JP2001048900A - 抗体及びこれを使用した測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ビスフェノールＡを特異的に認識する抗体、及
び該ビスフェノールＡ特異抗体を利用してイムノアッセ
イにより、ビスフェノールＡを簡便かつ特異的に測定・
検出する方法を提供。 【解決手段】２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）
プロパンに特異的反応性を有し、ビス（４−ヒドロキシ
フェニル）メタン、ビス（４−ヒドロキシフェニル）エ
タン、フェノール及び３，４−ビス（４−ヒドロキシフ
ェニル）−３−ヘキセンとは実質的に交差反応しないこ
とを特徴とする抗体；及び該抗体を使用してイムノアッ
セイを行うことを特徴とする被検物質中のビスフェノー
ルＡを特異的に測定・検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗体及びこれを使
用した測定法、より詳しくは、ビスフェノールＡ（2,2-
bis(4-hydroxyphenyl)propane: BPA）に特異的反応性を
有する新規な抗体及びこの抗体を用いたビスフェノール
Ａの測定・検出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビスフェノールＡは、ポリカーボネート
樹脂やエポキシ樹脂の原料として種々の製品に広く使用
されている有機化学物質である。現在、これは、内分泌
撹乱化学物質（環境ホルモン）の１つとして注目され、
ヒトの疾患、例えば、生殖機能の低下等との関連や、神
経内分泌への影響が研究されている。

【０００３】ビスフェノールＡの検出・測定は、このよ
うな有機化合物の場合に一般的である、高速液体クロマ
トグラフィー、ＬＣ−Ｍａｓｓ及びＧＣ−Ｍａｓｓ等の
物理化学的機器を用いた方法により実施されている。し
かしながら、このような検出・測定は、用いられる機器
類が高価であるばかりでなく、検体（サンプル）量、検
体の処理能においても限界があり、簡便でしかも多数の
検体を正確に測定・検出できる方法の開発が望まれてい
る。

【０００４】一方、ビスフェノールＡの感作性、交差反
応性及び抗原決定構造に関する研究を目的として、ビス
フェノールＡに反応性のある抗体の製造が報告されてい
る［口腔病学会雑誌、59(2), 439-455 (1992)］。ま
た、ビスフェノールＡ抗体を利用したビスフェノールＡ
の測定法の開発も報告されている［日本水処理生物学会
誌、別巻18、40頁 (1998)及び第３３回日本水環境学会
年会講演集、173頁（1999）］。

【０００５】しかしながら、これら報告された抗体は、
ビスフェノールＡを特異的に認識するものではなく、例
えばフェノールや３，４−ビス（４−ヒドロキシフェニ
ル）−３−ヘキセン（ＤＥＳ）（前者報告の抗体）或い
はビス（４−ヒドロキシフェニル）メタン及びビス（４
−ヒドロキシフェニル）エタン（後者報告の抗体）等の
関連物質とも交差反応することが報告されており、ビス
フェノールＡの特異的な測定・検出に利用する上で課題
を残していた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
従来技術の課題を解決して、ビスフェノールＡを特異的
に認識する抗体、即ちビスフェノールＡに対して特異的
な反応性を示す抗体を提供することにある。

【０００７】また、本発明の目的は、かかるビスフェノ
ールＡ特異抗体を利用してイムノアッセイにより、ビス
フェノールＡを簡便かつ特異的に測定・検出する方法を
提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】発明者は、鋭意研究の結
果、上記目的とする抗体の確立に成功し、ここに本発明
を完成するに至った。

【０００９】本発明によれば、２，２−ビス（４−ヒド
ロキシフェニル）プロパン（ビスフェノールＡ）に特異
的な反応性を有し、ビス（４−ヒドロキシフェニル）メ
タン、ビス（４−ヒドロキシフェニル）エタン、フェノ
ール及び３，４−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−３
−ヘキセンとは実質的に交差反応しないことを特徴とす
る抗体が提供される。

