JP4663831B2 - モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体、抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体産生細胞株および該抗体を用いるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ポリアミンは、プトレッシン（Ｐｕｔ）、カダベリン（Ｃａｄ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、スペルミン（Ｓｐｍ）及びそれら誘導体等の総称で、生体内に広く分布する生理活性物質である。癌細胞を含む増殖の盛んな細胞でかなりの量が合成され、これらの細胞に局在し、細胞の増殖を促進する因子として作用することから注目されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３ ｐ７４９−７９０（１９８４））。
【０００３】
１９７１年、Ｒｕｓｓｅｌｌ等は、癌患者の尿中にポリアミンが増加することを見出し（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３１ ｐ１５５５（１９７１））、尿中ポリアミンは、現在、腫瘍マーカーとして用いられている。しかしながら、これまでの「ポリアミン全体」を測定することの意義に対して、限界も見えてきた（Ｐｒｏｇ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．３９ ｐ９−３３（１９９２））。
【０００４】
ポリアミンは、そのまま遊離型として存在する他、アセチル化されたり、結合型としても存在している。Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｎｅｍ等は、尿中に排泄されるポリアミンは、主としてモノアセチル体のＮ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、アセチルプトレッシン（Ａｃ−Ｐｕｔ）、Ｎ8−アセチルスペルミジン（Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ）として存在しており、これら成分の増加や成分比の変動がさらによい腫瘍マーカーとなることを報告している（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６７ ｐ１６７１−１６７３（１９７８），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２ ｐ２０９７−２０９８（１９８２））が、これには異論もある（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８ ｐ１２１１−１２１５（１９９５））。
【０００５】
最近、平松等は、尿中にポリアミンのジアセチル体のＮ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）が存在することを見出し（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ ｐ１０７−１１２（１９９５））、これらが、泌尿器系の腫瘍で著しく増加し、従来のポリアミンやポリアミンのモノアセチル体の変動を凌いでいたことから、新しい腫瘍マーカーとして期待されている（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１ ｐ３１７−３１９（１９９５））。
【０００６】
従来、これらジアセチル体のＮ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定は、キャピラリー・ガスクロマトグラフィ法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３２ ｐ１９３０−１９３７（１９８６））や液体クロマトグラフィ法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ ｐ１０７−１１２（１９９５））で行われてきた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ジアセチル体のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍを測定するキャピラリー・ガスクロマトグラフィ法や液体クロマトグラフィ法では、煩雑な検体の前処理操作や、装置のメンテナンス技術を必要とするなど、かなりの熟練が要求される。また、煩雑さのため、測定には時間がかかり、臨床的な測定法としては、とても受け入れられるものではない。
そこで、臨床的に使用し得る簡便な測定法の開発を目指し、抗体を用いる免疫的な測定法が検討された。藤原等は、Ｓｐｍのアルブミン複合体を免疫してＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに反応するモノクローナル抗体を作成したが、モノアセチル体のＮ1−Ａｃ−ＳｐｄとＮ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）とも強く反応し、結果的には、これら３成分の中で最も尿中での存在量の多い、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄを反映する測定法しかできなかった（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８ ｐ１２１１−１２１５（１９９５））。従って、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍを測定できる免疫測定法は、今だに完成していない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記したような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍのアルブミン複合体で免疫し、実質的に尿中Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定に使用し得るモノクローナル抗体を作成し、その抗体を用いる測定法を見いだして本発明に至ったものである。
【０００９】
即ち、本発明は、
（１）固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）と抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体の免疫反応を利用した検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測定系を組んだ場合に、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンによる該免疫反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）による該免疫反応の阻害活性の２０倍以上、好ましくは３０倍以上、より好ましくは４０倍以上となる測定条件を選択することが可能になる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体、
（２）固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミンとの免疫反応が５０％阻害されるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの濃度が２０μＭ以下、好ましくは１５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下となる測定条件を選択することが可能になる上記（１）記載のモノクローナル抗体、
（３）検体が尿検体である上記（１）又は（２）記載のモノクローナル抗体、
（４）モノクローナル抗体０５２０，４９１４又は８６２４、
（５）上記（１）、（２）、（３）又は（４）記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株、
（６）固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミンと抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体の免疫反応を利用して検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンを測定する際に、その測定条件におけるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンによる該免疫反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペルミジンによる該免疫反応の阻害活性の２０倍以上、好ましくは３０倍以上、より好ましくは４０倍以上となる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測定法、
（７）抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体が、測定条件において固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミンとの免疫反応が５０％阻害するＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの濃度が２０μＭ以下、好ましくは１５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下となる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体である上記（６）記載の測定法、
（８）抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体がモノクローナル抗体０５２０，４９１４又は８６２４である上記（７）記載の測定法、
（９）検体が尿検体である上記（６）、（７）又は（８）記載の測定法、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
固相化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍを、スペーサーを介して、不溶性物質の表面上に繋ぎ止めたものが挙げられる。
スペーサーの結合位置は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの場合はその末端であってもその両末端の間のいずれの位置であってもよいが、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの場合はその末端アミノ基に結合させるのが望ましい。スペーサーの種類と導入方法については多くの方法が知られているが、これらのいずれであっても良い。例えば、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍのいずれかの位置に、末端に反応基を有するスペーサーを導入し（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍのアセチル基からスペーサーを誘導する場合は、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍのＮ12−アミノ基に導入したアシル基がスペーサーとなる）、この反応基を介して蛋白質や合成高分子などに結合し、生成したＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍと蛋白質や合成高分子の複合体を、免疫反応の場となる固相担体上に吸着させる方法、予め化学的に活性化されたスペーサーを持つ固相担体上に、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍそのもの、もしくは、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの末端アミノ基を反応させる方法などがあるが、これらに限定されるものではない。Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍのいずれの位置に、どのようなスペーサーを導入するかは、用いる抗体の性質によって適宜選択すればよい。
