KR20080112246A - 햅텐 화합물 및 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 아래와 같이 화학식(1)：
화학식 (1)
에 표현되는 구조를 가지는 화합물, 상기 화합물을 햅텐으로 하여, 해당 햅텐과 고분자 화합물과의 복합체를 항원으로서 이용하여 얻을 수 있는 BSH에 대한 항체이다. 본 발명을 이용하는 것으로, BSH를 고감도 및 고선택적으로 인식하는 항체를 제작하기 위한 햅텐 화합물, BSH에 대한 항체, 및 해당 항체를 이용한 고감도 및 정량성이 뛰어난 BSH의 측정용 키트 및 면역학적 측정 방법을 제공하는 것이 가능해진다.
햅텐, 항체, BSH
Description
본 발명은, 메르캅토운데카하이드로도데카보레이트(BSH)의 햅텐 화합물, BSH에 대한 항체, 및 그것을 이용하는 면역학적 측정 방법 등에 관한 것으로, 특히 붕소 중성자 포착 요법(Boron Neutron Capture Therapy; 이하, "BNCT"라 약칭함)에 이용되는 중성자 포착 요법제의 검출 및 정량에 유용한 것이다.
최근, 방사성 동위원소를 이용한 새로운 암의 치료 방법으로서 BNCT가 주목받고 있다.붕소 중성자 포착 요법은, 붕소 10 동위체(10 B)를 포함한 붕소 화합물을 암 세포에 삽입하여, 저에너지의 중성자선(예; 열중성자)을 조사하고, 세포내에서 일어나는 핵반응에 의해 국소적으로 암 세포를 파괴하는 치료 방법이다. 이 치료 방법에서는, 10B를 포함한 붕소 화합물을 암 조직의 세포에 선택적으로 축적시키는 것이 치료 효과를 높이는데 있어서 중요하기 때문에 암 세포에 선택적으로 받아들여지는 붕소 화합물을 개발하는 것이 필요하다.
종래에는 BNCT에 이용하는 약제로서 기본 골격에 붕소 원자 또는 붕소 원자단을 도입한 붕소 함유 화합물이 합성되어 사용되고 있었고, 실제 임상에서 이용되고 있는 약제로서는 P-붕소페닐알라닌(Boron phenylalanine;BPA)이나 메르캅토운데 카하이드로도데카보레이트(BSH)가 있다. 이 중, BSH는 나트륨염의 형태로 주로 뇌종양의 치료에 이용되어 그 유용성이 확인되고 있다(예를 들어, 비특허 문헌 1~8 참조).
(비특허 문헌 1)I.M.Wyzlic등, Tetrahedron Lett., 1992, 33, 74897490,
(비특허 문헌 2)W.Tjark, J.Organomet.Chem., 2000, 614615, 3747,
(비특허 문헌 3)K.Imamura등, Bull.Chem.Soc.Jpn., 1997, 70.31033110.
(비특허 문헌 4)A.S.AlMadhorn등, J.Med.Chem., 2002, 45, 40184028,
(비특허 문헌 5)F.Compostella등, Res.Deｖelop.Neutron Capture Ther., 2002, 8184,
(비특허 문헌 6)S.B Kahl등, Progress in Neutron Capture Therapy for Cancer, Plenum Press, New York 1992, 223,
(비특허 문헌 7)J.Cai등, J.Med.Chem., 1997, 40, 38873896,
(비특허 문헌 8)H.Lim등, Res.Deｖelop.Neutron Capture Ther., 2002, 3742
그러나, BNCT에 수반하는 BSH의 생체 내 거동, 특히 세포 표층이나 세포의 마이크로 분포에 대한 자세한 내용은 아직까지 분명하게 밝혀지지 않았고, BSH의 생체 내 거동을 간편하고 신속히 정성, 정량할 수 있는 방법의 개발이 강하게 요구되고 있었다. BSH의 검출, 정량 방법으로서 면역학적 측정 방법이 기대되고 있지만, BSH와 같은 저분자 무기 화합물은 분자량·체적이 작아 이온화되기 쉬워 항원성이 낮고, BSH를 고감도로 검출할 수 있는 항체는 지금까지 얻지 못하고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 BSH를 고감도 및 고선택적으로 인식하는 항체를 제작하기 위한 햅텐 화합물, BSH에 대한 항체 및 해당 항체를 이용한 고감도이며 정량성이 뛰어난 BSH의 측정용 키트 및 면역학적 측정 방법을 제공하는 것에 있다
본 발명자는 상기 목적을 달성하기 위해, BSH의 측쇄 SH 기본으로 링커를 결합한 햅텐 화합물에 주목해 열심히 연구를 거듭한 결과, 이하에 나타내는 햅텐 화합물, 항체, 하이브리도마 등이 상기 목적을 달성할 수 있음을 찾아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 아래와 같이 화학식(1)：
화학식(1)
에 표현되는 구조를 가지는 화합물에 관한 것이다.
본 발명은, 상기 화합물을 햅텐으로 사용하고, 해당 햅텐과 고분자 화합물과의 복합체를 항원으로서 이용하는 것으로 얻을 수 있는 메르캅토운데카하이드로도데카보레이트(BSH)에 대한 항체로서, 상기 항체는 단일 클론 항체인 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것으로 상기 하이브리도마는 Hybridoma BSF2(수령 번호 ABP10689)인 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 단일 클론 항체를 포함한 메르캅토운데카하이드로도데카보레이트(BSH)의 측정 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 단일 클론 항체 또는 상기 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 메르캅토운데카하이드로도데카보레이트(BSH)의 측정 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 아래와 같이 화학식(1)：
화학식(1)
과 같이 표현되는 구조를 가지는 화합물을 제공한다. 상기 화합물은, 6-S-운데카하이드로도데카보릴헥사노익엑시드이며, BSH 햅텐으로서 매우 적합하게 사용된다. 상기 화학식(1)에 있어서, 카르복실기는 후술하는 고분자 화합물과 공유결합하는 것으로서, 복합체(결합체)를 형성한다.
