデックスＧ−
２５（ファルマシア製）でゲル濾過し、吸光度２８０　
ｎｍの分画を分取し、ＴＨＣ−ＫＬＨを得た。

（Ｄ）ＫＬＨに導入された刊Ｃの定潰ＫＬＨにＴ）ＩＣを導入した前後のアミノ基をクマシブ
リリアントブルーＧ（和光純薬製）で定量して、結合し
たＴｌＩＣの数を測定した。その結果、Ｔ）ＩＣ導入前
のにＬｌ＋のアミノ基は３８個、導入後のＫＬ）Ｉのア
ミノ基は１７個であった。したがって、ＫＬＨ１個当り
２１個のＴ　Ｉ　Ｃが結合したＴＨＣ−Ｋｌ−）１が得
られた。

（Ｅ）アジュバントエマルジョンの調製合成によって得
たＴ）ＩＣ−にＬＨをＰＢＳで希釈して、１ｍ３／ｍｌ
−溶液６ｍＬを得た。アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ
、　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄヒト結核死菌含、
和光純薬製、）１３７Ｒｖ）をよく攪はＡ、しながら６
ｍ１４取り、ホモジナイザで攪はんしながら（１０，Ｏ
ＯＯｒｐｍ）　ＴＨＣ−ＫＬＨ溶液溶液６卆Ｌ回に分け
て加えた。十分にエマルジョン化し、少量を水の上に落
としても広がらなくなったのを確認した。

なお本実施例では、△９−Ｔ）ＩＣを用いて免疫原を作
製したが、これは△８−Ｔ）ＩＣおよびテトラヒドロカ
ンナビノールの誘導体例えば１１−ヒドロキシ−△９−
テトラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−△８
−テトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△
９−テトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−
△８−テトラヒドロカンナヒーノール、カンナビノール
、カンナビジオール、カンナビジオール酸、カンナビジ
クロール、カンナビクロムエン、８α−ヒトａキシ−へ
キサヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシカンナビ
ノール、カンナビノール−１１−アルデヒドアセテート
および８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−へキサヒドロ
カンナビノールについてもまったく同様の合成方法を用
いて、モノクローナル抗体産生細胞ライン作製のための
免疫原が作製できる。

実施例２以下、モノクローナル抗体産生細胞およびモノクローナ
ル抗体の作製方法をステップごとに示し、実施例の説明
を行う。

（Ａ）マウスの免疫生後約８週のマウス（Ａ／Ｊ）　１０匹の腹腔に実施例
１て作製した免疫原を含むアジュバントエマルジョンを
１００μｍ、ずつ注射した。

（Ｂ）抗体産生のチエツク免疫注射後、２８日を経過したマウスについて、眼静脈
より５０〜１００μＬの血液を遠心管に採取した。

血清を遠心分離し、ＥＬｌ’ＳＡ法（後出）によるスク
リーニングを行ったところ、全てのマウスについて抗テ
トラヒドロカンナビノール抗体の産生が確認された。

（Ｃ）マウスのブースト（Ｂ）項のスクリーニングで特にタイターの高かった２
匹のマウスについてマウスのＩｆｆを肥大させるために
ブースト（弱い免疫原の注射）を行った。免疫原はＴＨ
Ｃ−ＫＬＨ４をＰＢＳで希釈して得た１ｍ８７ｍＬ溶液
を、アジュバントを加えずにそのまま用いた。免疫後２
９日を経過した時点でこの免疫原を１００７１Ｌ注射し
た（　ｉ、ｐ、）。

（Ｄ）細胞融合ブースト後３日を経過したマウスの牌臓細胞を摘出し、
平均分子ｆｆｉ　ｌ　、５００のポリエチレングリコー
ルを用いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞ライン（
、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）と融合した。フィーダ
ー（成長因子を供給する細胞）として同じマウスの牌臓
細胞を用い、９６ウ工ルプレート２枚の上で１０％のウ
シ胎児血清を含むＨＡＴ培地で培養した。１週間後、１
５％のウシ胎児血清を含むＩＴ培地と交換した。

（Ｅ）クローニングＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを行い、タイターの
高いものから上位１２ウエルを選択した。ウェルあたり
１ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６
ウエルのマイクロプレート１２枚に分注した。フィーダ
ーとして生後５週のマウス（Ｂａ　ｌ　ｂ／ｃ）の胸腺
細胞を用いて初期増殖を促した。

プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時上清に
ついてＥＬＩＳＡによるスクリーニングを繰り返し・、
ＴＨＣに対して高いタイターを示し、かつ良好な増殖を
示している細胞ラインを最終的に選別し、２００ｍ　ｌ
中で５ｘ１０５ケ／ｍＬの濃度に至るまで培養を進めた
。

（Ｆ）最終的に選別された細胞ラインは上清を遠心分離
し、５Ｘ　１０６／ｍＬの濃度でＦＣ５：　ＤＭＳＯ＝
９　：　Ｉの溶液１ｍＬに浮遊させ、−８０℃で凍結し
た後、液体窒素内に移して長期保存状態にした。

（Ｇ）プロティンＡ結合ゲル（ファルマシア製Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　Ａ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂ）を用い
たアフィニティークロマトグラフィにより細胞培養上清
からモノクローナル抗体を精製した。このモノクローナ
ル抗体はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
、標準蛋白との比較から、精製抗体は分子量的５０．０
００のＨ鎖と約２０　、０００のし鎖からなるＩｇＧで
あることを確認した。

なお本実施例では、△９−ＴＨＣを用いた免疫原を使用
したが、これは△８−Ｔ）ＩＣおよびテトラヒドロカン
ナビノールの誘導体例えば１１−ヒドロキシ−△９−テ
トラヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシ−△８−
テトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△９
−テトラヒドロカンナビノール、８β−ヒドロキシ−△
８−テトラヒドロカンナヒ゛ノール、カンナビノール、
カンナビジオール、カンナビジオール酸、カンナビジク
ロール、カンナビクロムエン、８α−ヒドロキシ−へキ
サヒドロカンナビノール、１１−ヒドロキシカンナビノ
ール、カンナビノール−１１−アルデヒドアセテートお
よび８−アセトキシ−９−ヒドロキシ−へキサヒドロカ
ンナビノールを用いた免疫原としてもよい。この場合も
同様にモノクローナル抗体産生細胞ラインが作製できる
。

実施例３実施例１，２を用いて作製したモノクローナル抗体を用
いたＴＨＣおよびＴＨＣ誘導体の検出方法の１例につい
て、その操作法を以下に記載する。

（Ａ）抗原のコーティング △９−Ｔ）ＩＣ−ＫＬＨと同様の合成法によって得た、
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　１分子あたりＴＨＣが
５分子量合したコンジュゲート（Ｔ）Ｉｃ−ＢＳＡ）を
１＄ＢＳＡおよび０．０４．＄のアジ化ナトリウムを含
む、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉ
ｎｅ　（ＰＢＳ）で希釈して（ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚ）
ＢＳＡの濃度としてＯ，１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液を調製
した。

マイクロプレート（塩化ビニル製９６ウエルブレーｈ　
　Ｃ０５ＴＡＲ社製）に抗原溶液を１ｏｏμＬ／ウエル
注入し、２０℃で１夜保存した。アスピレータで抗原溶
液を除去した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで
残存するＰＢＳを除去した。

（Ｂ）ブロッキングＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを２５０μＬ／ウエル注入し、１
時間室温で放置した。その後、アスピレータでＢＳＡ−
ＰＢＳ−Ａｚを除去した。即日に以降の実験を行わない
ときは、この状態で、水で湿したろ紙と共に４℃で保存
した。

（Ｃ）抗体の反応ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで適時希釈した抗体（血清、培養
上清、精製抗体等）■００μＬ／ウェルを注入した。イ
ンヒビジョンの実験を行うときはインヒビタ溶液５゜μ
Ｌ／ウェルを注入し、振とうしながら抗体溶液５゜μＬ
／ウェルをさらに加えた。常温で３時間保存した後、ア
スピレータで抗体溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、
アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。

（Ｄ）第２抗体の反応０．２μｇ／ｍＬのヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マ
ウス１８Ｇ抗体（ＫＰＬ　Ｃａｔ、１４１８０６　ｌｏ
ｔ、　）ＩＬＩＯ−５）をＩＸＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶
解したもの（第２抗体溶液）２５μＬ／ウエル注入し、
常温で３０分放置した。アスピレータで第２抗体溶液を
除去し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらに７スピレータで残
存するＰＢＳを除去した。

（Ｅ）基質の反応と停止０−フェニレンジアミン（生化学用）　４０ｍｇを１０
ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し
、使用直前に３ｏｚ過酸化水素水４μＬを加えた溶液（
基質溶液）を１００μＬ／ウエル注入し、室温放置した
。