【００１１】
スペーサーとしては、例えばグルタルアルデヒド（ＧＡ）を用いた場合はホルミルブチリル鎖が、Ｎ−（４−マレイミドブチルオキシ）コハク酸イミド（ＧＭＢＳ）を用いた場合はマレイミドブチリル鎖が、無水コハク酸を用いた場合は、カルボキシプロピオニル鎖等が挙げられるが、公知のものはいずれも使用できる。
又、蛋白質や合成高分子としては、例えば、アルブミンやポリリジン等が挙げられるが、これらに限定されるものでなはい。固相担体としては、例えば、９６穴等のマイクロタイタープレート、ポリスチレンビーズ、各種ラテックス粒子、ニトロセルロース膜等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
また、標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、放射性同位元素を導入してＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍそのものを標識したり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍに、放射性元素の入った化合物、ユーロピウム等の遅延蛍光性のある元素を保持できる化合物、ルテニウム等の電気化学発光の触媒となる元素を保持できる化合物、蛍光物質等を結合させて標識したり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍに、前記のようなスペーサーを介して酵素標識したり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍをビオチンで標識し、免疫反応後にアビジンの酵素標識体と反応させ、ビオチン−アビジン複合体として間接的に検出できるようにしたもの等が挙げられる。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、クローン化されたイムノグロブリン抗体であれば何であってもよく、抗体の由来する動物種、イムノグロブリンのタイプやサブタイプ、抗体の産生方法は問わない。また、抗体を断片化して免疫反応部位を残したもの、それら断片の修飾物、抗体そのものの修飾物、２種類の抗体を結合させたキメラ抗体等も包含する。本発明のモノクローナル抗体は、抗体産生株の組織培養法や、抗体のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡを用いて、遺伝子工学を用いる製造法等によって製造することができる。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体を産生する抗体産生株は、公知の方法に準じた方法、即ち、マウス、ラット等の動物を免疫原で免疫し、次いで免疫した動物のＢ細胞とミエローマ細胞を融合し、得られたハイブリドーマの中から本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株を選択することにより得ることができる。
【００１５】
免疫原には、ハプテン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）とキャリア物質（蛋白質又は合成高分子）の複合体が使用でき、これは、固相化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの作成法で述べた方法と同様にして製造することができる。
本発明のモノクローナル抗体としては、例えばモノクローナル抗体０５２０，４９１４及び８６２４が挙げられ、これらはそれぞれＡＣＳＰＭ−１（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２９７）、ＡＣＳＰＭ−２（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２９８）及びＡＣＳＰＭ−３（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭＰ−１６２９９）と名付けられた細胞株を培養することにより得ることができる。
【００１６】
本発明の測定法は、ハプテンの免疫測定法として知らている方法のいずれの方法によっても行なうことができ、特に制限されない。例えば、結合阻害法の場合、例えば、実験例２のように、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍによる抗体と固相化ハプテンとの免疫反応の阻害を、固相化ハプテンに結合した抗体量の減少として、色々な手段で検出する方法、固相担体としてラテックスを用いる例としては、ハプテンを固相化したラテックス試薬の抗体による凝集反応をＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍによる阻害として検出する方法、逆に、抗体を固相化したラテックス試薬を用い、多エピトープ化したポリハプテンの添加によるラテックス凝集反応を、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍによって阻害させる方法等がある。また、競合法の場合、固相化した抗体に対して、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍと標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとを競合反応させ、ＢＦ分離後に、固相化した抗体に結合した標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの標識を、それぞれの方法で適宜に検出すればよい。
【００１７】
本発明の測定法を実施する測定条件は特に限定されないが、従来知られている免疫反応を利用した測定条件が使用できる。例えば、検体と試薬（固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若しくは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ及び抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクローナル抗体）を混合して行なう免疫反応は通常０〜４５℃、好ましくは１０〜４０℃で行なう。本発明の測定を実施するにあたり、抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクローナル抗体は必要により固相化又は標識化して使用する。
【００１８】
本発明の測定法を実施するにあたり、固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若しくは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクロナール抗体を作成する際に用いた免疫原を作成する際に使用したスペーサーの種類、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ若しくはＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍへの結合位置又は化学結合方法のひとつ以上を変えて作成したものが望ましい。
【００１９】
なお、本発明において、固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若しくは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍと抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクローナル抗体との免疫反応が５０％阻害されるＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度は、測定条件下で両者を反応させて得られるシグナルを半減させるＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度を求めることにより得ることができ、これは、反応系の検出感度の尺度となり得る。
【００２０】
本発明において、検体としては尿、血清、血漿等各種のものが使用できるが、特に尿が好ましい。
【００２１】
【実施例】
以下に、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
実験例１ 抗体のスクリーニング法
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Immunoplate ＩＩ) の各ウェルに、抗原としてＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）１５μｇ／ｍＬを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μＬを入れ、４０℃で２０分間放置してコーティングした。次に、コーティング液を捨てて０．１％のツウィーン２０を含む１０ｍＭリン酸で緩衝化された生食液（ＰＢＳＴ）で洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス・塩酸で緩衝化された生食液（ｐＨ７．３）２００μＬでブロッキング処理した。
ブロッキング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、各ウェルにハイブリドーマの培養上清６０μＬと、ＢＳＡ２０ｍｇ／ｍＬを含む１０ｍＭリン酸で緩衝化された生食液２０μＬを加え、４℃で一晩反応させた。ウェルを、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識−ヤギ抗マウスＩｇＧ溶液（カッペル社）５０μＬを加え、３７℃、４０分間反応させた。
結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に９分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments 社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。
【００２３】
実験例２ ＥＬＩＳＡ結合阻害法
[Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）の調製]
６．５ｍｇのＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬに、０．０８３Ｍグルタルアルデヒド溶液１ｍＬを加えて攪拌し、３０秒間放置した。さらに、１０．５ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて攪拌し、室温で３０分間反応させた。さらに、この反応液に水素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを加えて室温下に１０分間反応させた後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液３００ｍＬで、４回液を交換しながら、３時間４５分透析した。
［Ｎ1−アセチルスペルミジンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ）の調製］
３ｍｇのＮ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬに、０．０２１Ｍグルタルアルデヒド溶液１ｍＬを加えて攪拌し、３０秒間放置した。さらに、６ｍｇのＨＳＡを含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて攪拌し、室温で３０分間反応させた。さらに、この反応液に水素化ホウ素ナトリウム２．５ｍｇを加えて室温下に１０分間反応させた後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液３００ｍＬで、４回液を交換しながら、３時間透析した。
【００２４】
［測定法］