상기 BSH 햅텐의 제조는 공지의 합성 방법에 의해 행할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 아래와 같이 반응식：
반응식
에 나타내 보이는 방법은, 각 공정에 있어서 고수율로 화합물을 얻는 것으로 매우 적합하게 이용된다. 상기 반응식에 있어서, 화학식(1), BSH 등의 원료 화합물은 모두 입수가 용이한 화합물이다.
또한, 상기 각 공정에 있어서의 상세한 합성 방법은 실시예 1에 기재된 바와 같다.
상기 메르캅토운데카하이드로도데카보레이트(BSH)는, 붕소, 수소 및 황 원자로부터 완성되는 20면체의 붕소 클러스터 구조를 갖는다. BSH는 무기 저분자화합물임에도 불구하고, 체적은 벤젠환보다 크고, 3개의 붕소 원자가 2개의 전자를 공유하는 이른바 삼중심 결합(three center bond) 구조를 취해, 전자가 국재화한 특이한 구조를 하고 있다.본 발명에 있어서, BSH는 아래와 같이 화학식(2),
화학식 (2)
또는 아래와 같이 화학식(3)
화학식 (3)
로 나타내어진다.
상기 BSH 햅텐은 우혈청알부민(Bovine Serum Albumin; BSA), 토끼 혈청알부민(Rabbit Serum Albumin; RSA), 난백알부민(ovalbumin; OVA), 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanine; KLH), 티로 글로블린(thyroglobulin; TG), 면역 글로블린등의 고분자 화합물(단백질)과의 복합체로 형성시킨 후 면역원으로서 이용한다.
복합체의 형성 방법은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 혼합 산무수물법 또는 활성 에스테르법 등에 의해 상기 BSH 햅텐의 카르복실기와 상기 고분자 화합물의 관능기(예를들면, 아미노기 등)를 반응시키고 복합체를 형성할 수 있으나, 이러한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 햅텐과 고분자 화합물의 복합체를 항원으로 이용하는 것으로서 얻을 수 있는 BSH에 대한 항체를 제공한다.
본 발명에서 제공하는 「항체」에는, 폴리클로날 항체 또는 단일 클론 항체가 포함되어 Fab fragment나 F(ab＇) 2 fragment 등과 같이 항원 결합성을 가지는 항체의 일부도 포함된다.이들 항체 중에서도 단일 클론 항체가 특히 바람직하다.
상기 항체의 제조 방법은 공지된 것이며, 본 발명의 항체도 통상적인 항체제조방법에 따라서 제조할 수 있다(Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.1211.13(2000)).구체적으로 본 발명의 항체가 폴리크로날 항체인 경우에는 상기 언급한 방법에 따라서 상기 BSH 햅텐과 고분자 화합물과의 복합체를 형성시킨 후, 해당 복합체를 집토끼 등의 사람을 제외한 동물에 면역하여, 해당 면역 동물의 혈청으로부터 통상적인 방법에 따라서 얻는 것이 가능하다.
한편, 단일 클론 항체의 경우에는, 상기 복합체를 상기 언급한 방법에 따라 쥐 등의 사람을 제외한 동물에 면역하여 얻을 수 있는 비장 세포와 골수종 세포를 세포융합시켜 조제한 하이브리도마를 스크리닝하여, 단일클론항체 생산 하이브리도마를 배양하는 것으로서 얻을 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987) Publish.John Wiley and Sons.Section 11.411.11).
항체의 제조는, 한외여과법(ultrafiltration), 유안 분획, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 어피니티크로마토그래피(Affinity chromatography)등의 농축·정제법을 적당 조합해 실시할 수 있다.
또, 상기 항체로서 보다 구체적으로는, 예를 들어 이하에 나타내는 본 발명의 실시 예로부터 얻을 수 있는 단일 클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 배열 또는 본 발명의 실시 예로부터 얻을 수 있던 단일 클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 배열을 가지는 항체를 들 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오티드 배열 또는 아미노산 배열은 본 발명의 효과를 가지는 한, 상기 배열의 일부가 결손, 부가, 수식, 치환, 변이하고 있는 배열을 가지는 것도 포함된다. 그러한 경우 상기 배열의 일부가 결손, 부가, 수식, 치환, 변이하고 있는 배열과 상기 배열과의 상동성이 70%이상인 것이 바람직하고, 80%이상인 것이 보다 바람직하고, 90%이상인 것이 더욱 바람직하며, 95%이상인 것이 특히 바람직하다.
중쇄의 sequence
（５’－）ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＧＣＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＣＡＣＴＧＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＴＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＧＣＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＴＴＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＴＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＧＣＣＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＴＡＡＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＡＴＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＡＣＴＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＴＡＣＴＡＧＴ
경쇄의 Sequence
（５’－）ＧＡＧＣＴＣＧＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＴＣＡＡＴＴＧＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＡＧＧＴＡＧＡＴＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＣＡＧＧＧＴＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＡＧＴＧＴＴＣＣＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡ
중쇄의 아미노산 배열
（N－）ＬＥＳＧＰＧＩＬＱＲＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧＷＦＲＱＰＳＴＫＧＬＥＷＬＡＤＩＷＷＮＤＮＫＹＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＦＬＫＩＡＳＶＤＴＩＤＴＡＴＹＹＣＳＬＲＮＳＡＥＫＴＮＴＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＴＳ
경쇄의 아미노산 배열
（N－）ＥＬＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＶＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＮＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＧＬＷＹＳＮＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＥＴＮＫＡＴＬＶＣＴＩＴＤＦＹＰＧＶＶＴＶＤＷＫＶＤＧＴＰＶＴＱＧＭＥＴＴＱＰＳＫＱＳＮＮＫＹＭＡＳＳＹＬＴＬＴＡＲＡＷＥＲＨＳＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＨＴＶＥＫＳＬＳＲＡＥＣＳ
또한, 본 발명은 상기 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.이하, 쥐의 하이브리도마 제작 방법에 대해 상세하게 설명한다.
이하, Balb/c 쥐를 예로 들어 설명한다. 상기에서 살펴본 제조방법에 따라 조제한 항원(면역원)을 2 mg/ml정도가 되도록 생리적 인산 완충액에 용해하고, 아주반트(adjuvant)와 동일한 양을 혼합한 후, Balb/c 쥐의 복강 내에 투여한다. 그 후, 약 2주간마다 추가 면역한다.