【００１０】また、本発明によれば、２，２−ビス（４
−ヒドロキシフェニル）プロパン（ビスフェノールＡ）
又はそのキャリア蛋白結合体を高分子吸着体に吸着させ
てなる免疫抗原を、ヒトを除く温血動物に免疫して得ら
れる上記抗体、特にウサギ抗血清である上記抗体及びモ
ノクローナル抗体である上記抗体が提供される。

【００１１】更に、本発明によれば、イムノアッセイに
より被検物質中のビスフェノールＡを測定・検出する方
法であって、上記抗体を使用すること、即ち被検物質と
上記抗体とを接触させること、を特徴とするビスフェノ
ールＡの測定・検出方法、及びビスフェノールＡを測定
・検出するための分析試薬として上記抗体を使用する方
法が提供される。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明に係る抗体（本発明抗体）
は、ビスフェノールＡ又はこれを含む免疫抗原を利用し
て、一般的抗体の製造法に従い製造することができる。
該抗体には、温血動物の抗血清や鶏卵抗体等のポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体が包含される。

【００１３】本発明抗体は、ビスフェノールＡに特異的
な反応性を有すること、即ちビスフェノールＡとは反応
するが、ビス（４−ヒドロキシフェニル）メタン、ビス
（４−ヒドロキシフェニル）エタン、フェノール及び
３、４−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘキセ
ンとは実質的に交差反応しないこと、で特徴付けられ
る。ここで、実質的に交差反応しないとは、本発明抗体
がこれら４種の化合物をほとんど認識しないことを意味
する。その反応性（交差反応性）は、ビスフェノールＡ
との反応性を基準として、その５０％を超えないもの、
好ましくは２０％以下、より好ましくは数％程度以下で
ある。

【００１４】かかる特性を有する本発明抗体は、特定の
免疫抗原を、温血動物（ヒトを除く）に免疫することに
より収得することができ、その方法乃至手法は、基本的
には常法に従うことができる。

【００１５】例えば、本発明抗体は、上記免疫抗原を温
血動物に免疫することにより、抗体を該温血動物の血液
等の体液内または該温血動物が産卵した卵内に産生さ
せ、それらより取得することができる。

【００１６】上記において、免疫抗原としては、ビスフ
ェノールＡ及びそのキャリア蛋白結合体を用いることが
重要である。ここで、ビスフェノールＡ（下記式［１］
の化合物）は、既知であり、例えば市販品として入手す
ることができる。

【００１７】

【化１】

【００１８】また該ビスフェノールＡのキャリア蛋白結
合体は、ビスフェノールＡを、常法に従い、例えば無水
ジカルボン酸を用いてアシル化し、かくして得られる下
記式［２］の化合物を、キャリア蛋白と結合させること
により、製造することができる。

【００１９】

【化２】

【００２０】（式中、ｎは１〜５の整数を示す。）上記
キャリア蛋白としては、抗原乃至ハプテンの免疫原性を
高めるものとして当該分野で慣用される各種キャリア蛋
白をいずれも使用できる。その例としては、例えばアル
ブミン、グロブリン、ヘモシアニン等の各種動物蛋白質
やポリリジン等の人工ポリペプチド等を例示できる。こ
れらキャリア蛋白は、慣用の試薬を用いた縮合反応によ
り、上記式［２］の化合物との結合体とすることができ
る。該試薬としては、例えば例えば１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
（ＥＣＤＩ）等のような水溶性カルボジイミド類や、ジ
メチルスペルイミデート（ＤＭＳ）のような縮合剤等を
例示することができる。

【００２１】上記キャリア蛋白結合体は、それ自体所望
の免疫原性を有し、本発明抗体製造用の免疫抗原として
使用できる。

【００２２】本発明における免疫抗原としては、より好
ましくは、上記ビスフェノ−ルＡ又はそのキャリア蛋白
結合体を高分子吸着体に吸着させて得られる吸着体を使
用することができる。