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Immunoplate ＩＩ）の各ウェルに、抗原としてＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）、Ｎ1−アセチルスペルミジンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ）、又は、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）を１５μｇ／ｍＬ含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μＬを入れ、４０℃で２０分間放置してコーティングした。次に、コーティング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）２００μＬでブロッキング処理した。
ブロッキング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、各ウェルに、ハイブリドーマ３株のそれぞれの培養上清をＰＢＳＴで１００倍希釈した液５０μＬと、測定対象物のスペルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）等を、ＰＢＳＴで各種濃度に希釈した液５０μＬを加え、３７℃で１．５時間反応させた。ウェルを、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識−ヤギ抗マウスＩｇＧ溶液５０μＬを加え、３７℃、４０分間反応させた。
結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に５分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments 社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。
【００２５】
実施例１ Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンに対するモノクローナル抗体の作成［Ｎ1−アセチルスペルミンのＢＳＡ複合体（抗原）の調製］
５０ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＡＭＳ）を含むテトラヒドロフラン溶液１ｍＬを、２００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬに加えて攪拌し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に保ちながら、室温下に１時間反応させた。この反応液を、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で膨潤化したセファデックスＧ−７５のカラム（２ｃｍ×１００ｃｍ）にかけ、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。誘導体化されたＢＳＡ画分を集めて凍結乾燥し、ＡＭＳ化されたＢＳＡ（ＡＭＳ−ＢＳＡ）１８０ｍｇを得た。ＢＳＡへのＳＨ基の導入数は１７±０．５であった。
次に、１０．４ｍｇのＮ1−アセチルスペルミン・３塩酸塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１ｍＬに、１ｍｇのＮ−(４−マレイミドブチルオキシ)コハク酸イミド（ＧＭＢＳ）を含むテトラヒドロフラン溶液０．５ｍＬを加え、ｐＨを７付近に保ちながら、室温で１００分間反応させ、ＧＭＢＳ化Ｎ1−アセチルスペルミン溶液を調製した。
【００２６】
一方、１７．３ｍｇのＡＭＳ−ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）０．２ｍＬに、０．５Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ７．０）５０μＬを加えて室温下に１０分間放置後、さらに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）２ｍＬを加えた。この溶液と、先に調製したＧＭＢＳ化Ｎ1−アセチルスペルミン溶液を混合してボルテックスミキサー攪拌後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ−１００のカラム（２．２ｃｍ×４３ｃｍ）にかけ、同緩衝液で溶出した。２８０ｎｍにおける蛋白質吸収画分を集め、Ｎ1−アセチルスペルミンのＢＳＡ複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ）を得た。
また、同様の方法で、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対応するＮ1−アセチルスペルミンのＨＳＡ複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）も調製した。
【００２７】
［免疫]
雌性ＢＡＬＢ/cマウスに、コンプリート・フロイント・アジュバントで乳化したＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ抗原１００μｇを腹腔内投与した。さらに、１００μｇのＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ抗原を１０ｍＭリン酸で緩衝化された生食液（ＰＢＳ）で希釈したもので、２週間毎に、４回追加免疫を行った。
［細胞融合]
５回目の最終感作を行ってから４日後に、マウスの脾細胞を取り出し、これとミエローマ細胞Ｐ３／ＮＳ−１／１Ａｇ４−１とを、４０％ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガー社）存在下に、Ｓｈｕｌｍａｎらの方法に従って細胞融合した。次いで、融合細胞は、９６穴培養プレート（コーニング社）を用いて、ウェル当たり１０5 個の細胞密度で、ＨＡＴ培地中で培養した。細胞融合後１０〜２０日目に、９６０ウェル中７０８ウェル（７４％）に、細胞の増殖が認められた。
【００２８】
［細胞の選択]
各ウェルの培養上清中の抗体価を、実験例１の「抗体のスクリーニング法」で検索し、免疫反応陽性の細胞３個を得た。これらを限界希釈法でクローン化し、継続的に抗体を産生する細胞、ＡＣＳＰＭ−１、ＡＣＳＰＭ−２、ＡＣＳＰＭ−３の３株を樹立した。さらに、これら３株の抗原部位への反応性を確認するため、抗原作成時に副生する可能性のあるＧＭＢＡ−ＨＳＡ（ＡＭＳ−ＨＳＡにスペーサーのＧＭＢＡを導入したもの）も調製し、実験例１の抗原Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡの代わりに、ＧＭＢＡ−ＨＳＡ、ＡＭＳ−ＨＳＡ（ＨＳＡにＳＨ基を導入したもの）やキャリア蛋白そのもののＨＳＡをコーティングしたプレートも調製し、倍々希釈したＡＣＳＰＭ−１株、ＡＣＳＰＭ−２株、ＡＣＳＰＭ−３株の培養上清との反応性を確認した。結果を、それぞれ図１〜図３に示した。いずれの培養上清も、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡにのみ反応し、ＧＭＢＡ−ＨＳＡ、ＡＭＳ−ＨＳＡやＨＳＡとは、全く反応しなかった。
［クローン細胞のサブタイプ］
各クローン細胞が産生する免疫グロブリンのサブタイプは、マウスモノクローナルSub-isotyping キット（Zymed 社コードＮｏ．９７−６５５０）を用いて決定した。その結果、０５２０抗体（ＡＣＳＰＭ−１株）と４９１４抗体（ＡＣＳＰＭ−２株）はＩｇＧ1、８６２４抗体（ＡＣＳＰＭ−３株）がＩｇＧ2bであった。
【００２９】
実施例２ モノクローナル抗体の特異性
作成したモノクローナル抗体の特異性は、抗体の固相化抗原への結合を、測定対象物質がどの程度阻害するかを検出する系、「ＥＬＩＳＡ結合阻害法」で評価した。即ち、実験例２の方法に従い、３つの抗原、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを、それぞれ固相化したプレートを用いて、各濃度のポリアミン類が、抗体と固相化抗原との反応を、どの程度阻害するかを評価した。免疫原に相当するＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡを固相化した系では、検討したポリアミン類の何れによっても全く阻害されず、測定系としては不適切であった。一方、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ、又は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを固相化した系では、検討した各成分、Ｓｐｍ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍによって、図４〜９に示した結合阻害曲線（検量線）が得られた。０５２０、４９１４、８６２４のいずれの抗体も、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに強く、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄと極めて弱く反応（阻害）し、Ｓｐｍとは全く反応（阻害）しなかった。図から、これらの抗体を用いてポリアミン類を測定した場合の測定感度を５０％結合阻害濃度（ＥＣ50値）として求め、結果を表１に示した。
【００３０】
なお、図４はＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性を、図５は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性を、図６は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性を、図７は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性を、図８は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性を、図９は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性を示したものである。
【００３１】
０５２０、４９１４、８６２４のいずれの抗体も、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとＮ1，Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに特異的であった。平松ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ｐ１０７−１１２（１９９５））やＧ．Ａ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３２（１０） ｐ１９３０−１９３７（１９８６））によると、尿中のＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ濃度は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍより著しく低いことから、この測定法で、実質的に尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ濃度を反映する測定値を得ることができる。
【００３２】
【表１】
【００３３】
実施例３