꼬리 혈관으로부터 채취한 혈액 혈청 중의 항체력가(Antibody titer)가 높아진 상기 쥐의 비장을 적출하여, 이로부터 얻은 세포를 DMEM배지(Dulbecco s modified Eagle s medium)가 담겨있는 샬레 내로 꺼낸다. 상기 배지를 원심관으로 옮겨 큰 조직편을 침강시키고, 비장 세포가 부유하고 있는 상층액을 조심스럽게 취하여 단세포의 현탁액을 저속으로 원심분리하고 세포를 모아 비장 세포를 제조한다.
쥐의 골수종 세포(P3×63Ag8. 653)를 세포수의 비로 5：1(골수종 세포：비장 세포)이 되도록 혼합하여, 저속으로 원심분리하고 세포를 모은다. 침전 세포를 풀어준 후, 37℃에 따뜻하게 해 둔 50%폴리에틸렌 글리콜(분자량 1, 500) 용액 1 ml를 천천히 첨가하여 세포를 융합한다.
세포 융합 후, DMEM 배지 9 ml를 첨가하고, 추가적으로 우태아혈청(Fetal Calf Serum)을 함유한 DMEM 배지 40 ml를 첨가한다.원심분리하여 모은 세포에, 세포수가 5×105 개/ml가 되도록 HAT 배지를 첨가하여 현탁시키고, 세포 현탁액을 96-웰 플라스틱 플레이트에 250μl/웰의 양으로 분주하고, 37℃, 5% 탄산 가스, 가습 조건 하의 인큐베이터에서 배양한다.
1주일 후, 웰 중의 배지 반량을 HAT 배지에서 치환하고, 10~14일간 배양한다. 배양액 중의 항체 활성을 ELISA로 조사해 목적하는 항체를 생산하고 있는 웰의 세포에 대해서, 한계희석법에 의해 하이브리도마의 클로닝을 실시한다.클로닝에 의해 항BSH 항체를 생산하고 있는 하이브리도마주를 얻는다.
본 발명에서는, 상기 방법에 의해 하이브리도마를 제작해, BSF-2등의 복수의 하이브리도마주를 수립했다. 이중, Hybridoma BSF-2는 기탁 번호 ABP10689로 2006년 10월 2일에 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(우편번호 3058566, 이바라키현 츠쿠바시동 1가 1번 1호)에 국제기탁하였다. 또한, BSF-2는 기탁 번호 FERM AP20805로 2006년 2월 22일에 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(우편번호 3058566, 이바라키현 츠쿠바시동 1가 1번 1호)에 일본 내 기탁하였다.
본 발명의 하이브리도마는 배지(예를 들어, 10%우태아 혈청을 포함한 DMEM)를 이용해 배양하여, 그 배양액의 원심분리 상층액을 단일 클론 항체 용액으로 할 수 있다. 또한 본 하이브리도마가 유래된 동물의 복강에 주입하여 복수(ascites)를 생성시켜, 얻을 수 있던 복수를 단일 클론 항체 용액으로 할 수 있다. 추가적으로 이러한 항체 용액은 상기에서 설명한 바와 같이 정제·농축할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 BSH의 측정 키트에 관한 것이다. 본 발명의 측정 키트는 BSH에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것으로, BSH를 간편하게 측정할 수 있어 후술하는 BSH의 측정 방법으로 매우 적합하게 사용할 수 있다. 상기 키트는 측정법으로 따라서 표지된 2차 항체 혹은 표지된 BSH 햅텐(항원), 완충액, 검출 시약 및/또는 BSH 표준 용액 등을 포함할 수 있다.
바람직한 키트는 하기에 나타내는 바와 같이 간접경합ELISA법 또는 직접 경합ELISA법으로 이용될 수 있는 것이다. 직접경합ELISA법으로 이용하는 경우, 본 키트는 본 발명의 단일 클론 항체를 고상화한 담체를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 이 경우, 아래와 같이 직접 경합 ELISA법의 공정(1)을 생략할 수 있다.
간접 경합 ELISA법으로 이용하는 경우, 본 키트는 한층 더 고상화 항원을 포함하는 것이 바람직하고, 해당 고상화 항원을 고상화한 담체에 포함하는 것이 바람직하다.이 경우, 아래와 같이 간접경합ELISA법의 공정(1)을 생략할 수 있다.
상기 고상화 항원은 본 발명의 항체를 제조하기 위해서 이용하는 햅텐과는 다른 햅텐을 포함하는 것이다. 상기 고상화 항원의 햅텐 부분은, BSH-헥사노익엑시드인 것이 바람직하다.
또한, 상기 고상화 항원은 상기 고상화 항원용 햅텐과 우혈청알부민(BSA), 토끼 혈청알부민(RSA), 난백알부민(ovalbumin; OVA), 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanine; KLH), 티로 글로블린(thyroglobulin; TG), 면역 글로블린등의 고분자 화합물(단백질)과의 복합체를 형성하는 것으로서 얻을 수 있다.
상기 고상화 항원용의 햅텐은 공지의 방법에 의해 합성할 수 있어 시판제품을 이용할 수도 있다. 복합체의 형성 방법은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 혼합 산무수물법 또는 활성 에스테르법 등에 의해 상기 고상화 항원용 햅텐의 카르복실기와 상기 고분자 화합물의 관능기(예를 들어, 아미노기)를 반응시켜서 복합체를 형성할 수 있다. 그러나 이러한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트는 아래와 같이 간접경합ELISA법으로 이용하는 경우 상기 고상화 항원, 고상화 항원을 보관 유지하는 담체, BSH 항체, 효소 표지 된 2차 항체 및 검출 시약 등을 포함한다.