【００２３】ここで、高分子吸着体としては、免疫原性
を高めるものとして当該分野で慣用される各種高分子物
質を採用できる。これには、例えば炭素末、ポリビニル
ピロリドン、ラテックス、ブタチログロブリン等の血清
蛋白質等が包含される。該高分子吸着体とビスフェノー
ルＡ又はそのキャリア蛋白結合体とを、常法に従い混和
することにより、所望の吸着体が得られる。

【００２４】上記免疫抗原を用いた免疫化及び所望抗体
の取得操作も、常法に従うことができる。例えば、ポリ
クローナル抗体の製造は、ウサギ、ヒツジ、モルモッ
ト、ニワトリのような温血動物に、上記免疫抗原を、通
常フロイントの完全アジュバントとともに複数回免疫す
ることにより抗血清を産生させ、そしてその血液を採取
し、常法に従い抗血清を取得することにより実施でき
る。また、ニワトリの場合には、上記免疫抗原を複数回
免疫して、該ニワトリが産卵する鶏卵にイムノグロプリ
ンＹ（ＩｇＹ）を産生させ、そして該鶏卵の卵黄より、
常法に従いＩｇＹを取得することによってもポリクロー
ナル抗体を得ることができる。

【００２５】本発明抗体は、勿論モノクローナル抗体と
して取得することもできる。該モノクローナル抗体は、
例えば、上記免疫抗原をフロイントの完全アジュバント
とともにマウスに複数回投与して免疫化し、抗体を産生
させるとともに、例えば細胞融合法等の常法に従い、得
られる抗体産生細胞と、骨髄脾細胞とを融合し、クロー
ニングし、目的とする抗体を産生する単一クローン細胞
を分離し、該細胞の培養により取得することができる。

【００２６】かくして得られる本発明抗体は、所望によ
り、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等の常法に従い更に精製することができる。

【００２７】而して、本発明抗体の取得に際しては、本
発明抗体に特徴的な前記の特異反応性、即ちビスフェノ
ールＡに対する特異的反応性を有し、ビス（４−ヒドロ
キシフェニル）メタン、ビス（４−ヒドロキシフェニ
ル）エタン、フェノール及び３、４−ビス（４−ヒドロ
キシフェニル）−３−ヘキセンとは実質的に交差反応し
ないことで特徴付けられる反応性を有する抗体の選択が
重要である。

【００２８】当該選択は、取得された抗体とビスフェノ
ールＡ及び上記４種化合物との反応性を試験することに
より、例えば、免疫された温血動物の個体間より、或い
はクローン化された単一クローン間より、適宜行うこと
ができる。

【００２９】当該反応性の試験は、抗体と供試化合物と
の免疫反応性が確認できる限りにおいて特に制限はな
く、例えば後述の実施例に記載の測定法に従い良好に実
施することができる。

【００３０】本発明者は以下の事実を確認している。即
ち、上記免疫抗原を免疫された温血動物の個体は、既知
の抗ビスフェノールＡ抗体と同様に、ビス（４−ヒドロ
キシフェニル）メタン、ビス（４−ヒドロキシフェニ
ル）エタン、フェノール及び３、４−ビス（４−ヒドロ
キシフェニル）−３−ヘキセンの１又は複数化合物との
交差反応性を実質的に有する抗体を産生する。しかしな
がら、同時に、上記個体中には本発明抗体特有の反応性
を有する抗体を産生する個体を見出すことができる。か
かる特定個体の選択は、本明細書の開示に従い、再現性
をもって実施可能である。かかる選択は、また、単一ク
ローンからの本発明抗体の選択においても同様である。
しかし、ビスフェノールＡのような低分子有機化合物を
抗原として産生する抗体の力価においては、一般に、ポ
リクローナル抗体が優れていることが本発明者により確
認されている。

【００３１】かくして得られる本発明抗体の利用によれ
ば、一般のイムノアッセイに従い、ビスフェノールＡの
特異的な測定・検出が可能である。

【００３２】ビスフェノールＡを標的とするかかるイム
ノアッセイとしては、例えば、酵素イムノアッセイ（Ｅ
ＩＡ）、酵素イムノメトリックアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ等を制
限なく例示することができる。これらのアッセイは、ま
た一般的な競合法やサンドイッチ法等の手法に従って実
施することができる。

