JPH01269486A

JPH01269486A - モノクローナル抗体産生細胞ラインおよびモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH01269486A
Application number: JP63097042A
Authority: JP
Inventors: Hirokazu Sugihara; 宏和杉原; Makoto Takeya; 誠竹谷; Tadayasu Mitsumata; 光亦　忠泰; Kimimasa Miyazaki; 仁誠宮崎
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1988-04-20
Filing date: 1988-04-20
Publication date: 1989-10-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は新規なモノクローナル抗体産生細胞うインに関
するものである。この細胞ラインより産生されるモノク
「コーナル抗体は、大気中の極微量のトリニトロベンゼ
ンまたはトリニトロベンゼンの誘導体を、免疫測定法に
よって高感度ここ検知するために有用である。

トリニトロベンセンまたはトリニトロヘンセンの誘導体
は、多くの場合爆発性の危険物である。

従来の技術トリニトロヘンセンまたはトリニトロヘンセンの誘導体
に対する抗体は、ジョン・ヴアンランドらによ・って報
告されている。　（例えは、ジョン・ヴアンラント　ア
ント　マ・−レン・チル力、アナリチイ力ル　バイオケ
ミストリー、１２２．３８５〜３９３（１９８２）、　
　Ｊｏｎ　Ｗａｎｎｌｕｎｄ　ａｎｄ　Ｍａｒｌｅｎｅ
　Ｄｅｌｕｃａ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、　１２２．３８５〜３９３（１９８２）
）。

しかｌノながら、報告されている抗体は免疫したヤギの
血液を精製して得られるポリクローナル抗体である。

発明が解決しようとする課題ポリクローナル抗体は、これを得るまでの全体の製造行
程が簡単である長所を有する。反面、得られる抗体の特
性は被免疫動物の各個体に依存するため再現性のある抗
体を提供することが困難であった。また、ポリクローナ
ル抗体は抗原に対するアフィニティーか様々な抗体の混
合物であるため、平均としてのアフィニティーが低く、
高感度測定には用いることができなかった。

課題を解決するための手段トリニトロヘンセンまたはトリニトロベンゼンの誘導体
と蛋白質の結合物質からなる免疫原で感作されたマウス
の脾臓細胞と、骨髄腫由来の細胞ラインとを融合後、ク
ローニングして得られ、培養上清中に産生されるイムノ
グロブリンが、トリニトロベンゼンまたはトリニトロベ
ンゼンの誘導体に特異的に結合するモノクローナル抗体
産生細胞ラインを構成する。

作用モノクローナル抗体は同一種の抗体であるため、ポリク
ローナル抗体に比較して高アフィニティーが得られる。

またハイブリトーマ細胞ラインを培養する限り一定の特
性のモノクローナル抗体を提供することかできる。

実施例免疫グロブリンを産生ずる細胞はＭｇ！−臓内に蓄積さ
れる。脾臓細胞はそれ自体増殖能力を持たないが骨髄腫
細胞ラインと融合することによって、増殖しながら抗体
を産生ずるハイフリトーマ細胞ラインを作製することが
できる。もつとも優れたアフィニティーを有する抗体を
産生じ、かつ高い増殖能力を有するハイアリドーマ細胞
１個を選択（クローニング）し、これを培養すると高ア
フィニティーのモノクローナル抗体が産生される。

本発明において、目的抗原は！・リニトロベンゼンまた
はトリニトロヘンセンの誘導体である。

ここて、ｌ・リニトロヘンセンの誘導体とは、例えは以
下のような構造を持つ物質を指し、多くの場合、トリニ
トロベンゼンと同様爆発性の危険物である。

Ｘは、ＣＨ３、ＳＯ３、ＣＯＯ，Ｓ　Ｈ，Ｎ　Ｈ２、Ｏ
Ｈを含む官能基を示す。

これらの物質は何れも低分子であるため、蛋白質等の高
分子に結合させることにより、初めて免疫原として作用
する。ニワトリ由来のガンマグロブリンは免疫反応を良
好に惹起するため、上記目的に用いるのに好適な蛋白質
である。

また、Ｂａ　ｌ　ｂ／Ｃ系統またはＡ／Ｊ系統のマウス
は良好な免疫反応を示すため、本発明に使用するのに適
している。

これらを踏まえて、発明者らは免疫したマウスの脾臓細
胞とマウス骨髄腫由来細胞ラインを融合し、トリニトロ
ベンゼンまたはトリニトロヘンセンの誘導体に対して高
いアフィニティーを有するモノクローナル抗体を産生ず
る細胞ラインを作製することに成功したものである。

本発明を実施すること当たり、融合細胞の評価、モノク
ローナル抗体の評価、トリニトロヘンセンまたはトリニ
トロベンゼンの誘導体の検出実験等は、すべて抗原を固
定したＥｌ、ＩｓＡ法を用いて行った。

またトリニトロベンゼンの誘導体としては、爆発性の危
険物であるトリニトロトルエン（以下、ＴＮＴ）を用い
た。

まず、ＥＬＩＳＡ法の実験手順を説明する。また、以下
の文中で、リン酸緩衝液すリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−
Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）をＰＢＳと略す。