게다가 본 발명은, 상기 항체 또는 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 BSH의 측정 방법에 관한 것이다. 측정 방법으로는 통상의 항원 항체 반응을 이용하는 방법이면 특별히 제한되지 않고, 방사성 동위 원소 면역 측정법(RIA), 효소 면역 측정법(ELISA), 형광 혹은 발광 측정법, 응집법, 면역블롯법, 면역크로마토그래피법등 (Meth.Enzymol., 92, 147523(1983), Antibodies Vol.II IRL Press Oxford(1989))를 들 수 있지만, 감도나 간편성 등의 점을 고려할 때 ELISA가 바람직하다. ELISA에 이용하는 효소로서는 퍼옥시다제, 알카리호스파타제,β-갈락토시다아제, 루시페라제 등을 들 수 있다.
ELISA에 의한 측정법은 간접경합ELISA 또는 직접경합ELISA 등을 들 수 있다. 예를 들면, 간접경합ELISA는 이하와 같은 순서에 의해 실시할 수 있다.
(1) 고상화 항원을 담체에 고상화한다.
이용하는 담체는 통상의 ELISA에 이용하는 담체이면 특별히 제한되지 않지만, 96-웰, 48-웰, 192-웰 등의 마이크로타이타플레이트가 바람직하다. 고상화는, 예를 들어 고상화용 항원을 포함한 완충액을 담체 위에 실어 인큐베이션 하면 좋다. 완충액 중 항원의 농도는 통상 0.01100μg/ml정도이다. 완충액으로서는 검출 수단에 따라 공지된 것을 사용할 수 있다.
(2) 담체의 고상 표면에의 단백질의 비특이적 흡착을 방지하기 위해, 고상화용 항원이 흡착하고 있지 않은 고상 표면 부분을 항원과 관계없는 단백질 등에 의해 블로킹한다.
블로킹제로서는 BSA 혹은 스킴 밀크 용액 또는 시판되는 블록 에이스(대일본제약사제) 등을 사용할 수 있다. 블로킹은 상기 블로킹제를 담체에 첨가하여, 예를 들어, 약 4℃로 하룻밤 인큐베이션 한 후, 세정액으로 세정하는 것으로서 행해진다. 세정액은 특별히 제한은 없지만, 상기(1)과 같은 완충액을 사용할 수 있다.
(3) 상기(1) 및 (2)로 처리된 고상 표면에 각종 농도의 BSH를 포함한 시료 및 본 발명의 단일 클론 항체 용액을 더한 항체를 상기 고상화 항원 및 BSH에 경합적으로 반응시키고, 고상화 항원 항체 복합체 및 BSH 항체 복합체를 생성시킨다.
반응은 통상 4~37℃으로 12시간 정도로 실시할 수 있다.
(4) 고상화 항원 항체 복합체의 양을 측정하는 것으로서 미리 작성한 검량선으로부터 시료 중의 BSH의 양을 결정할 수 있다.
고상화 항원 항체 복합체의 양은, 효소표지 한 2차 항체(BSH 항체를 인식하는 항체)를 첨가해 측정할 수 있다. 예를 들어 BSH 항체로서 쥐 단일클론 항체를 이용하는 경우, 효소표지(예를 들어, 퍼옥시다제 또는 알카리호스파타제 등)한 항쥐 염소 항체를 이용하고, 담체에 결합한 BSH 항체와 반응시키는 것이 바람직하다. 반응은 상기(3)과 같은 조건하에서 실시하면 좋다. 반응 후 완충액으로 세정한다.
(5) 담체에 결합한 2차 항체의 표지 효소와 반응하는 발색 기질 용액을 첨가해 흡광도를 측정하는 것에 의해서 검량선으로부터 BSH의 양을 산출할 수 있다.
2차 항체에 결합하는 효소로서 퍼옥시다제를 사용하는 경우에는 예를 들어, 과산화 수소와 3, 3＇, 5, 5＇-테트라메틸벤젠 또는 o-페닐렌디아민을 포함하는 발색 기질 용액을 사용할 수 있다. 통상, 발색 기질 용액을 첨가해 실온으로 약 10분 정도 반응시킨 후, 황산을 더하는 것으로 효소 반응을 정지시킨다. 3, 3＇, 5, 5＇-테트라메틸벤젠을 사용하는 경우, 450 nm의 흡광도를 측정한다. o-페닐렌디아민을 사용하는 경우, 490 nm의 흡광도를 측정한다. 추가적으로 배경치를 보정하기 위해, 630 nm의 흡광도도 동시에 측정하는 것이 바람직하다.
2차 항체에 결합하는 효소로서 알카리호스파타제를 사용하는 경우에는, 예를 들어 p-니트로 페닐인산(p-nitrophenyl phosphate)을 기질로서 발색시켜, NaOH 용액을 첨가해 효소 반응을 정지하고 415 nm로의 흡광도를 측정하는 방법을 들 수 있다.
BSH를 첨가하지 않는 반응 용액의 흡광도는 BSH를 첨가해 항체와 반응시킨 용액의 흡광도의 감소율을 저해율로서 계산한다. 기존 농도의 BSH를 첨가한 반응액의 저해율에 의해 미리 작성해 둔 검량선을 이용하고, 시료 중의 BSH의 농도를 산출할 수 있다.
다른 태양으로서 BSH의 측정은 예를 들면, 이하에서 말하는 본 발명의 단일 클론 항체를 이용한 직접경합 ELISA에 의해서 실시할 수도 있다.
(1) 본 발명의 단일 클론 항체를 담체에 고상화 한다.
이용하는 담체는 96-웰, 48-웰, 192-웰 등의 마이크로타이타플레이트가 바람직하다. 고상화는 고상화용 항체를 포함한 완충액을 담체 위에 실어 인큐베이션 하면 좋다. 완충액 중의 항체 농도는, 통상 0.01~100μg/ml정도이다. 완충액으로서는 검출 수단에 따라 공지의 것을 사용할 수 있다.
(2) 담체의 고상 표면에 단백질의 비특이적 흡착을 방지하기 위해, 고상화용 항체가 흡착하고 있지 않은 고상 표면 부분을 항체와 무관계한 단백질 등에 의해 블로킹한다.
블로킹제로서는 BSA 혹은 스킴 밀크 용액, 또는 시판되는 블록 에이스(대일본제약사제) 등을 사용할 수 있다. 블로킹은 상기 블로킹제를 담체에 첨가하여, 예를 들어, 약 4℃로 하룻밤 인큐베이션 한 후 세정액으로 세정하는 것으로서 행해진다. 세정액으로서는 특별히 제한은 없지만, 상기(1)와 같은 완충액을 사용할 수 있다.