【００３３】本発明のビスフェノールＡの特異的な測定
・検出法としては、特に好ましくは、後述の実施例に記
載した高感度ＥＬＩＳＡを例示することができる。

【００３４】ここで本発明抗体は、常法に従い、固相化
抗体として利用され、前記した式［２］で表される化合
物は、酵素標識され標識抗原（例えばビスフェノールＡ
−モノグルタリル−ＨＲＰ）として利用される。また、
ビスフェノールＡは標準物質として利用されるが、これ
は水不溶性であり、またビスフェノールＡ可溶性のジメ
チルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒は測定系
で採用されるプレートからのビスフェノールＡ溶離を起
こすことから、配慮が必要である。この高感度ＥＬＩＳ
Ａでは、ビスフェノールＡをビスフェノールＡ可溶性の
有機溶媒に溶解後、これを緩衝液にて希釈することによ
り所望の標準液を収得することでかかる問題をよく解決
している。

【００３５】かかるＥＬＩＳＡによれば、後述の標準曲
線から明らかなように、約０．５〜１００ｎｇ／ｍｌの
ビスフェノ−ルＡを測定範囲とし、例えばヒト尿及び血
漿中の同測定が可能な高感度測定系を提供するものであ
る。

【００３６】尚、上記ビスフェノ−ルＡの測定・検出を
行うに際しては、本発明抗体を有効成分として含有する
測定キットを利用するのが簡便である。かかるキットに
は、本発明抗体に加えて、当該測定・検出を実施するに
際して必要な任意の他の試薬を更に包含させることがで
きる。その例としては、例えば上記した標識抗原及び／
又は標準抗原液、更にはアッセイ緩衝液等を例示するこ
とができる。

【００３７】本発明抗体を利用する上記ビスフェノ−ル
Ａの測定・検出系は、被検物質としてのヒト及び動物中
の、即ちヒト及び動物の組織、血液、尿、骨髄液、唾液
等の中の、ビスフェノールＡの測定乃至検出に有効な手
段を与えるものであり、外因性物質の生体刺激−分泌機
構への影響の解明・研究に役立つものである。

【００３８】また、上記の他、河川、海水、廃水、大
気、土壌等を被検物質として、之等環境中のビスフェノ
ールＡの測定乃至検出にも有用である。

【００３９】

【実施例】以下、実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。しかし、これらの実施例は非制限的なもので
あり、本発明の範囲はそれらの例によって限定解釈され
るべきものではない。 実施例１ ビスフェノールＡのアシル化 ビスフェノールＡ（1 mmol；東京化成）をジクロロメタ
ン（10 mL）に溶解し、無水グルタル酸（1.2 mmol；東
京化成）及び４−ジメチルアミノピリジン（1.2 mmol；
Aldrich, USA）を加えて室温で５時間攪拌したのち、ジ
クロロメタンを留去した。

【００４０】残留物をアセトニトリル（5mL）に溶解
し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムは、「YMC Pa
ck D-ODS-5」（2.0ｘ25 cm; YMC Kyoto）を用い、直線
濃度勾配（0.01N HCl/CH3CN: 60/40−30/70, v/v)にて
３０分間で溶出した（流速7.0 mL/分）。溶出物は２１
０ｎｍの吸光度で検出した。

【００４１】精製したモノグルタリル化ビスフェノール
Ａ（前記式［２］中、ｎが３のもの）は、分析用ＨＰＬ
Ｃ（YMC Pack D-ODS-5（2.0ｘ25ｃｍ））を用い、上述
と同様の溶出条件で１４．５分に単一ピークとして溶出
された。さらにＦＡＢ−ＭＡＳＳ（質量３４２）により
その純度を証明した。収率は７８％であった。 実施例２ 抗血清の取得 実施例１で得たモノグルタリル化ビスフェノールＡ（9.
8 mg）をイソプロパノール（0.4 mL）に溶解し、０．１
Ｍ ＰＢＳ（pH 6.0）緩衝液に溶解したキーホール・リ
ンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ：0.4 mL; Pierce)と
混合し、水溶性カルボジイミド（180 mg; ペプチド研）
を添加して室温で３０分間反応させた。