１０分後、４Ｎ硫酸を２５μＬ／ウエル注入して反応を
停止した。

（Ｆ）測定東洋ソーダマイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ
以上の吸光度を測定した。通常第１列は純水を注入して
参照値とし、適時（Ｃ）項のみを省いたブランク値を使
用した。

以上の方法によって、各濃度のＴＨＣを検出した例を図
に示す。縦軸は吸光度、横軸はＴＨＣ濃度（Ｍ）対数に
−１を乗じた値である。この検出方法では、インヒビジ
ョン法を用いているので、ＴＨＣの濃度が高くなるほど
吸光度が下がる。図に示しているように本条件において
、１０−８ＭのＴＨＣを検出することができた。なお、
モノクローナル抗体は、通常免疫原と類似の構造を有し
ている物質にたいしてもアフィニティーを示すことが知
られている。したがって、実施例１に示したように△９
−ＴＩＩＣを用いて免疫をおこなったモノクローナル抗
体を用いてもＴ　Ｉ（Ｃの誘導体を、やや感度が低下す
るものの、検出することができる。以下、△８−ＴＨＣ
およびテトラヒドロカンナビノールの誘導体についてお
本実施例と同様の方法で検出を行ったときの相対感度を
以下に列挙する。ここで相対感度はΔ９−ＴＨＣの最低
検出濃度を１としたときの各物質の最低検出濃度を示し
、従って数が高くなるほど低感度である。

八８−Ｔ）ＩＣ５１１−ヒトーａキシー△９−テトラヒトーｕ力ｙすと一
ノーＩＩ、　　　　　　　　６０１１−ヒドロキシ−△
８−テトラヒビロカシナヒ゛ノー１１、　　　　　　６
５８β　−ヒトーロキシーΔ９−テトラヒドロカンナヒ
ーノール、　　　　　　　８０８β　−ヒトーロキシー
△８−テトラヒドロカンナヒ゛ノーＩｋ　　　　　　　
　８３カンナヒーノーＩＬ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２カンナヒ゛
シーオーＩＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１４カンナヒーシ゛オー１１酸、　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
３カシナヒーシクロー１１、　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４２力シナヒークロメエ
ン、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　４，３８α−ヒトーロＮシーへキサヒドロカン
ナヒーノー１工、　　　　　　　　　　５８１１−ヒト
０キシカンナヒ゛ノール、　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１９カンナヒーノー１１−１１？ルテー
ヒトー　？セテート　　　　　　　　　　　１３５８−
７セトキシー９−ヒトーロキシーヘキ号ヒトーロ力シナ
ヒリ−１＋１６２発明の効果本発明を実施することにより、テトラヒドロカンナビノ
ールあるいはテトラヒドロカンナビノールの誘導体に対
して高いアフィニティーを有するモノクローナル抗体を
提供することが可能になった。

４、図面の説明図は本発明のモノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ
法によってＴＨＣを検出した結果を示す図である。

代理人の氏名　弁理士　中尾敏男　はか１名吠光亥

Claims

【特許請求の範囲】

（１）テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒド
ロカンナビノールの誘導体と蛋白質の結合物質からなる
免疫原。
（２）特許請求の範囲第１項記載の免疫原で感作された
マウスの脾臓細胞と、骨髄腫由来の細胞ラインとを融合
後、クローニングして得られ、培養上清中に産生される
イムノグロブリンが、テトラヒドロカンナビノールある
いはテトラヒドロカンナビノールの誘導体に特異的に結
合することを特徴とするモノクローナル抗体産生細胞ラ
イン。
（３）テトラヒドロカンナビノールあるいはテトラヒド
ロカンナビノールの誘導体と蛋白質の結合物質からなる
免疫原で感作されたマウスがＡ／Ｊ系統であることを特
徴とする特許請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗
体産生細胞ライン。
（４）骨髄腫由来の細胞ラインがＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３であることを特徴とする特許請求の範囲第２項記
載のモノクローナル抗体産生細胞ライン。
（５）特許請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体
産生細胞ラインの培養上清を精製して得られるイムノグ
ロブリンであつて、テトラヒドロカンナビノールあるい
はテトラヒドロカンナビノールの誘導体に特異的に結合
することを特徴とするモノクローナル抗体。