(3) 각종 농도의 BSH를 포함한 시료에, BSH 햅텐과 효소를 결합시킨 효소 결합 햅텐을 첨가한 혼합물을 제조한다.
효소 결합 햅텐의 제조는 BSH 햅텐을 효소에 결합하는 방법이면 특별히 제한되지 않으며, 어떠한 방법을 이용하여도 무방하다.
(4) 공정(3)의 혼합물을 공정(2)로 얻을 수 있던 항체 고상화 담체와 반응시킨다.
BSH와 효소 결합 햅텐과의 경합저해반응에 의해 이들과 고상화 담체와의 복합체가 생성한다. 반응은 예를 들어, 약 25℃로에서 약 1시간 동안 실시한다. 반응 종료 후, 완충액으로 담체를 세정하여 고상화 항체와 결합하지 않았던 효소 결합 햅텐을 제거한다.
고상화 항체 효소 결합 햅텐 복합체의 양을 측정하는 것으로서, 미리 작성한 검량선으로부터 시료 중의 BSH의 양을 결정한다.
본 공정도에 대해 효소 결합 햅텐의 효소에 반응하는 발색 기질 용액을 전술한 간접경합저해 ELISA법과 동등하게 첨가하여, 흡광도를 측정하는 것으로서 검량선으로부터 BSH의 양을 산출할 수 있다.
상기 본 발명의 측정 방법은 측정 대상물에 응한 사전 처리를 하여 이를 시료로 한 후, 상기 간접 경합 ELISA 또는 직접 경합 ELISA의 공정(3)에 의하여 이루어진다.
본 발명의 하이브리도마 BSF-2로부터 생산되는 단일 클론 항체를 이용하여, BSH의 측정 방법을 실시할 수 있다. 본 항체를 이용하는 것에 의해서 지금까지 면역에세이(immunoassay)에 의한 측정법이 없었던 BSH를 특이적이고 고감도로 측정할 수 있다.
본 발명의 태양으로서 면역염색법(immunostaining)을 본 발명의 단일 클론 항체에 사용하여 BNCT에 수반하는 BSH의 생체 내 거동, 특히 세포 표층이나 세포의 마이크로 분포를 조사할 수 있다.
또한, 본 발명의 하이브리도마는 상기 단일 클론 항체를 안정적으로 단기간에 생산할 수 있어, 해당 하이브리도마를 배양하는 것으로서 BSH를 고감도로 분자 인식하는 단일 클론 항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물은, BSH 햅텐으로서 매우 적합하게 이용되는 것이다.해당 햅텐과 고분자 화합물과의 복합체를 항원으로서 이용하는 것으로, 동물에 있어 BSH에 대한 면역 응답을 양호하게 야기할 수 있는 특이적이고 고감도인 BSH 항체를 얻을 수 있다.
본 발명의 항체는 특이적이고 고감도로 BSH를 검출할 수 있다. 해당 항체가 단일 클론 항체인 경우, BSH에 대해서 특히 고감도이며 교차 반응성이 낮다.본 발명의 하이브리도마는 상기 단일 클론 항체를 단기간에 안정적으로 생산할 수 있어, 하이브리도마를 배양하는 것으로서 대량의 단일 클론 항체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 단일 클론 항체를 포함하는 것으로 BSH의 면역학적 측정 방법으로 매우 적합하게 이용되어 BSH를 특이적, 고감도 및 간편하게 측정할 수 있는 수단을 제공할 수 있다.
본 발명의 BSH의 측정 방법은 본 발명의 단일 클론 항체 또는 키트를 이용하는 것으로 감도, 특이성 및 조작의 간편성이 뛰어나다.
도 1은 본 발명의 단일 클론 항체를 이용한 직접경합 ELISA법에 있어서의 BSH 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명한다. 당업자는 본 명세서의 기재에 근거해 용이하게 본 발명에 수식, 변경을 가할 수 있으며, 그것들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
아래와 같이 실시예에 있어서, 화합물의 분석 및 분리 정제에는 이하의 기종이나 시약을 이용했다.
·NMR 스펙트럼：일본 전자 JMTC400/54/SS 400 MHz(일본전자사제).특별히 명시하지 않는 한, 내부 표준으로서 TMS를 이용했다.또, 아래와 같이 케미컬 시프트는 δ값으로 나타냈다.
·컬럼 크로마토그래피용 실리카 겔：BW200(후지시리시아사제).
〔실시예 1(BSH 햅텐의 합성)〕
(a) BSH-헥사노익엑시드 에틸에스테르(BSH-Hexanoic acid ethylester)(3)의 합성
BSH(101 mg, 0.46 mmol)를 아세트니트릴(10 mL)에 용해시킨 후, 실온에서교반하면서 브로모 헥사노익엑시드 에틸에스테르(Bromo hexanoic acid ethylester)(0.2 mL, 1.12 mmol)를 천천히 방울로 내려 실온에서 2일간 교반했다. 그 후, 감압 농축에 의해 아세트니트릴을 제거해, 농축 찌꺼기를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름：메탄올=9：1)에 의해 정제하여, 황색 유상물(101 mg, 수율 67.4%)를 얻었다.
·TLC：Rf=0.58(클로로포름：메탄올=3：1)
·1 H-NMR(DMSO) δ(ppm)：0.60-2.10 (m), 1.08 (t, 3H, J=7.08Hz), 1.34-1.42 (m, 2H), 1.52-1.59 (m, 2H), 1,63-1.70 (m, 2H), 2.19 (t, 2H, J=7.32Hz), 2.77 (m, 2H), 3.95 (q, 2H, J=7.08Hz).