【００４２】反応液はゲルろ過により脱塩し、得られた
ビスフェノールＡ−モノグルタレート−ＫＬＨ複合体を
以下の免疫原として用いた。

【００４３】上記免疫原（2 mg）を５０％ポリビニルピ
ロリドン（1 mL; Merck）と混合し、さらに等量のフロ
イントの完全アジュバント（3 mL; Calbiochem）を加え
乳化させた。

【００４４】得られた乳化物を家兎１０匹（日本ホワイ
ト・オス、体重：2.1〜2.5 kg）に１匹あたり免疫原１
ｍｇを皮内に注射免疫した。２回目以降は一匹あたり約
０．５ｍｇの免疫原を２週間間隔で６回免疫した。最終
免疫１週間後常法に従い、充分な力価の抗血清を産生し
た家兎の血液を全採血し、続いてこれを３７℃にて１時
間、その後４℃にて一夜放置し、３０００r.p.mで遠心
分離することにより血清を得、これを凍結乾燥した。

【００４５】上記において、それぞれの家兎に産生した
抗血清について、その力価及び各種ビスフェノールＡ関
連物質との交差反応性を検討した。その結果、１０匹の
家兎より得られた抗血清のうち、３匹から得られたそれ
らは、前記した本発明抗体に特徴的な反応性、即ちビス
フェノールＡに特異的な反応性を示し、ビス（４−ヒド
ロキシフェニル）メタン、ビス（４−ヒドロキシフェニ
ル）エタン、フェノール及び３，４−ビス（４−ヒドロ
キシフェニル）−３−ヘキセンとは実質的に交差反応し
ないことで特徴付けられる反応性、を有することが確認
された。本法によれば、効率よく、選択的に本発明抗体
を取得することができる。 実施例３ 抗血清の取得 ２ｍｇのビスフェノールＡをイソプロパノール０．４ｍ
Ｌに溶解し、０．１ＭＰＢＳ（pH 6.0）緩衝液に溶解し
たＫＬＨ（Pierce）２ｍｇを加え、続いて炭素末２ｍｇ
及びフロイントの完全アジュバント１．５ｍLを加えて
ホモディナイザーにより氷冷下にて３０分間攪拌した。

【００４６】得られた乳化物の１．５ｍLを家兎（体
重： 2.0〜2.2ｋｇ）に皮内注射した。追加免疫を最初
の注射量の１／２の投与量にて２週間毎に繰り返えすこ
とにより行った。その後、実施例２と同様に特異抗体の
選択法（交差反応性）により個体選択を行い、本発明抗
体を産生する所望の個体を選択した。

【００４７】該家兎の血液を常法に従い、全採血し、続
いてこれを３７℃にて１時間、その後４℃にて一夜放置
し、しかる後３０００r.p.mで遠心分離することにより
血清を得、これを凍結乾燥した。 実施例４ ＩｇＹの取得 白色雌ニワトリ（22-24週令）を通常の日内変動のも
と、餌及び水を自由に与え飼育する。前記で得たビスフ
ェノールＡ−モノグルタレート−ＫＬＨ複合体を免疫原
として用いる。

【００４８】免疫原２．０ｍｇを０．０１Ｍ燐酸緩衝液
（pH 7.2）０．５ｍＬに溶解し、続いて添加された等量
のフロイントの完全アジュバントとともに混和する。得
られた乳化物をニワトリの腹部皮下の数カ所に注射免疫
する。追加免疫として、初回免疫の投与量の半量を２〜
３週毎に注射する。そして、免疫の開始日より３週間後
の日より該ニワトリが産卵した鶏卵を毎日集め、産卵の
日付けを各卵に記入し、そして記入された卵を４℃にて
保存する。

【００４９】保存された卵の卵黄を分離し水洗し、卵黄
の皮膜を取り除き残りの懸濁液２００ｍLに０．１Ｍ
ＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（緩衝
液Ａ）を加え３００ｍＬとする。これに等量の７％（w/
v）ポリエチレングリコール（PEG）６０００溶液（緩衝
液Ａに溶解されている）を加える。得られた混合物を４
℃にて１０分間遠心分離（14、000ｘｇ）すると、沈殿
物が分離する。上澄みを綿布にて濾過し、次いで、固形
のＰＥＧを濃度１２％（w/v）になるように加え攪拌す
る。その後、総てのＰＥＧが溶解したとき、それを用い
５分間遠心分離（14、000ｘｇ）する。

【００５０】得られるＩｇＹを含む沈殿物を２００ｍL
の緩衝液Ａに懸濁させ、これに等量の２４％(w/v)ＰＥ
Ｇ溶液（緩衝液Ａに溶解されている）を加え、次いで、
得られた混合物を同様に遠心分離して、沈殿物を再度生
じさせる。最後に、得られた沈殿物を１００ｍLの緩衝
液Ａに懸濁させ、そして、これを同じ緩衝液に対して透
析を行い、その後遠心分離することにより、粗製ＩｇＹ
を得る。

【００５１】粗製ＩｇＹについて、その力価及び特異抗
体の選択を、実施例２と同様にして行って目的抗体を得
る。

【００５２】上記で得られた粗製ＩｇＹは、常法に従
い、例えば、アニオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡ
Ｅセルロース）、カチオン交換クロマトグラフィー（Ｃ
Ｍセルロース）及び又はアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製することができる。 実施例５ モノクローナル抗体の取得 前記で得た免疫原をマウス（BALB/C）に腹腔内投与し、
投与されたマウスの抗体価を調べ、その中で、抗体力価
が最も高いマウスを選び、それを次の細胞融合に使用す
る。 （細胞融合）無菌化において、選ばれたマウスの体内よ
り脾臓を取り出し、これより抗体産生細胞としてのリン
パ球をミエローマ（骨髄腫）細胞と混合し、次いで細胞
融合促進剤として４５％ポリエチレングリコール（PE
G）を添加することにより、それら細胞を融合させる。
この際の培地としては、ＲＰＭＩ１６４０（gibco）が
使用される。促進物質としては、リゾレシチン、グリセ
ロールオレイン酸エステルなどをも利用することができ
る。 （スクリーニング及びクローニング）融合された細胞は
ＨＡＴ選択培地において培養され、そして、培養された
細胞をＥＬＩＳＡ法に従ってスクリーニングすることに
より、所望の反応性を示す特異抗体を産生する抗体産生
ハイブリドーマを選び出し、続いて、これのクローニン
グを限界希釈法に従い行う。クローンがある程度増殖し
てきた段階で再び同様のスクリーニングを行い、そし
て、本発明所望の特異性を有する単一クローンが得られ
るまでスクリーニングとクローニングを同様に繰り返
す。 （腹水の作成）上記のスクリーニングにより得られた単
一クローン（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ）
を大量に培養増殖し、そしてそれを、予めプリスタンさ
れたヌードマウス（BALB/C）に腹腔内投与し、その後、
投与されたマウスより、生成した腹水を採取する。 （モノクローナル抗体の精製）得られた腹水中のモノク
ローナル抗体を、プロテインＡ（Bio-Rad）アフィニテ
ィークロマトグラフィーにより精製する。その際、免疫
グロブリンの含有量は２８０ｎｍの吸収にて算出でき
る。 実施例６ 酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ） （標識抗原の作製）モノグルタリル化ビスフェノールＡ
３４．９ｍｇ（102.1μmol）を１ｍＬのアセトニトリル
で溶解した溶液、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hy
droxysuccinimide）１２．９ｍｇ（112.2μmol）をジオ
キサンで溶解した溶液、水溶性カルボジイミド１９ｍｇ
（122.4μmol）を１ｍLの蒸留水で溶解した溶液、及び
ＨＲＰ酵素（horseradish peroxidase；ベーリンガーマ
ンハイム）１００ｍｇ／バイアルを１ｍLの蒸留水で溶
解した溶液をそれぞれ調製した。