（Ａ）抗原のコーティングウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　１分子あたりトリニト
ロベンゼンが０．５分子結合したコンジュゲート（ＴＮ
ｈ、５−ＢＳＡ）を０．０４％のアジ化ナトリウムを含
む、ＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ａｚ）で希釈してＢＳＡの濃度
としてＯ，１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液を調製した。

マイクロプレート（塩化ビニル製９６ウエルプレート、
ダイナチック　ラボラトリーズ社製、ＤＹＮＡＴＥ（：
■ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）に抗原溶液をｌｏＯ
〃、Ｌ／ウェル注入し、２０℃で１夜保存した。アスピ
レータで抗原溶液を除去した後、０．０５χの界面活性
剤（ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキル
エステル類）および帆０４γのアジ化ナトリウムを含む
ＰＢＳ　（ＰＢＳ−ＡＺ−Ｔ２Ｏ）で３回洗浄し、アス
ピレータで残存するＰＢＳ、ＡＺ−Ｔ２Ｏを除去した。

（Ｂ）ブロッキング１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ａｚ　（ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａ
Ｚ）を２５０７ｚＬ／ウエル注入し、１時間室温で放置
した。その後、アスピレータでＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚを
除去した。即日に以降の実験を行わないときは、この状
態で、水で湿したろ紙と共に４℃で保存した。

（Ｃ）抗体の反応ＢＳＡ−ＰＢＳ−Ａｚで適時希釈した抗体（血清、培養
上清、精製抗体等）＋００７１１／ウエルな注入した。

インヒビジョンの実験を行うときはインヒビタ溶液５０
μＬ／ウエルを注入し、振とうしながら抗体溶液５０）
ｔ　ｌ−／ウェルをさらに加えた。常温で３時間保存し
た後、アスピレータで抗体溶液を除去し、ＰＢＡ、ＡＺ
−Ｔ２Ｏで３回洗浄し、アスピレータで残存するＰＢＳ
、ＡＺ−１°２０を除去した。

（Ｄ）第２抗体の反応０．２μｇ／ｍＬのヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マ
ウス＋ｇｃ抗体（ＫＰＩ−Ｃａｔ、１４１８０６　ｌｏ
ｔ、　ＩＩＬＩＯ−５）を１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に溶
解したもの（第２抗体溶液）５０μｍ、／ウェル注入し
、常温で３０分放置した。アスピレータで第２抗体溶液
を除去し、０．０５χの界面活性剤（ポリオキシエチレ
ングリコールソルビタンアルキルエステル類）を含む、
ＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ２Ｏ）で３回洗浄し、ざらにアス
ピレータで残存するＰＢＳ−Ｔ２Ｏを除去した。

（Ｅ）基質の反応と停止０−フェニレンジアミン（セレン検出用）　２０ｍｇを
１０畦のクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解
し、使用直前に３０χ過酸化水素水４７１１−を加えた
溶液（基質溶液）を１００７１１／ウエル注入し、室温
放置した。１０分後、４ＮｆＪｔ酸を２５μＬ／ウエル
注入して反応を停止した。

（Ｆ）測定Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＭＣを用いて
４９２ｎｍ以上の吸光度を測定した。通常第１列は純水
を注入して参照値とし、適時（Ｃ）項のみを省いたブラ
ンク値を使用した。

以下、本発明のモノクローナル抗体産生細胞ラインを作
製する実験方法を記載する。

１）免疫原の作製Ｊｏｎ　Ｗａｎｎｌｕｎｄらの報告（前出）に従って、
免疫原の合成を行なった。以降の手順をステップ毎に記
す。

（Ａ）ＣＧＧ溶液の作成ＣＧＧ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　　７６Ｆ−９３６
０）　１００ｍｇを、Ｏ，ＩＭ　ＮａＨｃＯ３（ｐＨ８
，４）　２０ｍ１中に分散し、３０ｍ　ｉ　ｎ攪はんを
行って、完全に溶解させた。

（Ｂ）ＴＮＢＳ溶液の作成トリニトロＪ＼ンゼンスルホン酸ナトリウム三水和物（
以下ＴＮＢＳ）　１４Ｂを、０．］ＭＮａＨＣＯ３５ｍ
ｌに溶解した。

（Ｃ’）　ＴＮＰ−ＣＧＧの合成ＴＮＢＳ溶液とＣＧＧ溶液を混合し、攪はんしながら３
７℃でインキュベートを行なった。２時間後ゲルクロマ
トグラフィーで低分子を除去し、３２．５ｍｌのＴＮＰ
−ＣＧＧ溶液を得た。

以上の操作で、ＣＧＧ　１分子あたり、ＴＮＩ３３２分
子が結合した免疫原を得た。

（Ｄ）アジュバントエマルジョンの調製合成ここよって
得たＴＮＰ−ＣＧＧをＰＢＳて希釈して、１ｍｇ／ｍｌ
−溶液３ｍ１．を得た。アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎ
ｔ、　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄヒト結核死菌含
、和光、Ｈ３７Ｒｖ）をよく攪はんしながら３畦取り、
ホモジナイザで攪はんしながら（１０，０００ｒｐｍ）
　ＴＮＴ−ＣＧＧ溶液溶液３左Ｌ回に分けて加えた。十
分に乳化し、小量を水の上に落としても広がらなくなっ
たのを確認した。

２）ハイブリドーマ細胞の作製（Ａ）マウスの免疫生後約８週のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）　２０匹の腹腔に
アジュバントエマルジョンを２００μＬずつ注射した。

（Ｂ）抗体産生のチエツク免疫注射後、２８日を経過したマウスについ−Ｃ１眼静
脈より５０〜ｌ００７１Ｕの血液を遠心管に採取した。

血清を遠心分離し、ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング
を行ったところ、全てのマウスについて抗トリニトロベ
ンゼン抗体の産生が確認された。

（Ｃ）マウスのブースト（Ｂ）項のスクリーニングで特にタイターの高かった２
匹のマウスについてマウスの脾臓を肥大さぜるためにブ
ースト（弱い免疫原の注射）を行った。免疫原としてＴ
ＮＰ−ＣＧＧをＰＢＳで希釈して得た０、５ｍｇ／ｍｌ
溶液を、アジュバントを加えずにそのまま用いた。免疫
後６週を経過した時点でこの免疫原１００μｍ、をマウ
スの腹腔に注射した。

（Ｄ）５ｓｔｔａ融合ブースト後３日を経過したマウスの脾臓細胞を摘出し、
平均分子ｆｉｔ、５００のポリエチレングリコールを用
いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞ライン（Ｐ３Ｘ
６３−Ａｇ８．６５３）と融合した。フィーダー（成長
因子を供給する細胞）として同じマウスの牌Ｗｔ細胞を
用い、９６ウ工ルプレート５枚の上で１０％のウシ胎児
血清を含むＨＡＴ培地で培養した。１週間後、１０γの
ウシ胎児血清を含むＨＴ培地と交換した。

３）モノクローナル抗体の作製（Ａ）クローニングＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを行い、タイターの
高いものから上位５ウエルを選択した。ウェルあたり１
ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウ
エルのマイクロプレート１０枚に分注した。

フィーダーとして生後４週のマウス（１３ａｌｂ／Ｃ）
の胸腺細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイ
ズを上げながら培養を進め、適時上清についてＥＬＩＳ
Ａによるスクリーニングを繰り返し、ＴＮＴに対して高
いタイターを示［八　かっ良好な増殖を示している細胞
ラインを最終的に選別し、２００ｍ　Ｉ中で５×１０５
ケ／ｍｌの濃度に至るまで培養を進めた。

（Ｂ）最終的に選別された細胞ラインは上清を遠心分離
し、５Ｘ　１０６／ｍ１（７）濃度テＦＣ５：ＤＭＳＯ
＝９：］（７）溶液１　ｍ　ｌ　！こ浮遊させ、−８０
℃で凍結した後、液体窒素内に移して長期保存状態にし
た。

（Ｃ）ファルマシア製Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ　ＣＬ−４８を用いたアフィニティークロマト
グラフィにより細胞培養上清からモノクローナル抗体を
精製した。このモノクローナル抗体はＳＯＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動己こより、標準蛋白との比較から
、精製抗体は分子量的５０，０００の■鎖と約２０　、
０００の１４鎖からなるＩｇＧであることを確認した。

発明の効果本発明により、トリニトロベンゼンまたはトリニトロベ
ンゼンの誘導体に対して高いアフィニティーを有するモ
ノクローナル抗体を提供することが可能になった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）トリニトロベンゼンまたはトリニトロベンゼンの
誘導体と蛋白質の結合物質からなる免疫原で感作された
マウスの脾臓細胞と、骨髄腫由来の細胞ラインとを融合
後、クローニングして得られ、培養上清中に産生される
イムノグロブリンが、トリニトロベンゼンまたはトリニ
トロベンゼンの誘導体に特異的に結合することを特徴と
するモノクローナル抗体産生細胞ライン。
（２）免疫原で感作されたマウスが、Ｂａｌｂ／ｃ系統
またはＡ／Ｊ系統であることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載のモノクローナル抗体産生細胞ライン。
（３）骨髄腫由来の細胞ラインがＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載のモノクローナル抗体産生細胞ライン。
（４）免疫原がトリニトロベンゼンまたはトリニトロベ
ンゼンの誘導体とチキン由来のガンマグロブリンとの結
合物質からなることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載のモノクローナル抗体産生細胞ライン。
（５）免疫原が、ヒト結核死菌を含むフロイントの完全
アジュバントからなることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載のモノクローナル抗体産生細胞ライン。
（６）特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体
産生細胞ラインより産生される、トリニトロベンゼンま
たはトリニトロベンゼンの誘導体に特異的に結合するモ
ノクローナル抗体。
（７）特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体
産生細胞ラインより産生される、トリニトロトルエンに
特異的に結合するモノクローナル抗体。