(b) BSH-헥사노익 엑시드(BSH-Hexanoic acid)(4)의 합성
상기(a)에서 얻은 화합물(113.7 mg, 0.31 mmol)을 메탄올(2.0 mL)에 용해시켜, 2N 수산화 나트륨(0.63 mL)를 방울로 내려 실온에서 6시간 동안 교반했다. 반응액을 초산에틸을 이용해 세정한 후, 1N 염산을 pH3이 될 때까지 첨가하여 초산 에틸로 추출했다. 그 후, 물 및 포화 식염수로 세정해 황산마그네슘으로 건조시켜, 감압 농축에 의해 초산에틸을 제거하고, 농축 찌꺼기를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름：메타놀=4：1)에 의해 정제하여, 황색 유상물(69.9 mg, 수율 67.4%)를 얻었다.
·TLC：Rf=0.30(클로로포름：메타놀=2：1)
·1 H-NMR(DMSO) δ(ppm)：0.60-2.10 (m), 1.30-1.37 (m, 2H), 1.45-1.53 (m, 2H), 1,63-1.73 (m, 2H), 2.20 (t, 2H, J=7.32Hz), 2.85 (m, 2H).
〔실시예 2(면역원의 조정)〕
(c) BSH-헥사노익엑시드-BSA 복합체(BSA를 이용한 면역원)의 합성
센트 튜브에 소 혈청알부민(11 mg, 164 nmol) 및 pH9.4의 붕산염 완충액(4 붕소산나트륨 50 mmol, 염화 나트륨 15.4 mmol, 아지화 나트륨 0.3mmol/순수 100 mL)를 760μL 첨가하여 4℃로 하룻밤 동안 교반한 후, DMF(40μL)를 첨가했다(I액).
다른 센트 튜브에 상기(b)로 얻은 화합물(6.0 mg, 18μmol), N-히드록시코하크산이미드(1.5 mg, 13.3μmol), 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노 프로필)- 카보디이미드 염산염(2.5 mg, 13.3μmol), DMF(200μL)를 더해 실온으로 하룻밤 동안 교반 하였다(II액).
I액에 II액을 실온에서 적하(10μL/5분 )하여, 실온하에서 2.5시간 동안 교반한 후, 4℃로 하룻밤 동안 교반 하였다. 이것을 10% 이소프로판올인산완충액으로 약 60시간(완충액을 6회 바꾼다) 동안 투석하여, BSH-헥사노익엑시드-BSA 복합체(결합체)를 얻었다.이것을 ICP 분석에 의해 붕소 농도를 측정한 후, 1.5 mL의 에펜도르프 튜브로 옮기고, 4℃로 보존했다.
(d) BSH-헥사노익엑시드-KLH 복합체(KLH를 이용한 면역원)의 합성
면역원으로서 KLH와 본 발명 BSH-햅텐과의 결합체를, 상기(c)와 동일하게 제작했다.
〔실시예 3(폴리크로날 항체의 제작)〕
실시예 2로 조정한 BSH-햅텐-KLH 결합체를 인산완충 용액(pH7.4)으로 1 mg/mL가 되도록 희석했다. 이 항원 용액 600μL를 등량의 RIBI 아주반트(MPL＋TDM Adjuｖant System, SIGMA M6536)와 혼합해, 2~3분간 볼텍싱(voltexing)하여 충분히 혼합했다.이것을 5마리의 Balb/c 쥐(8주령, 수컷)에 복강 내 주사로 면역 했다(50μg/dose).이것을 2주마다 실시하여, 3번째의 면역 이후는 각 면역으로부터 1주일 후에 채혈(안와채혈)을 실시했다.
실시예 2로 조정한 항원(BSH 햅텐 BSA 결합체)을 PBS(pH7.4)로 5.0μg/mL가 되도록 희석하여, ELISA용 마이크로 플레이트에 100μL씩 분주해, 37℃에서 1시 간 정치하는 것으로 항원을 플레이트 표면에 고정했다.
그 후 PBSTween 용액(인산완충액 pH7.4, 0.05%Tween20)로 세정하여, 비특이적 흡착을 막기 위해서 블로킹 용액(인산완충액 pH7.4, 1%Block Ace)를 200μL씩 첨가하여 37℃에서 1시간 정치해 블로킹을 실시했다. 그리고, PBSTween 용액으로 세정 한 후, 제조한 샘플을 100μL 첨가해 다시 37℃에서 1시간 동안 정치했다. PBSTween 용액으로 세정한 후, 2차 항체를 50μL 첨가해 37℃으로 1시간 동안 정치해, 2차 항체(HRP 표지 염소항쥐 IgG(γ쇄 특이적))와 반응시켰다.
PBSTween 용액으로 세정한 후, 사전에 조정해 둔 기질 용액(인산구연산 완충액(pH5.0), 0.04%o페닐렌디아민)에 과산화수소수를 0.02%가 되도록 조정하여, 200μL 첨가했다. 37℃으로 30분 정치해 발색시킨 후, 마이크로 플레이트 리더(BIORAD/Model550)를 이용해 흡광도를 측정했다.
〔실시예 4(하이브리도마 및 단일 클론 항체의 제작)〕
(a) 동물의 면역과 항체생산세포의 조제
합성한 BSH-햅텐-KLH 결합체(실시예 2)를 인산완충액 pH7.4(PBS)(NaCl 137 mM, NaHPO4·12 H2O 8.10 mM, KCl 2.68 mM, KH2PO4 1.47 mM)로 500μg/mL가 되도록 희석했다.이 항원 용액 2 mL를 40℃에서 10분간 가온한 RIBI 아주반트시스템(RIBI/MPL(등록상표)＋TDM Emulsion, R700)과 혼합해, 23분간 볼텍 싱(voltexing)하여 충분히 혼합했다.
이것을 5마리의 Balb/c 쥐(8주령, 수컷)에 피하 주사하여 면역 했다(50μg/dose).이것을 2주 마다 실시하고, 2번째의 면역 이후는 각 면역으로부터, 1주일 후에 채혈(안와채혈)을 실시했다. 채혈한 혈액은 1.5 mL튜브에 모아 37℃으로 1시간 인큐베이트 한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 정치했다.
(b) 세포 융합
(b-1) DMEM 배지의 조제
DMEM 배지(IWAKI DME/LOW, Lot.99562013) 1 팩, 황산 겐타마이신(겐타마이신 642μg/mg, SIGMA Lot.105 H0457) 78.4 mg, 탄산수소나트륨(칸토 화학, Lot302F1378) 2.2 g에 MilliQ를 첨가해 1L로 한 후, 0.22μm필터(MILLIPORE MILLEX(등록상표) GV, 0.22μm 필터 SLGV01352)로 멸균하고, DMEM 배양지를 제조했다.