【００５３】上記モノグルタリル化ビスフェノールＡ溶
液（100μL；10.2μmol）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド溶液（100μL；11.2μmol）、水溶性カルボジイミ
ド（100μL；12.2μmol）を混合したのち、ＨＲＰ溶液
（400μL；1.02μmol）を添加し、室温で２時間３０分
反応させた。

【００５４】反応終了後、１００％エタノールを最終濃
度７０％になるまで、序々に添加すると沈殿物が生成す
る。ついで、室温で遠心分離（30分間3000r.p.m）した
後、上静を除き、沈査に０．１Ｍ ＰＢＳ（pH 6.0）緩
衝液１ｍＬを加えてこれを標識抗原とした。 （抗体固定化プレートの作成）９６ウエルのマイクロタ
イタープレート（Maxi Sorp Nunc）の各ウエルに０．１
Ｍクエン酸緩衝液で２００倍に希釈したヤギ抗ウサギＩ
ｇＧ血清（Jackson ImmunoResearch）をそれぞれ１００
μＬづつ分注した。２５℃で２時間静置後、上清を捨
て、次にブロックエース（大日本製薬）を各ウエルに３
４０μＬ分注して、２５℃２時間静置した。洗浄液（0.
1％TWEEN20を含む0.15M ＮaCl）で５回洗浄後、ＰＢＳ
緩衝液（0.1％BSA,0.1％Tween20含有）で４０００倍に
希釈した抗ビスフェノールＡ抗体（前記実施例２で得た
抗体）を各ウエル１００μＬづつ分注し、４℃で２４時
間静置し、抗ビスフェノールＡ抗体が固定化された抗体
固定化プレートを得た。 （標準液の調製）ビスフェノールＡの１２ｍｇを、１
５．７％ＤＭＳＯにて溶解し（857μg/mL）、これをＰ
ＢＳ緩衝液にて１０倍に希釈して、濃度８５．７μｇ／
ｍＬの標準液とした。さらにこの溶液について５倍希釈
の操作を行い、８５．７／１７．１／３．４／０．６９
／０．１３７／０．０２７／０．００５μｇ／ｍＬの標
準液をそれぞれ調製した。 （ＨＲＰ標識抗原の調製）上記で作成した標識抗原溶液
をＰＢＳ緩衝液で２０００倍に希釈して調製した。

【００５５】尚、発色剤には０．０１５％過酸化水素を
含む０．１Ｍリン酸ナトリウム-クエン酸緩衝液（pH 5.
0）１０ｍＬにＯＰＤ錠（10 mg；Sigma社）を溶解し最
終濃度１ｍｇ／ｍＬになるよう使用時に調整した。反応
停止液は２Ｎ硫酸を用いた。 （測定）上記の抗ビスフェノールＡポリクローナル抗体
を固定化したプレートの各ウエルの液体を除き、そし
て、上記の洗浄液を用いて５回洗浄した。次に、各ウエ
ルに各段階希釈の標準品５０μＬ、または測定すべき検
体５０μＬを加えた。さらに上記のＨＲＰ標識抗原溶液
５０μＬを添加した。その後、マイクロタイタープレー
トを密封し、これを室温にて２時間反応させた。その
後、各ウエルの液を流し除き、そして、上記の洗浄液を
用いて、同様の洗浄操作を５回繰り返した。しかる後、
各ウエルに上記で調整した発色液を各ウエルに１００μ
Ｌを注入し、室温で１５分間反応させた。その後、各ウ
エルに酵素反応停止液として２Ｎ硫酸１００μＬを加え
た。次いで、マイクロタイタープレート用吸光度計を用
いて、波長４９０ｎｍにて各ウエル内の液の吸光度をそ
れぞれ測定した。

【００５６】ビスフェノールＡ標準液について、濃度が
異なる７箇所について吸光度をそれぞれ測定（duplicat
e）し、その測定値から検量線を作成した（図１参
照）、この検量線に基づいてそれぞれの検体中のビスフ
ェノールＡ濃度を測定した。

【００５７】上記ビスフェノールＡの酵素イムノアッセ
イ系におけるビスフェノールＡ及びその関連物質との交
差反応性を求めた結果は、下記表１に示す通りである。

【００５８】

【表１】

【００５９】表１より次のことが明らかである。即ち、
上記イムノアッセイにおいて、本発明抗体は、ビスフェ
ノールＡとの間で明らかな交差反応を発現した。また、
関連物質の交差反応性の検討から、本発明抗体は、ビス
フェノールＢ［２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニ
ル）ブタン］とは約５０％の交差反応を示し、ビス（４
−ヒドロキシフェニル）メタン、ビス（４−ヒドロキシ
フェニル）エタン及びフェノール等の関連物質とは実質
的に交差反応を示さないことが確認された。

【００６０】また、上記同様の試験にて、本発明抗体
は、３，４−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−３−ヘ
キセン、カテキン、タンニン酸及び没食子酸(gallic ac
id)のいずれとも実質的に交差反応性を示さないことが
確認されている（０．１％以下）。

【００６１】上記の交差反応性（％）は、常法に従い、
Ｂ／Ｂ₀が５０％を示す抗原濃度（モル濃度）を、ビス
フェノールＡの当該濃度（１００％）に対比したもので
あり、従って、交差反応性２０％とは、抗体との結合が
５０％である条件下、標準品（ビスフェノールＡ）のそ
れに対して、２０％の反応性であることを意味する。 実施例７ 缶飲料水取得後の健常人尿を検体（被検物質）として、
実施例６の方法に従い、尿中ビスフェノールＡを測定し
た。

【００６２】測定は、尿検体をそのまま測定系の検体と
して使用（ダイレクトアッセイ）して、また、固相カラ
ム（ＨＢＬカラム、Waters社）を利用して、ビスフェノ
ールＡを抽出処理した検体を使用（抽出アッセイ）し
て、それぞれ行った。

【００６３】結果を下記表２に示す。

【００６４】

【表２】

【００６５】表２より、本発明抗体を使用した測定系に
よれば、ヒト血中等のビスフェノールＡや、ヒト尿中、
環境中のビスフェノールＡの免疫活性の測定を確実に行
うことができることが明らかとなった。

【００６６】

【発明の効果】本発明によりビスフェノールＡに特異的
な反応性を示す特異抗体が提供される。また、当該抗体
を利用した本発明の測定・検出方法によれば、ビスフェ
ノールＡの高感度の測定、検出を簡便に実施することが
できる。

【００６７】従って、本発明によれば、ヒトの組織中、
血液中、尿中などに含まれるビスフェノールＡを有効に
測定、検出することができ、また、例えば河川、廃水、
大気、土壌中等の環境中に存在する微量ビスフェノール
Ａを少量の検体で容易に測定、検出することができ、環
境撹乱物質のひとつであるビスフェノールＡの分布、吸
収、分解等の研究にも役立つという利点を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ビスフェノールＡの酵素イムノアッセイ系にお
ける標準曲線を示すグラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）
   プロパンに特異的な反応性を有し、ビス（４−ヒドロキ
   シフェニル）メタン、ビス（４−ヒドロキシフェニル）
   エタン、フェノール及び３，４−ビス（４−ヒドロキシ
   フェニル）−３−ヘキセンとは実質的に交差反応しない
   ことを特徴とする抗体。
2. 【請求項２】２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）
   プロパン又はそのキャリア蛋白結合体を高分子吸着体に
   吸着させてなる免疫抗原を、ヒトを除く温血動物に免疫
   して得られる請求項１記載の抗体。
3. 【請求項３】ウサギ抗血清である請求項２記載の抗体。
4. 【請求項４】モノクローナル抗体である請求項２記載の
   抗体。
5. 【請求項５】請求項１に記載の抗体を使用して、イムノ
   アッセイを行うことを特徴とする、被検物質中のビスフ
   ェノールＡを特異的に測定・検出する方法。