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Immunoplate）の各ｗｅｌｌに抗原としてＮ1，Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを１６．１μｇ／ｍＬ含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１５０μＬを入れ、４０℃で３０分間放置してコーティングした。次にＰＢＳＴ３００μＬで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）３００μｌでブロッキング処理した。ＰＢＳＴで洗浄後、各ｗｅｌｌにＡＣＳＰＭ−１の培養上清をＰＢＳＴで２５倍希釈した液５０μＬと、測定対象物のＰｕｔ（プトレッシン）、Ａｃ−Ｐｕｔ、Ｏｒｎ（オルニチン）、Ｃａｄ（カダベリン）、Ｓｐｄ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｓｐｍ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−ＳｐｍをＰＢＳＴで各種濃度に希釈した液５０μＬを加え、４℃で一晩反応させた。各ウェルをＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ビオチン（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＱＵＡＬＥＸ社）１００μＬを加え、室温で１．５時間反応し、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで３０００倍希釈したＨＲＰ−ストレプトアビジン（フナコシ社）１００μＬを加え、室温で３０分反応させた。結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ｗｅｌｌに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に６分間反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments 社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。結果を図１０に示した。図１０から明らかなようにこの反応系によれば、Ｎ1，Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに対する特異性が向上していることが判る。
【００３４】
実施例４ 最適化されたＥＬＩＳＡ結合阻害法でのモノクローナル抗体の特異性
実験例２の測定法を改良し、再度、抗体の特異性と測定感度を確認した。
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Immunoplate II)の各ウェルに、抗原としてＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）、又は、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）１５μｇ／ｍＬを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１５０μＬを入れ、４０℃で３０分間放置してコーティングした。次に、コーティング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス・塩酸で緩衝液（ｐＨ７．４）３００μＬ加え、３７℃で１時間ブロッキング処理した。
【００３５】
ブロッキング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、各ウェルに、ハイブリドーマ３株のそれぞれの培養上清液を表２に示した倍率（２００〜２０,０００倍）にＰＢＳＴで希釈した液２５μＬと、測定対象物のスペルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）をＰＢＳＴで各濃度に希釈した液７５μＬを加え、室温下に３時間反応させた。ウェルをＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液５０μＬを加え、室温下に１時間反応させた。ウェルを再びＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで３０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液５０μＬを加え、室温下に３０分間反応させた。
【００３６】
結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に５分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。
結果を表２にまとめた。測定系を改良し、抗体の希釈倍率を上げることにより、Ｎ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを固相化した系の測定感度と特異性は、大幅に向上した。即ち、Ｎ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍの測定感度は、０５２０抗体が８倍、４９１４抗体が２２倍、８６２４抗体が７０倍に向上し、５０％結合阻害濃度で比較した感度は、０．０６〜０．２μＭになった。また、特異性をＮ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍによる５０％結合阻害活性とＮ1−Ａｃ−Ｓｐｄによる５０％結合阻害活性との比として表現した場合、０５２０抗体が４８倍、４９１４抗体が１１７倍、８６２４抗体が４５倍となり、何れも改良前より向上した。
【００３７】
【表２】
【００３８】
実施例５ ４９１４モノクローナル抗体の特異性
実施例４で最も測定感度と特異性の高かった４９１４モノクローナル抗体を用い、実施例３の方法でプトレッシン（Ｐｕｔ）、アセチルプトレッシン（Ａｃ−Ｐｕｔ）、Ｌ−オルニチン（Ｏｒｎ）、カダベリン（Ｃａｄ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、Ｎ8−アセチルスペルミジン（Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、スペルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）やＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）の希釈系列を測定し、４９１４モノクローナル抗体の特異性検討した。図１１のように、この測定系は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに特異的で、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとはＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの２４％、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄとは０．８５％、Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄとは０．６％、Ｓｐｍとは０．１％、その他のポリアミン類とはほとんど反応しなかった。
【００３９】
実施例６ 健常者の尿中Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定
実施例５の方法で、健常者の尿検体１６例（男性８例、女性８例）の希釈系列を測定し、尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ濃度を求めた。測定例の一部を図１２に示した。男子及び女子８例ずつの平均値±ＳＤは、それぞれ０．３４±０．１６、０．３９±０．１４μＭ／ｇ−クレアチニンで、全体の平均値は０．３６μＭ／ｇ−クレアチニンであった。平松らの報告（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ｐ１０７−１１２（１９９５））によると、尿中におけるＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ：Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ：Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ：Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄの存在比は、３．２％：１．０％：８６．２％：９．６％であることが報告されている。この測定系の特異性からすれば、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ以外のポリアミン成分の影響は軽微と考えられ、尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍは、ほぼ正確に測定されているものと考えられる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンと反応するモノクローナル抗体は、尿等の検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンを測定することができ、癌の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＣＳＰＭ−１株培養上清液の免疫原への特異性
【図２】ＡＣＳＰＭ−２株培養上清液の免疫原への特異性
【図３】ＡＣＳＰＭ−３株培養上清液の免疫原への特異性
【図４】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
【図５】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
【図６】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性
【図７】Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
【図８】Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
【図９】Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性
【図１０】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
【図１１】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
【図１２】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの検量線及び尿検体中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体、抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体産生細胞株および該抗体を用いるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ポリアミンは、プトレッシン（Ｐｕｔ）、カダベリン（Ｃａｄ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、スペルミン（Ｓｐｍ）及びそれら誘導体等の総称で、生体内に広く分布する生理活性物質である。癌細胞を含む増殖の盛んな細胞でかなりの量が合成され、これらの細胞に局在し、細胞の増殖を促進する因子として作用することから注目されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３ ｐ７４９−７９０（１９８４））。
【０００３】
１９７１年、Ｒｕｓｓｅｌｌ等は、癌患者の尿中にポリアミンが増加することを見出し（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３１ ｐ１５５５（１９７１））、尿中ポリアミンは、現在、腫瘍マーカーとして用いられている。しかしながら、これまでの「ポリアミン全体」を測定することの意義に対して、限界も見えてきた（Ｐｒｏｇ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．３９ ｐ９−３３（１９９２））。
【０００４】
ポリアミンは、そのまま遊離型として存在する他、アセチル化されたり、結合型としても存在している。Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｎｅｍ等は、尿中に排泄されるポリアミンは、主としてモノアセチル体のＮ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、アセチルプトレッシン（Ａｃ−Ｐｕｔ）、Ｎ8−アセチルスペルミジン（Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ）として存在しており、これら成分の増加や成分比の変動がさらによい腫瘍マーカーとなることを報告している（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６７ ｐ１６７１−１６７３（１９７８），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２ ｐ２０９７−２０９８（１９８２））が、これには異論もある（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８ ｐ１２１１−１２１５（１９９５））。
【０００５】
最近、平松等は、尿中にポリアミンのジアセチル体のＮ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）が存在することを見出し（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ ｐ１０７−１１２（１９９５））、これらが、泌尿器系の腫瘍で著しく増加し、従来のポリアミンやポリアミンのモノアセチル体の変動を凌いでいたことから、新しい腫瘍マーカーとして期待されている（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１ ｐ３１７−３１９（１９９５））。
【０００６】
従来、これらジアセチル体のＮ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定は、キャピラリー・ガスクロマトグラフィ法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３２ ｐ１９３０−１９３７（１９８６））や液体クロマトグラフィ法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ ｐ１０７−１１２（１９９５））で行われてきた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ジアセチル体のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍを測定するキャピラリー・ガスクロマトグラフィ法や液体クロマトグラフィ法では、煩雑な検体の前処理操作や、装置のメンテナンス技術を必要とするなど、かなりの熟練が要求される。また、煩雑さのため、測定には時間がかかり、臨床的な測定法としては、とても受け入れられるものではない。
そこで、臨床的に使用し得る簡便な測定法の開発を目指し、抗体を用いる免疫的な測定法が検討された。藤原等は、Ｓｐｍのアルブミン複合体を免疫してＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに反応するモノクローナル抗体を作成したが、モノアセチル体のＮ1−Ａｃ−ＳｐｄとＮ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）とも強く反応し、結果的には、これら３成分の中で最も尿中での存在量の多い、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄを反映する測定法しかできなかった（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８ ｐ１２１１−１２１５（１９９５））。従って、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍを測定できる免疫測定法は、今だに完成していない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記したような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍのアルブミン複合体で免疫し、実質的に尿中Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定に使用し得るモノクローナル抗体を作成し、その抗体を用いる測定法を見いだして本発明に至ったものである。
【０００９】
即ち、本発明は、
（１）固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）と抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体の免疫反応を利用した検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測定系を組んだ場合に、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンによる該免疫反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）による該免疫反応の阻害活性の２０倍以上、好ましくは３０倍以上、より好ましくは４０倍以上となる測定条件を選択することが可能になる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体、
（２）固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミンとの免疫反応が５０％阻害されるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの濃度が２０μＭ以下、好ましくは１５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下となる測定条件を選択することが可能になる上記（１）記載のモノクローナル抗体、
（３）検体が尿検体である上記（１）又は（２）記載のモノクローナル抗体、
（４）モノクローナル抗体０５２０，４９１４又は８６２４、
（５）上記（１）、（２）、（３）又は（４）記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株、
（６）固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミンと抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体の免疫反応を利用して検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンを測定する際に、その測定条件におけるＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンによる該免疫反応の阻害活性がＮ1−アセチルスペルミジンによる該免疫反応の阻害活性の２０倍以上、好ましくは３０倍以上、より好ましくは４０倍以上となる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの測定法、
（７）抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体が、測定条件において固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン又は固相化若しくは標識化Ｎ1−アセチルスペルミンとの免疫反応が５０％阻害するＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンの濃度が２０μＭ以下、好ましくは１５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下となる抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体である上記（６）記載の測定法、
（８）抗Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体がモノクローナル抗体０５２０，４９１４又は８６２４である上記（７）記載の測定法、
（９）検体が尿検体である上記（６）、（７）又は（８）記載の測定法、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
固相化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍを、スペーサーを介して、不溶性物質の表面上に繋ぎ止めたものが挙げられる。
スペーサーの結合位置は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの場合はその末端であってもその両末端の間のいずれの位置であってもよいが、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの場合はその末端アミノ基に結合させるのが望ましい。スペーサーの種類と導入方法については多くの方法が知られているが、これらのいずれであっても良い。例えば、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍのいずれかの位置に、末端に反応基を有するスペーサーを導入し（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍのアセチル基からスペーサーを誘導する場合は、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍのＮ12−アミノ基に導入したアシル基がスペーサーとなる）、この反応基を介して蛋白質や合成高分子などに結合し、生成したＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍと蛋白質や合成高分子の複合体を、免疫反応の場となる固相担体上に吸着させる方法、予め化学的に活性化されたスペーサーを持つ固相担体上に、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍそのもの、もしくは、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの末端アミノ基を反応させる方法などがあるが、これらに限定されるものではない。Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍのいずれの位置に、どのようなスペーサーを導入するかは、用いる抗体の性質によって適宜選択すればよい。
【００１１】
スペーサーとしては、例えばグルタルアルデヒド（ＧＡ）を用いた場合はホルミルブチリル鎖が、Ｎ−（４−マレイミドブチルオキシ）コハク酸イミド（ＧＭＢＳ）を用いた場合はマレイミドブチリル鎖が、無水コハク酸を用いた場合は、カルボキシプロピオニル鎖等が挙げられるが、公知のものはいずれも使用できる。
又、蛋白質や合成高分子としては、例えば、アルブミンやポリリジン等が挙げられるが、これらに限定されるものでなはい。固相担体としては、例えば、９６穴等のマイクロタイタープレート、ポリスチレンビーズ、各種ラテックス粒子、ニトロセルロース膜等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
また、標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、放射性同位元素を導入してＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍそのものを標識したり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍに、放射性元素の入った化合物、ユーロピウム等の遅延蛍光性のある元素を保持できる化合物、ルテニウム等の電気化学発光の触媒となる元素を保持できる化合物、蛍光物質等を結合させて標識したり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍに、前記のようなスペーサーを介して酵素標識したり、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍをビオチンで標識し、免疫反応後にアビジンの酵素標識体と反応させ、ビオチン−アビジン複合体として間接的に検出できるようにしたもの等が挙げられる。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、クローン化されたイムノグロブリン抗体であれば何であってもよく、抗体の由来する動物種、イムノグロブリンのタイプやサブタイプ、抗体の産生方法は問わない。また、抗体を断片化して免疫反応部位を残したもの、それら断片の修飾物、抗体そのものの修飾物、２種類の抗体を結合させたキメラ抗体等も包含する。本発明のモノクローナル抗体は、抗体産生株の組織培養法や、抗体のアミノ酸配列から予想されるＤＮＡを用いて、遺伝子工学を用いる製造法等によって製造することができる。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体を産生する抗体産生株は、公知の方法に準じた方法、即ち、マウス、ラット等の動物を免疫原で免疫し、次いで免疫した動物のＢ細胞とミエローマ細胞を融合し、得られたハイブリドーマの中から本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株を選択することにより得ることができる。
【００１５】
免疫原には、ハプテン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又はＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）とキャリア物質（蛋白質又は合成高分子）の複合体が使用でき、これは、固相化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの作成法で述べた方法と同様にして製造することができる。
本発明のモノクローナル抗体としては、例えばモノクローナル抗体０５２０，４９１４及び８６２４が挙げられ、これらはそれぞれＡＣＳＰＭ−１（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２９７）、ＡＣＳＰＭ−２（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２９８）及びＡＣＳＰＭ−３（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭＰ−１６２９９）と名付けられた細胞株を培養することにより得ることができる。
【００１６】
本発明の測定法は、ハプテンの免疫測定法として知らている方法のいずれの方法によっても行なうことができ、特に制限されない。例えば、結合阻害法の場合、例えば、実験例２のように、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍによる抗体と固相化ハプテンとの免疫反応の阻害を、固相化ハプテンに結合した抗体量の減少として、色々な手段で検出する方法、固相担体としてラテックスを用いる例としては、ハプテンを固相化したラテックス試薬の抗体による凝集反応をＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍによる阻害として検出する方法、逆に、抗体を固相化したラテックス試薬を用い、多エピトープ化したポリハプテンの添加によるラテックス凝集反応を、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍによって阻害させる方法等がある。また、競合法の場合、固相化した抗体に対して、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍと標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとを競合反応させ、ＢＦ分離後に、固相化した抗体に結合した標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍの標識を、それぞれの方法で適宜に検出すればよい。
【００１７】
本発明の測定法を実施する測定条件は特に限定されないが、従来知られている免疫反応を利用した測定条件が使用できる。例えば、検体と試薬（固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若しくは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ及び抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクローナル抗体）を混合して行なう免疫反応は通常０〜４５℃、好ましくは１０〜４０℃で行なう。本発明の測定を実施するにあたり、抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクローナル抗体は必要により固相化又は標識化して使用する。
【００１８】
本発明の測定法を実施するにあたり、固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若しくは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍとしては、抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクロナール抗体を作成する際に用いた免疫原を作成する際に使用したスペーサーの種類、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ若しくはＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍへの結合位置又は化学結合方法のひとつ以上を変えて作成したものが望ましい。
【００１９】
なお、本発明において、固相化若しくは標識化Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ又は固相化若しくは標識化Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍと抗Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍモノクローナル抗体との免疫反応が５０％阻害されるＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度は、測定条件下で両者を反応させて得られるシグナルを半減させるＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度を求めることにより得ることができ、これは、反応系の検出感度の尺度となり得る。
【００２０】
本発明において、検体としては尿、血清、血漿等各種のものが使用できるが、特に尿が好ましい。
【００２１】
【実施例】
以下に、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
実験例１ 抗体のスクリーニング法
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Immunoplate ＩＩ) の各ウェルに、抗原としてＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）１５μｇ／ｍＬを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１００μＬを入れ、４０℃で２０分間放置してコーティングした。次に、コーティング液を捨てて０．１％のツウィーン２０を含む１０ｍＭリン酸で緩衝化された生食液（ＰＢＳＴ）で洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス・塩酸で緩衝化された生食液（ｐＨ７．３）２００μＬでブロッキング処理した。
ブロッキング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、各ウェルにハイブリドーマの培養上清６０μＬと、ＢＳＡ２０ｍｇ／ｍＬを含む１０ｍＭリン酸で緩衝化された生食液２０μＬを加え、４℃で一晩反応させた。ウェルを、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識−ヤギ抗マウスＩｇＧ溶液（カッペル社）５０μＬを加え、３７℃、４０分間反応させた。
結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に９分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments 社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。
【００２３】
実験例２ ＥＬＩＳＡ結合阻害法
[Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）の調製]
６．５ｍｇのＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬに、０．０８３Ｍグルタルアルデヒド溶液１ｍＬを加えて攪拌し、３０秒間放置した。さらに、１０．５ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて攪拌し、室温で３０分間反応させた。さらに、この反応液に水素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを加えて室温下に１０分間反応させた後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液３００ｍＬで、４回液を交換しながら、３時間４５分透析した。
［Ｎ1−アセチルスペルミジンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ）の調製］
３ｍｇのＮ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）を含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬに、０．０２１Ｍグルタルアルデヒド溶液１ｍＬを加えて攪拌し、３０秒間放置した。さらに、６ｍｇのＨＳＡを含む１Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．５ｍＬを加えて攪拌し、室温で３０分間反応させた。さらに、この反応液に水素化ホウ素ナトリウム２．５ｍｇを加えて室温下に１０分間反応させた後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液３００ｍＬで、４回液を交換しながら、３時間透析した。
【００２４】
［測定法］
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Immunoplate ＩＩ）の各ウェルに、抗原としてＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）、Ｎ1−アセチルスペルミジンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ）、又は、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）を１５μｇ／ｍＬ含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μＬを入れ、４０℃で２０分間放置してコーティングした。次に、コーティング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．３）２００μＬでブロッキング処理した。
ブロッキング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、各ウェルに、ハイブリドーマ３株のそれぞれの培養上清をＰＢＳＴで１００倍希釈した液５０μＬと、測定対象物のスペルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）等を、ＰＢＳＴで各種濃度に希釈した液５０μＬを加え、３７℃で１．５時間反応させた。ウェルを、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識−ヤギ抗マウスＩｇＧ溶液５０μＬを加え、３７℃、４０分間反応させた。
結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に５分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments 社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。
【００２５】
実施例１ Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンに対するモノクローナル抗体の作成［Ｎ1−アセチルスペルミンのＢＳＡ複合体（抗原）の調製］
５０ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＡＭＳ）を含むテトラヒドロフラン溶液１ｍＬを、２００ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍＬに加えて攪拌し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．０に保ちながら、室温下に１時間反応させた。この反応液を、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で膨潤化したセファデックスＧ−７５のカラム（２ｃｍ×１００ｃｍ）にかけ、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。誘導体化されたＢＳＡ画分を集めて凍結乾燥し、ＡＭＳ化されたＢＳＡ（ＡＭＳ−ＢＳＡ）１８０ｍｇを得た。ＢＳＡへのＳＨ基の導入数は１７±０．５であった。
次に、１０．４ｍｇのＮ1−アセチルスペルミン・３塩酸塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１ｍＬに、１ｍｇのＮ−(４−マレイミドブチルオキシ)コハク酸イミド（ＧＭＢＳ）を含むテトラヒドロフラン溶液０．５ｍＬを加え、ｐＨを７付近に保ちながら、室温で１００分間反応させ、ＧＭＢＳ化Ｎ1−アセチルスペルミン溶液を調製した。
【００２６】
一方、１７．３ｍｇのＡＭＳ−ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）０．２ｍＬに、０．５Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ７．０）５０μＬを加えて室温下に１０分間放置後、さらに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）２ｍＬを加えた。この溶液と、先に調製したＧＭＢＳ化Ｎ1−アセチルスペルミン溶液を混合してボルテックスミキサー攪拌後、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したセファデックスＧ−１００のカラム（２．２ｃｍ×４３ｃｍ）にかけ、同緩衝液で溶出した。２８０ｎｍにおける蛋白質吸収画分を集め、Ｎ1−アセチルスペルミンのＢＳＡ複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ）を得た。
また、同様の方法で、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対応するＮ1−アセチルスペルミンのＨＳＡ複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ）も調製した。
【００２７】
［免疫]
雌性ＢＡＬＢ/cマウスに、コンプリート・フロイント・アジュバントで乳化したＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ抗原１００μｇを腹腔内投与した。さらに、１００μｇのＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＢＳＡ抗原を１０ｍＭリン酸で緩衝化された生食液（ＰＢＳ）で希釈したもので、２週間毎に、４回追加免疫を行った。
［細胞融合]
５回目の最終感作を行ってから４日後に、マウスの脾細胞を取り出し、これとミエローマ細胞Ｐ３／ＮＳ−１／１Ａｇ４−１とを、４０％ポリエチレングリコール１５００（ベーリンガー社）存在下に、Ｓｈｕｌｍａｎらの方法に従って細胞融合した。次いで、融合細胞は、９６穴培養プレート（コーニング社）を用いて、ウェル当たり１０5 個の細胞密度で、ＨＡＴ培地中で培養した。細胞融合後１０〜２０日目に、９６０ウェル中７０８ウェル（７４％）に、細胞の増殖が認められた。
【００２８】
［細胞の選択]
各ウェルの培養上清中の抗体価を、実験例１の「抗体のスクリーニング法」で検索し、免疫反応陽性の細胞３個を得た。これらを限界希釈法でクローン化し、継続的に抗体を産生する細胞、ＡＣＳＰＭ−１、ＡＣＳＰＭ−２、ＡＣＳＰＭ−３の３株を樹立した。さらに、これら３株の抗原部位への反応性を確認するため、抗原作成時に副生する可能性のあるＧＭＢＡ−ＨＳＡ（ＡＭＳ−ＨＳＡにスペーサーのＧＭＢＡを導入したもの）も調製し、実験例１の抗原Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡの代わりに、ＧＭＢＡ−ＨＳＡ、ＡＭＳ−ＨＳＡ（ＨＳＡにＳＨ基を導入したもの）やキャリア蛋白そのもののＨＳＡをコーティングしたプレートも調製し、倍々希釈したＡＣＳＰＭ−１株、ＡＣＳＰＭ−２株、ＡＣＳＰＭ−３株の培養上清との反応性を確認した。結果を、それぞれ図１〜図３に示した。いずれの培養上清も、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡにのみ反応し、ＧＭＢＡ−ＨＳＡ、ＡＭＳ−ＨＳＡやＨＳＡとは、全く反応しなかった。
［クローン細胞のサブタイプ］
各クローン細胞が産生する免疫グロブリンのサブタイプは、マウスモノクローナルSub-isotyping キット（Zymed 社コードＮｏ．９７−６５５０）を用いて決定した。その結果、０５２０抗体（ＡＣＳＰＭ−１株）と４９１４抗体（ＡＣＳＰＭ−２株）はＩｇＧ1、８６２４抗体（ＡＣＳＰＭ−３株）がＩｇＧ2bであった。
【００２９】
実施例２ モノクローナル抗体の特異性
作成したモノクローナル抗体の特異性は、抗体の固相化抗原への結合を、測定対象物質がどの程度阻害するかを検出する系、「ＥＬＩＳＡ結合阻害法」で評価した。即ち、実験例２の方法に従い、３つの抗原、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを、それぞれ固相化したプレートを用いて、各濃度のポリアミン類が、抗体と固相化抗原との反応を、どの程度阻害するかを評価した。免疫原に相当するＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＭＢＳ−ＨＳＡを固相化した系では、検討したポリアミン類の何れによっても全く阻害されず、測定系としては不適切であった。一方、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ、又は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを固相化した系では、検討した各成分、Ｓｐｍ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍによって、図４〜９に示した結合阻害曲線（検量線）が得られた。０５２０、４９１４、８６２４のいずれの抗体も、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに強く、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄと極めて弱く反応（阻害）し、Ｓｐｍとは全く反応（阻害）しなかった。図から、これらの抗体を用いてポリアミン類を測定した場合の測定感度を５０％結合阻害濃度（ＥＣ50値）として求め、結果を表１に示した。
【００３０】
なお、図４はＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性を、図５は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性を、図６は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性を、図７は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性を、図８は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性を、図９は、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性を示したものである。
【００３１】
０５２０、４９１４、８６２４のいずれの抗体も、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとＮ1，Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに特異的であった。平松ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ｐ１０７−１１２（１９９５））やＧ．Ａ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３２（１０） ｐ１９３０−１９３７（１９８６））によると、尿中のＮ1−Ａｃ−Ｓｐｍ濃度は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍより著しく低いことから、この測定法で、実質的に尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ濃度を反映する測定値を得ることができる。
【００３２】
【表１】
実施例３
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Immunoplate）の各ｗｅｌｌに抗原としてＮ1，Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを１６．１μｇ／ｍＬ含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１５０μＬを入れ、４０℃で３０分間放置してコーティングした。次にＰＢＳＴ３００μＬで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）３００μｌでブロッキング処理した。ＰＢＳＴで洗浄後、各ｗｅｌｌにＡＣＳＰＭ−１の培養上清をＰＢＳＴで２５倍希釈した液５０μＬと、測定対象物のＰｕｔ（プトレッシン）、Ａｃ−Ｐｕｔ、Ｏｒｎ（オルニチン）、Ｃａｄ（カダベリン）、Ｓｐｄ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ、Ｓｐｍ、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−ＳｐｍをＰＢＳＴで各種濃度に希釈した液５０μＬを加え、４℃で一晩反応させた。各ウェルをＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ビオチン（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＱＵＡＬＥＸ社）１００μＬを加え、室温で１．５時間反応し、ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで３０００倍希釈したＨＲＰ−ストレプトアビジン（フナコシ社）１００μＬを加え、室温で３０分反応させた。結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ｗｅｌｌに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸・リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に６分間反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments 社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。結果を図１０に示した。図１０から明らかなようにこの反応系によれば、Ｎ1，Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに対する特異性が向上していることが判る。
【００３４】
実施例４ 最適化されたＥＬＩＳＡ結合阻害法でのモノクローナル抗体の特異性
実験例２の測定法を改良し、再度、抗体の特異性と測定感度を確認した。
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製 Nunc Immunoplate II)の各ウェルに、抗原としてＮ1−アセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）、又は、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンのヒト血清アルブミン複合体（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ）１５μｇ／ｍＬを含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）１５０μＬを入れ、４０℃で３０分間放置してコーティングした。次に、コーティング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、スキムミルク１％を含む５０ｍＭトリス・塩酸で緩衝液（ｐＨ７．４）３００μＬ加え、３７℃で１時間ブロッキング処理した。
【００３５】
ブロッキング液を捨ててＰＢＳＴで洗浄後、各ウェルに、ハイブリドーマ３株のそれぞれの培養上清液を表２に示した倍率（２００〜２０,０００倍）にＰＢＳＴで希釈した液２５μＬと、測定対象物のスペルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）、Ｎ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）をＰＢＳＴで各濃度に希釈した液７５μＬを加え、室温下に３時間反応させた。ウェルをＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで２０００倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液５０μＬを加え、室温下に１時間反応させた。ウェルを再びＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴで３０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液５０μＬを加え、室温下に３０分間反応させた。
【００３６】
結合した酵素の活性は、ＰＢＳＴで洗浄した各ウェルに、ｏ−フェニレンジアミン０．５ｍｇ／ｍＬと過酸化水素０．０１２％を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）１００μＬを加え、室温下に５分間発色反応させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（SLT-Lab Instruments社）を用い、４９２ｎｍにおける吸光度の増加として測定した。
結果を表２にまとめた。測定系を改良し、抗体の希釈倍率を上げることにより、Ｎ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡを固相化した系の測定感度と特異性は、大幅に向上した。即ち、Ｎ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍの測定感度は、０５２０抗体が８倍、４９１４抗体が２２倍、８６２４抗体が７０倍に向上し、５０％結合阻害濃度で比較した感度は、０．０６〜０．２μＭになった。また、特異性をＮ1,Ｎ12−Ａｃ−Ｓｐｍによる５０％結合阻害活性とＮ1−Ａｃ−Ｓｐｄによる５０％結合阻害活性との比として表現した場合、０５２０抗体が４８倍、４９１４抗体が１１７倍、８６２４抗体が４５倍となり、何れも改良前より向上した。
【００３７】
【表２】
実施例５ ４９１４モノクローナル抗体の特異性
実施例４で最も測定感度と特異性の高かった４９１４モノクローナル抗体を用い、実施例３の方法でプトレッシン（Ｐｕｔ）、アセチルプトレッシン（Ａｃ−Ｐｕｔ）、Ｌ−オルニチン（Ｏｒｎ）、カダベリン（Ｃａｄ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、Ｎ8−アセチルスペルミジン（Ｎ8−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1−アセチルスペルミジン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ）、Ｎ1,Ｎ8−ジアセチルスペルミジン（Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄ）、スペルミン（Ｓｐｍ）、Ｎ1−アセチルスペルミン（Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ）やＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミン（Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ）の希釈系列を測定し、４９１４モノクローナル抗体の特異性検討した。図１１のように、この測定系は、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍに特異的で、Ｎ1−Ａｃ−ＳｐｍとはＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの２４％、Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄとは０．８５％、Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄとは０．６％、Ｓｐｍとは０．１％、その他のポリアミン類とはほとんど反応しなかった。
【００３９】
実施例６ 健常者の尿中Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの測定
実施例５の方法で、健常者の尿検体１６例（男性８例、女性８例）の希釈系列を測定し、尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ濃度を求めた。測定例の一部を図１２に示した。男子及び女子８例ずつの平均値±ＳＤは、それぞれ０．３４±０．１６、０．３９±０．１４μＭ／ｇ−クレアチニンで、全体の平均値は０．３６μＭ／ｇ−クレアチニンであった。平松らの報告（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７ｐ１０７−１１２（１９９５））によると、尿中におけるＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ：Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｍ：Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ：Ｎ1,Ｎ8−２Ａｃ−Ｓｐｄの存在比は、３．２％：１．０％：８６．２％：９．６％であることが報告されている。この測定系の特異性からすれば、Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ以外のポリアミン成分の影響は軽微と考えられ、尿中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍは、ほぼ正確に測定されているものと考えられる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンと反応するモノクローナル抗体は、尿等の検体中のＮ1,Ｎ12−ジアセチルスペルミンを測定することができ、癌の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＣＳＰＭ−１株培養上清液の免疫原への特異性
【図２】ＡＣＳＰＭ−２株培養上清液の免疫原への特異性
【図３】ＡＣＳＰＭ−３株培養上清液の免疫原への特異性
【図４】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
【図５】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
【図６】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性
【図７】Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
【図８】Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
【図９】Ｎ1−Ａｃ−Ｓｐｄ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での８６２４抗体の特異性
【図１０】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での０５２０抗体の特異性
【図１１】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍ−ＧＡ−ＨＳＡ固相化ＥＬＩＳＡ結合阻害法での４９１４抗体の特異性
【図１２】Ｎ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの検量線及び尿検体中のＮ1,Ｎ12−２Ａｃ−Ｓｐｍの濃度
Claims (4)
- 固相化Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンと抗Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体との免疫反応において、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンによる該免疫反応の５０％阻害活性がＮ１−アセチルスペルミジンによる該免疫反応の５０％阻害活性の少なくとも３０倍となり、且つ動物（但し、ヒトを除く）をＮ １ −アセチルスペルミンとキャリア物質の複合体で免疫し、次いで免疫した動物のＢ細胞とミエローマ細胞を融合し、得られたハイブリドーマから選別された細胞株を培養して得られる抗Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体を用い、固相化Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンを固相化抗原として用いることを特徴とする検体中のＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法。
- 固相化Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンと抗Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体との免疫反応において、Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンによる該免疫反応の５０％阻害活性がＮ１−アセチルスペルミジンによる該免疫反応の５０％阻害活性の少なくとも３０倍となり、該免疫反応を５０％阻害するＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンの濃度が２０μＭ以下であり、且つ動物（但し、ヒトを除く）をＮ １ −アセチルスペルミンとキャリア物質の複合体で免疫し、次いで免疫した動物のＢ細胞とミエローマ細胞を融合し、得られたハイブリドーマから選別された細胞株を培養して得られる抗Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンモノクローナル抗体を用い、固相化Ｎ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンを固相化抗原として用いることを特徴とする検体中のＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法。
- モノクローナル抗体が、細胞株ＡＣＳＰＭ−１（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２９７）を培養して得られるモノクローナル抗体０５２０、細胞株ＡＣＳＰＭ−２（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭＰ−１６２９８）を培養して得られるモノクローナル抗体４９１４、又は、細胞株ＡＣＳＰＭ−３（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託番号、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２９９）を培養して得られるモノクローナル抗体８６２４である請求項１又は２に記載の検体中のＮ１，Ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法。
- 検体が尿検体である請求項３記載の測定法。
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