(b-2) HAT 배지 및 HT배지의 제조
HAT supplement(SIGMA, Lot＃61 K8934) 한병에 10 mL의 멸균한 MilliQ를 더해 병 내의 시약을 완전하게 녹였다.이 용액을 DMEM 배지(15%FCS)의 1/50량 만큼을 첨가, 혼합하여 HAT 배지를 제조했다. HT supplement(SIGMA, Lot＃32 K8928) 한병에 10 mL의 멸균한 MilliQ를 첨가하고 병 내의 시약을 완전하게 녹여, 이 용액을 DMEM 배양지(15%FCS)의 1/50량 만큼 첨가하여 혼합해, HT배지를 제조했다.
(b-3) 50%PEG 배지의 제조
20 g의 PEG6000(PEG＃6000(M.W.73009000), 나카라이테스크, Lot M8H2950)를 20 mL의 DMEM 배지에 첨가하여 Hot Plate Stirrer로 2시간 동안 교반하여 완전히 녹였다. 그 후, 40 mL로 희석하여, 클린 벤치에서 0.20μm필터를 이용하여 멸균했다. 그 후, 1.8 mL씩 분주한 후 동결하고 사용 직전에 용해하여, 200μL의 DMSO(SIGMA, Lot＃42 K2401)를 첨가하여 50%PEG(10%DMSO) 용액을 제작했다.
(b-4) ACK lysis 완충액의 제조
MilliQ 90mL에 염화 암모늄 802.3 mg, 탄산수소칼륨 10.01 mg, EDTA3.72 mg를 첨가하여 pH 7.2~7.4로 조정해, 100 mL로 희석하였다. 이것을 medium 병에 넣어 121℃으로 20분간 autoclave하여, 멸균하고, ACK lysis 완충액(0.15 M염화 암모늄, 1.0 mM탄산수소칼륨, 0.1 mMEDTA, pH7.27.4)으로 제조하였다.
(c) 비장 세포의 조정
항체 값이 포화에 이른 쥐에 최종 면역(꼬리 정맥주사)을 실시하여, 3일 후에 비장을 적출해냈다. 적출한 비장을 냉동된 DMEM가 들어간 샬레에 넣어 클린 벤치내에 넣었다. 적출한 비장의 불필요한 부분을 제거하고, 새로운 DMEM 배지가 들어간 5 mL샬레에 넣었다. 2개의 핀셋트을 이용하여, 비장세포를 꺼내, cell strainer-(FALCON2350, 70μm나일론)로 불필요한 것을 제거하고, 통과한 세포를 유리제의 원심관에 모아 1000 rpm로 10분간 원심분리 했다.
상층액을 버리고 5 mL의 ACK lysis 완충액을 첨가해 피페팅에 의해 균일하게 혼합하여 실온에서 5분간 정치한 후, 비장 세포를 세정하여 제거했다(적혈구의 제거). 여기에 20 mL의 DMEM 배지를 첨가해 1000 rpm로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거했다. 그 후 20 mL의 DMEM 배지를 첨가하여 피페팅에 의해 세포를 세정해, 1000 rpm로 10분간 원심분리 했다. 상층액을 제거하여, DMEM 배양지를 10 mL 첨가해 피페팅에 의해 혼합한 후, 혈구 계산반(Erma Tokyo4062)를 이용하여 세포수를 카운트했다.
(d) 골수종 세포의 조정
골수종 세포(P3X63Ag8U.1)를 세포 융합 일정에 맞추어 배양해, 사용 직전에 세포를 유리제의 원심관에 모아 1000 rpm로 10분간 원심분리 했다. 상층액을 제거하고, DMEM 배지를 10 mL 첨가하여 피페팅에 의해 혼합한 후, 혈구 계산반(Erma Tokyo4062)를 이용하여 세포수를 카운트했다.
(e) 세포 융합
비장 세포：골수종 세포가 10：3이 되도록 골수종 세포 현탁액의 양을 조정하여, 비장 세포 현탁액을 원심관에 넣어 피페팅에 의해서 혼합했다.이것을 1000 rpm로 10분간 원심분리 해 상층액을 제거한 후, 파스퇴르피펫을 이용하여 완전하게 상층액을 제거했다.
그 후, 원심관을 두드려서 세포를 원심관의 벽에 넓게 펴지도록 하였다. 원심관을 손으로 따뜻하게 해주며 돌리면서, 1 mL의 50%PEG(10%DMSO) 용액을 1분 이상 걸쳐서 서서히 첨가했다. 원심관을 1분간 따뜻하게 하면서 돌려, 같은 방법으로, 2 mL의 DMEM 배지를 2분 이상 걸쳐서 첨가한 후 8 mL의 DMEM 배지를 5분 이상 걸쳐서 첨가했다.
그 후, 1000 rpm로 10분간 원심분리하여, 상층액을 버리고, 10 mL의 DMEM 배지를 첨가하여 세포를 세정해, 1000 rpm로 10분간 원심분리 했다. 상청액을 제거하여, DMEM(15%FCS) 배지를 세포 밀도가 2×105개/mL가 되도록 조정해, 96-웰 플레이트에 100μL씩 분주하여, 37℃에서 하룻밤 동안 정치했다.
(f) HAT 선택
96-웰 플레이트에 분주한 세포에, 2배 정도의 HAT 배지를 100μL씩 분주하여, 37℃에서 1주간 방치했다. 그 후, 100μL의 HAT 배지를 첨가했다. 그 후, 양성의 웰의 하이브리도마를 24-웰 플레이트로 옮겨 HT배지를 이용해 전량을 1 mL로 만들었다. 3일 후, 2차 스크리닝을 실시하여 양성인 웰을 한계 희석법에 따라 클로닝 했다.
(g) 한계 희석법을 이용한 클로닝
2차 스크리닝으로 양성인 웰의 하이브리도마세포의 세포수를 혈구 계산반(Erma Tokyo4062)를 이용하여 카운트하고, 농도를 구해 클로닝용의 배지(DMEM(15%FCS) 배양지 20 mL, Briclone 1 mL)를 이용하여, 단계 희석하는 것으로서 10개/mL, 5개/mL로 조정했다. 96-웰 플레이트에 100μL씩 분주하여, 1 웰 부근 세포가 1개 또는 0.5개가 되도록 했다.
이것을 37℃에서 1주간 정치하고, 그 후 각 웰에 100μL씩 클로닝 배지(클로닝陽의 배지)를 첨가하여 37℃에서 1주간 정치했다. 양성인 웰의 세포를 48-웰 플레이트로 옮겨, 똑같이 2번째의 클로닝을 실시하여, 최종적으로 단일의 하이브리도마를 얻었다.
(h) 무혈청배지로부터의 항체 정제
무혈청배지에서 배양한 하이브리도마 세포 BSF-2 배양액을 1000 rpm로 10분간 원심분리하여, 세포 상층액이, 60% 황산암모늄 농도가 되도록, 황산암모늄을 첨가하여 항체 단백질을 침전시켰다.이것을 4℃에서 2시간 동안 교반하여, 하룻밤 동안 방치했다. 그 후, 4℃, 13500 rpm로 20분 동안 원심분리하여, 결합 버퍼에 용해시켜, 결합 버퍼로 투석했다.
투석 후, 8000 rpm로 10분간 원심분리하고, 상층액을 0.45μm로 필터 여과 하여 샘플로 했다. 컬럼에 5 mL의 초순수를 유속 1방울/초(1~2 mL/분 )로 송액후, 3~5 mL의 결합 버퍼를 유속 1방울/초(1~2 mL/분 )로 송액해, 컬럼의 평형화를 실시했다. 그 후, 조정한 샘플을 1방울/2초(1~2 mL/분 )에 송액해, 항체를 컬럼에 흡착시켰다.
비흡착 성분을 3~5 mL의 결합 버퍼(20 mM 인산나트륨, 0.8 M황산암모늄, pH7.5)에 유속 1방울/초로 송액하는 것으로서 제거한 후, 5 mL용출버퍼(20 mM 인 산나트륨, pH7.5)를 1방울/초(12 mL/분 )로 송액해 항체를 용출하게 하였다. 용출액을 0.5 mL씩 회수했다.
모든 fraction의 흡광도(OD=280 nm)를 측정해, 항체 단백질을 포함하고 있는 fraction를 브래드포드법에 의해, 항체 단백질의 농도를 측정했다. 그 후, SDS-PAGE로 단일 클론 항체의 순도를 확인하였다. 또한, 단일 클론 항체의 뉴클레오티드 배열 및 아미노산 배열은 상술했던 바와 같았다.
(i) 항체의 감도 측정과 검량선의 작성(직접 경합 ELISA법)
PBS 용액(인산완충액 pH7.4)를 이용해 5μg/mL에 제조한 단일 클론 항체(하이브리도마주(BSF-2로부터 조제) 용액을 100μL씩 96-웰 ELISA용 플레이트에 분 주하여, 37℃에서 1시간 동안 정치하는 것으로 플레이트에 항체를 고상화했다. 반 응 후, PBSTween 용액(인산완충액(pH7.4), 0.05%Tween20)로 세정해, 비특이적 흡착을 막기 위해서 플레이트에 블로킹 용액(인산완충액(pH7.4), 1%BSA)을 첨가해 실온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜, 블록킹을 실시했다.
PBSTween 용액으로 세정하고, HRP 표지한 경합제(HRP 결합 BSH-헥사노익엑시드)의 PBS 용액(0.5μg/mL) 안에, BSH가 각각 100~0.001 ppm의 농도가 되도록 샘플을 조정했다.
제조한 샘플을 각각 100μL씩 96-웰 ELISA용 플레이트(IWAKI 3801096)에 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 통상적인 방법으로 ELISA(기초 용액(50 mmol 인산구연산 완충 용액(pH5.0), 0.04% o-페닐렌디아민))를 실시해, 마이크로 플레이트 리더(BIORAD/Model550)를 이용해 490 nm에 있어서의 흡광도를 측정했다.
측정 결과를 도 1에 나타낸다. X축은 BSH 농도를, Y축은 흡광도를 나타낸다. 도 1이 나타내듯이, 하이브리도마주 BSF-2로부터 제조한 단일 클론 항체를 이용해 BSH를 특이적으로 검출할 수 있어 BSH 농도가 0.001~1μM의 폭넓은 범위에서 흡광도 측정에 의한 BSH의 농도 측정이 가능했다. 이와 같이 본 발명의 하이브리도마 및 항체를 이용하여, BSH가 폭넓은 농도 범위에서 매우 감도의 높은 정량 평가 및 정성 평가 등이 가능해 진다.
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1 5 10 15
Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Pro Ser Thr Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Asp
35 40 45
Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg
50 55 60
Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile
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Ala Ser Val Asp Thr Ile Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Leu Arg
85 90 95
Asn Ser Ala Glu Lys Thr Asn Thr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
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165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
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195 200 205
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Claims (8)
- 아래와 같이 화학식(1)：화학식(1)
의 구조를 가지는 화합물. - 청구항 1의 화합물을 햅텐으로 사용하여, 해당 햅텐과 고분자 화합물과의 복합체를 항원으로 이용함으로서 얻을 수 있는, 항메르캅토운데카하이드로도데카보레이트(BSH) 항체
- 청구항 2에 있어서, 상기 항체는 단일 클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
- 청구항 3의 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마.
- 청구항 4에 있어서, 상기 하이브리도마는 Hybridoma BSF-2(기탁 번호 ABP10689)인 것을 특징으로 하는 하이브리도마
- 청구항 3의 단일 클론 항체를 포함하는 메르캅토운데카하이드로도데카보레이트(BSH)의 측정 키트.
- 청구항 3의 단일 클론 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 메르캅토운데카하이드로도데카보레이트(BSH)의 측정 방법.
- 청구항 6의 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 메르캅토운데카하이드로도데카보레이트(BSH)의 측정 방법.
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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| AMND | Amendment | ||
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| AMND | Amendment | ||
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| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |