JP2750423B2 - ビタミンｂ１２の測定法及びビタミンｂ１２の測定試薬 - Google Patents
ビタミンｂ１２の測定法及びビタミンｂ１２の測定試薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 ビタミンB12又はコバラミンは体液、例えば、全血、
血漿、血清中に低濃度（約10-14mol/）で存在する必
須ビタミンであり、これに関してはB12−運搬蛋白質
（トランス−コバラミン）への強い結合が注目すべきこ
とである。食物により、吸収不良症候群、すなわち１種
以上のトランス−コバラミンの遺伝的欠乏により、又は
腸内寄生虫、例えば魚条虫（裂頭条虫）の寄生による不
十分なビタミン供給に起因するであろうビタミンB12−
欠乏の徴候は種々の徴候型に現われ、これは固体の年令
及びビタミンB12−機能不全の機関に依存する。僅かな
ビタミンB12−欠乏は赤血球の減少を作用し、このこと
により更に一連の代謝障害が生じ、かつ巨赤芽球性貧血
となる。子供においては神経系がおかされ、場合によつ
ては失明する。
血漿、血清中に低濃度（約10-14mol/）で存在する必
須ビタミンであり、これに関してはB12−運搬蛋白質
（トランス−コバラミン）への強い結合が注目すべきこ
とである。食物により、吸収不良症候群、すなわち１種
以上のトランス−コバラミンの遺伝的欠乏により、又は
腸内寄生虫、例えば魚条虫（裂頭条虫）の寄生による不
十分なビタミン供給に起因するであろうビタミンB12−
欠乏の徴候は種々の徴候型に現われ、これは固体の年令
及びビタミンB12−機能不全の機関に依存する。僅かな
ビタミンB12−欠乏は赤血球の減少を作用し、このこと
により更に一連の代謝障害が生じ、かつ巨赤芽球性貧血
となる。子供においては神経系がおかされ、場合によつ
ては失明する。
著しく希釈された水溶液（例えば、血清）中のコバラ
ミン、特にシアノコバラミン（ビタミンB12）の測定に
現在最も多く使用されている方法は固有フアクター（I
F）が結合試薬として用いられる、放射性標識物質を使
用する方法に基づく。最も使用される方法はマーカーと
して57Co−B12を使用して、遊離及び標識被分析物がIF
との結合に関して競合する競合原理を基礎として行なわ
れる。結合及び遊離被分析物の分離（bound/free−Tren
nunng）は例えば活性炭、固相結合IF又は磁気分離、こ
こではIFが常磁性粒子に結合している（Brit.J.Haemat.
第22巻、1972年、第21〜31頁、Olin.chem.第24巻、1978
年、第461〜466頁、Olin.Bsochemistry、第18巻、1985
年、第261〜266頁参照）、のような方法に基づいて行な
われる。
ミン、特にシアノコバラミン（ビタミンB12）の測定に
現在最も多く使用されている方法は固有フアクター（I
F）が結合試薬として用いられる、放射性標識物質を使
用する方法に基づく。最も使用される方法はマーカーと
して57Co−B12を使用して、遊離及び標識被分析物がIF
との結合に関して競合する競合原理を基礎として行なわ
れる。結合及び遊離被分析物の分離（bound/free−Tren
nunng）は例えば活性炭、固相結合IF又は磁気分離、こ
こではIFが常磁性粒子に結合している（Brit.J.Haemat.
第22巻、1972年、第21〜31頁、Olin.chem.第24巻、1978
年、第461〜466頁、Olin.Bsochemistry、第18巻、1985
年、第261〜266頁参照）、のような方法に基づいて行な
われる。
体液中のビタミンB12の測定の前に、ビタミンB12を血
液中に存在するその結合蛋白質から分離することが必要
である。このことは例えば熱作用により、又はSH−結合
を切断するチオール、ジチオトライトール（DTT）の作
用下にアルカリ域（pH＞13.5）で結合蛋白質を分解する
（血清試料をDTTを用いてアルカリ性域で恒温保持す
る）ことにより行なわれる。有機物質は、例えばアセト
ンの添加により、又は競合的に、交差反応するもの、例
えばコビナミド（Cobinamid）の添加により、この分解
はより強化される。更に、測定の際に、シアン化アルカ
リを添加することは、ビタミンB12の抽出性を上昇させ
るために、かつコバラミンを安定で、検出可能な形、す
なわちシアノコバラミンに変換するために有利である。
液中に存在するその結合蛋白質から分離することが必要
である。このことは例えば熱作用により、又はSH−結合
を切断するチオール、ジチオトライトール（DTT）の作
用下にアルカリ域（pH＞13.5）で結合蛋白質を分解する
（血清試料をDTTを用いてアルカリ性域で恒温保持す
る）ことにより行なわれる。有機物質は、例えばアセト
ンの添加により、又は競合的に、交差反応するもの、例
えばコビナミド（Cobinamid）の添加により、この分解
はより強化される。更に、測定の際に、シアン化アルカ
リを添加することは、ビタミンB12の抽出性を上昇させ
るために、かつコバラミンを安定で、検出可能な形、す
なわちシアノコバラミンに変換するために有利である。
ビタミンB12の公知測定法の欠点は特に固有フアクタ
ー（IF）の使用に起因する。使用した固有フアクターが
十分に純粋でない場合、誤まつた結果が観察される（他
のB12−結合蛋白質により最高５％の不純化）。多くの
試料は放射性標識されたB12に関するIF−結合性を遮断
する、IFに対する抗体を明らかに含有する。このことは
低すぎるビタミンB12−値に見せかけることがある。
ー（IF）の使用に起因する。使用した固有フアクターが
十分に純粋でない場合、誤まつた結果が観察される（他
のB12−結合蛋白質により最高５％の不純化）。多くの
試料は放射性標識されたB12に関するIF−結合性を遮断
する、IFに対する抗体を明らかに含有する。このことは
低すぎるビタミンB12−値に見せかけることがある。
発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の課題は固有フアクターを使用しなく
てもよく、かつこのことにより前記欠点を回避すること
ができ、かつ迅速で、簡単で、かつ再現性のある方法
で、血清中のビタミンB12の正確な測定を可能にするビ
タミンB12の測定法をつくりあげることである。
てもよく、かつこのことにより前記欠点を回避すること
ができ、かつ迅速で、簡単で、かつ再現性のある方法
で、血清中のビタミンB12の正確な測定を可能にするビ
タミンB12の測定法をつくりあげることである。
課題を解決するための手段 従つて、本発明の方法は、試料溶液を、固相への結合
に関与するR1と標識化されているR2との少なくとも２種
のレセプターR1及びR2と共に恒温保持し、両方の相を分
離し、かつ両方の相の１方の標識を測定することにより
ビタミンB12を測定するための方法において、両方のレ
セプターR1又はR2の１方としてB12に関する親和定数が
少なくとも５×109/molであるB12と結合性のモノクロ
ーナル抗体を有するレセプターを使用し、他のレセプタ
ーR2又はR1としてB12又はその相似体（Analogon）を有
するレセプターを使用することを特徴とする。
に関与するR1と標識化されているR2との少なくとも２種
のレセプターR1及びR2と共に恒温保持し、両方の相を分
離し、かつ両方の相の１方の標識を測定することにより
ビタミンB12を測定するための方法において、両方のレ
セプターR1又はR2の１方としてB12に関する親和定数が
少なくとも５×109/molであるB12と結合性のモノクロ
ーナル抗体を有するレセプターを使用し、他のレセプタ
ーR2又はR1としてB12又はその相似体（Analogon）を有
するレセプターを使用することを特徴とする。
本発明による方法は、ビタミンB12−測定が固定モノ
クローナル抗体を使用する免疫学的テストが全く市販さ
れていなかつた、最後のパラメーターの１つであつたの
で、臨床診断学にとつて著しい前進を意味する。
クローナル抗体を使用する免疫学的テストが全く市販さ
れていなかつた、最後のパラメーターの１つであつたの
で、臨床診断学にとつて著しい前進を意味する。
本発明による免疫学的測定法にとつて、原則的にすべ
ての現行のイムノアツセイ法、例えば放射性イムノアツ
セイ、酵素イムノアツセイ、蛍光イムノアツセイ等が好
適である。更に、すべての変法、例えば競合イムノアツ
セイ、IEMA−法等を適用可能である。
ての現行のイムノアツセイ法、例えば放射性イムノアツ
セイ、酵素イムノアツセイ、蛍光イムノアツセイ等が好
適である。更に、すべての変法、例えば競合イムノアツ
セイ、IEMA−法等を適用可能である。
ビタミンB12の測定のためには、競合酵素イムノアツ
セイ又はIEMA−原理による方法が特に有利であることが
示された。競合酵素イムノアツセイ法においては、測定
すべきB12が公知量の標識B12と担体結合モノクローナル
抗体の結合位に関して競合する。このテスト法は測定す
べきB12と担体結合B12が不足量で存在する標識モノクロ
ーナル抗体の結合位を競合するというように実施するこ
ともできる。担体固定B12に結合した標識モノクローナ
ル抗体の部分を標識に基づき測定する。この変法はこの
モノクローナル抗体を標識せずに使用するというように
変化させることもできる。次いで、担体固定B12に結合
した抗体部分を、抗体のFc−部に作用する抗体と恒温保
持し、結合した標識部分を測定することにより調べる。
IEMA−法においては標識化モノクローナル抗体を過剰に
添加する。過剰の、B12に結合していない標識抗体をハ
プテン−担体マトリックスを用いて溶液から除去する。
該テスト法の種々の変法並びにこれらの方法を実施する
ための詳細は文献中に十分に記載されている。本発明に
よる抗体を使用してB12−測定のための他の免疫学的ハ
プテン測定法も可能である。これらは例えばドイツ特許
出願第Ｐ−3834766号又は同第Ｐ−3822750号明細書中に
記載されている。
セイ又はIEMA−原理による方法が特に有利であることが
示された。競合酵素イムノアツセイ法においては、測定
すべきB12が公知量の標識B12と担体結合モノクローナル
抗体の結合位に関して競合する。このテスト法は測定す
べきB12と担体結合B12が不足量で存在する標識モノクロ
ーナル抗体の結合位を競合するというように実施するこ
ともできる。担体固定B12に結合した標識モノクローナ
ル抗体の部分を標識に基づき測定する。この変法はこの
モノクローナル抗体を標識せずに使用するというように
変化させることもできる。次いで、担体固定B12に結合
した抗体部分を、抗体のFc−部に作用する抗体と恒温保
持し、結合した標識部分を測定することにより調べる。
IEMA−法においては標識化モノクローナル抗体を過剰に
添加する。過剰の、B12に結合していない標識抗体をハ
プテン−担体マトリックスを用いて溶液から除去する。
該テスト法の種々の変法並びにこれらの方法を実施する
ための詳細は文献中に十分に記載されている。本発明に
よる抗体を使用してB12−測定のための他の免疫学的ハ
プテン測定法も可能である。これらは例えばドイツ特許
出願第Ｐ−3834766号又は同第Ｐ−3822750号明細書中に
記載されている。
本発明においては少なくとも１つのモノクローナル抗
体を使用するが、これはビタミンB12に対して特異的に
作用し、５×109/molより大きく、有利に1010/mol
より大きく、特に有利に５×1010/molより大きい親和
定数並びにメチルコバラミン多びシアノコバラミンに対
して100％の、コビナミドに対して0.05％より小さい、
ブリニルコビナミドに対して1.1％の、コブリリン酸ジ
アミドに対して0.05％より小さい、２−ヒドロキシ−5,
6−ジメチルベンズイミダゾリルコバミドに対して1.5％
の、かつ（カルボキシ（２−シアナミノ−4,5−ジメチ
ルフエニル）−アミノ）−コバミドに対して0.07％の交
差反応性を示す。
体を使用するが、これはビタミンB12に対して特異的に
作用し、５×109/molより大きく、有利に1010/mol
より大きく、特に有利に５×1010/molより大きい親和
定数並びにメチルコバラミン多びシアノコバラミンに対
して100％の、コビナミドに対して0.05％より小さい、
ブリニルコビナミドに対して1.1％の、コブリリン酸ジ
アミドに対して0.05％より小さい、２−ヒドロキシ−5,
6−ジメチルベンズイミダゾリルコバミドに対して1.5％
の、かつ（カルボキシ（２−シアナミノ−4,5−ジメチ
ルフエニル）−アミノ）−コバミドに対して0.07％の交
差反応性を示す。
モノクローナル抗体を完全抗体、キメラ抗体又は二価
抗体フラグメントとして使用することができる。
抗体フラグメントとして使用することができる。
従つて、ビタミンB12の測定のためには試料溶液を少
なくとも２種のレセプターR1及びR2と恒温保持する。
なくとも２種のレセプターR1及びR2と恒温保持する。
その際、レセプターR1は固相への結合に関与する。こ
のためにはレセプターR1は直接、又はスペーサーを介し
て固相に結合していてもよいし、又は溶けた形で存在
し、免疫学的反応の実施後はじめて固定されてもよい。
レセプターR1はビタミンB12に特異的に結合性のモノク
ローナル抗体か、又はビタミンB12又はその相似体を有
する。
のためにはレセプターR1は直接、又はスペーサーを介し
て固相に結合していてもよいし、又は溶けた形で存在
し、免疫学的反応の実施後はじめて固定されてもよい。
レセプターR1はビタミンB12に特異的に結合性のモノク
ローナル抗体か、又はビタミンB12又はその相似体を有
する。
抗体もしくはB12の担体への結合（固定）は専門家に
よりよく実施される方法で、吸着又は化学結合により、
又は特異的な結合対を介しての結合により行なわれる。
この場合、結合対の１方は固定されていて、他方は化学
的にB12もしくは抗体に結合している。この結合対を介
して、抗体もしくはB12は免疫学的測定反応の前又は間
に固定化される。この種の結合対の例はビオチン−スト
レプトアビジン／アビジン、ハプテン−抗体、抗原−抗
体、コンカバリン−抗体、糖−レクチン、ハプテン−結
合蛋白質である。
よりよく実施される方法で、吸着又は化学結合により、
又は特異的な結合対を介しての結合により行なわれる。
この場合、結合対の１方は固定されていて、他方は化学
的にB12もしくは抗体に結合している。この結合対を介
して、抗体もしくはB12は免疫学的測定反応の前又は間
に固定化される。この種の結合対の例はビオチン−スト
レプトアビジン／アビジン、ハプテン−抗体、抗原−抗
体、コンカバリン−抗体、糖−レクチン、ハプテン−結
合蛋白質である。
本発明による抗体の固定のための、もしくはB12の固
定のための担体材料として、例えばプラスチツク、例え
ばポリスチロール、ビニールポリマー、ポリプロピレ
ン、ポリカーポネート、多糖類、シリコン、ゴム又は処
理ガラスからなる管（チューブ）、マイクロ滴定プレー
ト、球（ビーズ）又はマイクロキヤリヤーを使用する。
（例えばE.T.Maggio、“Enzyme Immunoassay"CAC Pres
s、Florida、1980年、特に第175〜178頁；ヨーロツパ特
許公開第063064号公報;Bioengineering、第16巻、1974
年、第997〜1003頁;C.J.Sanderson及びD.V.Wilson、Imm
unology、第20巻、1971年、第1061〜1065頁参照）。特
に担体材料として、アビジン又はストレプトアビジンで
被覆した担体材料、特にポリスチロール、有利にヨーロ
ツパ特許公開第0269092号公報中に記載されているよう
に製造したものを使用する。
定のための担体材料として、例えばプラスチツク、例え
ばポリスチロール、ビニールポリマー、ポリプロピレ
ン、ポリカーポネート、多糖類、シリコン、ゴム又は処
理ガラスからなる管（チューブ）、マイクロ滴定プレー
ト、球（ビーズ）又はマイクロキヤリヤーを使用する。
（例えばE.T.Maggio、“Enzyme Immunoassay"CAC Pres
s、Florida、1980年、特に第175〜178頁；ヨーロツパ特
許公開第063064号公報;Bioengineering、第16巻、1974
年、第997〜1003頁;C.J.Sanderson及びD.V.Wilson、Imm
unology、第20巻、1971年、第1061〜1065頁参照）。特
に担体材料として、アビジン又はストレプトアビジンで
被覆した担体材料、特にポリスチロール、有利にヨーロ
ツパ特許公開第0269092号公報中に記載されているよう
に製造したものを使用する。
レセプターR2は同様にビタミンB12又はその相似体
か、又はビタミンB12と特異的に結合性のモノクローナ
ル抗体を含有し、かつ標識されている。標識のためには
それぞれの測定法に常用のものが好適である。こうし
て、放射性イムノアツセイにおいては、放射性同位元
素、例えば57Coを標識のために使用する。酵素−イムノ
アツセイのためにはすべてのこのために通常使用される
酵素、例えばペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダー
ゼが好適である。蛍光−イムノアツセイのためには常用
の蛍光性群をマーカーとして使用可能である。これらの
種々のテスト法の詳細及び変法は専門家に公知である。
固相への結合と同様にして、B12もしくは抗体への標識
の結合も特異的な結合対を介して行なわれてもよい。
か、又はビタミンB12と特異的に結合性のモノクローナ
ル抗体を含有し、かつ標識されている。標識のためには
それぞれの測定法に常用のものが好適である。こうし
て、放射性イムノアツセイにおいては、放射性同位元
素、例えば57Coを標識のために使用する。酵素−イムノ
アツセイのためにはすべてのこのために通常使用される
酵素、例えばペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダー
ゼが好適である。蛍光−イムノアツセイのためには常用
の蛍光性群をマーカーとして使用可能である。これらの
種々のテスト法の詳細及び変法は専門家に公知である。
固相への結合と同様にして、B12もしくは抗体への標識
の結合も特異的な結合対を介して行なわれてもよい。
抗体もしくはB12の前記結合対の１万への結合は専門
家に常用の方法により、例えばカルボジイミド又はヒド
ロキシサクシンイミドを介して行なわれる。
家に常用の方法により、例えばカルボジイミド又はヒド
ロキシサクシンイミドを介して行なわれる。
B12の酵素での標識においては、有利に式（Ｉ） B12−CO−NHNH−Ｒ−CO−NHXN＝GP （Ｉ） 〔式中、B12はシアノコバラミン（ビタミンB12）から−
CONH2−基の脱離により生じた基を表わし、Ｒは結合基
（スペーサー）を表わし、ｘは０又は１であり、GPはグ
リコシル基含有マーカー酵素の残基であり、これはグリ
コシル基を介して−NH−Ｎ＝基に結合している〕のB12
−複合体を有利に使用する。式（Ｉ）で−CONH−基は有
利にB12−基のｄ−位にあり、まず第１にB12−ｄ−CO−
NH−＝GP、かつ特にB12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2（Ｏ
−CH2−CH2）3O−CH2−CO−NH−Ｎ＝GPが使用される。
標識酵素（GP）としては有利にペルオキシダーゼ（PO
D）が使用される。
CONH2−基の脱離により生じた基を表わし、Ｒは結合基
（スペーサー）を表わし、ｘは０又は１であり、GPはグ
リコシル基含有マーカー酵素の残基であり、これはグリ
コシル基を介して−NH−Ｎ＝基に結合している〕のB12
−複合体を有利に使用する。式（Ｉ）で−CONH−基は有
利にB12−基のｄ−位にあり、まず第１にB12−ｄ−CO−
NH−＝GP、かつ特にB12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2（Ｏ
−CH2−CH2）3O−CH2−CO−NH−Ｎ＝GPが使用される。
標識酵素（GP）としては有利にペルオキシダーゼ（PO
D）が使用される。
式（Ｉ）のB12−複合体は本願と同一出願人により同
日出願されたドイツの特許出願P3900648.4号明細書（表
題：新規コバラミン−酸ヒドラジド及びこれから誘導さ
れたコバラミンの複合体）の課題である。これらは同様
に前記同日出願ドイツの特許出願P3900648.4号明細書の
課題である式 B12−CO−NH−NHＲ−CO−NH−NHXH 〔式中、B12、Ｒ及びｘは前記のものを表す〕のコバラ
ミン−酸ヒドラジドとグリコ蛋白質のグリコシリル基の
OH基との結合（縮合）により、その酸化及び−NH−Ｎ＝
CH−グリコ蛋白質の形成後自体公知法により製造され
る。
日出願されたドイツの特許出願P3900648.4号明細書（表
題：新規コバラミン−酸ヒドラジド及びこれから誘導さ
れたコバラミンの複合体）の課題である。これらは同様
に前記同日出願ドイツの特許出願P3900648.4号明細書の
課題である式 B12−CO−NH−NHＲ−CO−NH−NHXH 〔式中、B12、Ｒ及びｘは前記のものを表す〕のコバラ
ミン−酸ヒドラジドとグリコ蛋白質のグリコシリル基の
OH基との結合（縮合）により、その酸化及び−NH−Ｎ＝
CH−グリコ蛋白質の形成後自体公知法により製造され
る。
本発明方法の有利な実施形においては、結合蛋白質か
らビタミンB12を切り離すために従来公知の方法で試料
溶液を処理するが、この際結合蛋白質をアルカリ域（pH
＞13.5）でSH−基切断チオール、ジチオトライトール
（DTT）を添加することにより、又は30〜60分間煮沸
し、その後遠心分離することにより分解する。
らビタミンB12を切り離すために従来公知の方法で試料
溶液を処理するが、この際結合蛋白質をアルカリ域（pH
＞13.5）でSH−基切断チオール、ジチオトライトール
（DTT）を添加することにより、又は30〜60分間煮沸
し、その後遠心分離することにより分解する。
ビタミンB12−測定のための本発明方法において、試
料準備（結合蛋白質の切り離し）をリポン酸（Liponic
acid、LA）又は式II 〔式中、ｎは１〜８、特に３〜５を表わす〕のその同族
体で実施するのが有利であるが、この際リポン酸（式I
I、ｎ＝４）が特に有利である。
料準備（結合蛋白質の切り離し）をリポン酸（Liponic
acid、LA）又は式II 〔式中、ｎは１〜８、特に３〜５を表わす〕のその同族
体で実施するのが有利であるが、この際リポン酸（式I
I、ｎ＝４）が特に有利である。
試料準備のためのこの方法は本発明と同一出願人によ
る同日出願のドイツ特許出願第P3900649.2（表題：被分
析物をその結合蛋白質から切り離す方法）の課題であ
る。この方法によればアルカリ性域における室温での試
料の恒温保持（pH値10〜14;有利にアルカリ性媒体とし
て水酸化ナトリウムを、濃度0.05〜1m mol/で使用）
を15分よりわずかで行なう。
る同日出願のドイツ特許出願第P3900649.2（表題：被分
析物をその結合蛋白質から切り離す方法）の課題であ
る。この方法によればアルカリ性域における室温での試
料の恒温保持（pH値10〜14;有利にアルカリ性媒体とし
て水酸化ナトリウムを、濃度0.05〜1m mol/で使用）
を15分よりわずかで行なう。
式（II）の酸を、この際（ｎ＝４のリポ酸に関して計
算し）有利に１〜20mg/ml、特に４〜10mg/mlの範囲で使
用する。
算し）有利に１〜20mg/ml、特に４〜10mg/mlの範囲で使
用する。
本発明による方法は非常に正確で、再現性のある値を
提供する。このことは特に、ビタミンB12に対して著し
く高い親和定数を示す、ビタミンB12に対するモノクロ
ーナル抗体を使用するということに起因する。この抗体
は同様に本発明の課題である。このような高い親和定数
を有するこの種の特異的モノクローナル抗体は従来公知
ではない。
提供する。このことは特に、ビタミンB12に対して著し
く高い親和定数を示す、ビタミンB12に対するモノクロ
ーナル抗体を使用するということに起因する。この抗体
は同様に本発明の課題である。このような高い親和定数
を有するこの種の特異的モノクローナル抗体は従来公知
ではない。
本発明のもう１つの課題はB12と特異的に結合性のモ
ノクローナル抗体の製法であり、この方法はスペーサ
ー、特に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドを介して免疫原担体材料が結合し
ているビタミンB12−ｄ−酸で同系交配マウスを免疫化
し、免疫化動物のＢ−リンパ球を取得し、形質転換因子
で骨髄腫細胞と融合し、このように形成されたハイブリ
ツド細胞をクローン化し、培養し、モノクローナル抗体
をこの細胞から単離することを特徴とする。
ノクローナル抗体の製法であり、この方法はスペーサ
ー、特に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドを介して免疫原担体材料が結合し
ているビタミンB12−ｄ−酸で同系交配マウスを免疫化
し、免疫化動物のＢ−リンパ球を取得し、形質転換因子
で骨髄腫細胞と融合し、このように形成されたハイブリ
ツド細胞をクローン化し、培養し、モノクローナル抗体
をこの細胞から単離することを特徴とする。
本発明によるモノクローナル抗体を獲得するためには
まずB12の免疫原担体材料と結合する。免疫原担体材料
としては、この目的のために通常使用されるすべての物
質、例えばアルブミン、例えば牛血清アルブミン、エデ
スチン等が好適である。担体材料とB12との結合は自体
公知法により行なわれる。
まずB12の免疫原担体材料と結合する。免疫原担体材料
としては、この目的のために通常使用されるすべての物
質、例えばアルブミン、例えば牛血清アルブミン、エデ
スチン等が好適である。担体材料とB12との結合は自体
公知法により行なわれる。
引き続き、実験動物、例えばマウスを免疫原複合体で
免疫化する。免疫化のためには免疫原を例えばアジユバ
ンスと組み合わせて常法で処置する。アジユバンスとし
ては完全または不完全フロイントのアジユバンスを使用
する。免疫化は有利に数ケ月にわたつて４〜６時間の間
隔で少なくとも４回の免疫化で行なう（腹腔内注射）。
免疫化する。免疫化のためには免疫原を例えばアジユバ
ンスと組み合わせて常法で処置する。アジユバンスとし
ては完全または不完全フロイントのアジユバンスを使用
する。免疫化は有利に数ケ月にわたつて４〜６時間の間
隔で少なくとも４回の免疫化で行なう（腹腔内注射）。
このように免疫化した動物からＢ−リンパ球を採取
し、これを永続骨髄腫細胞系と融合する。この融合はケ
ーラー（Ｋhler）とミルスタイン（Milstein）の公知
方法（Nature、第256巻、1975年、第495〜497頁）によ
り行なう。この際形成されたハイブリツド細胞の第１次
培養物を常法で、例えば市販の細胞種の使用下に、又は
“制限希釈法（limiting dilution）”によりクローン
化する。そのつど、好適なテスト法、例えば酵素−イム
ノアツセイ法（ELISA−法）においてB12に対してプラス
であり、前記交差活性を示す培養物を継続して処理す
る。このようにして本発明によるモノクローナル抗体が
生産する多くのハイプリドーマー細胞系が得られる。公
知法によりこの細胞系を培養し、これから生産されるモ
ノクローナル抗体を単離することができる。
し、これを永続骨髄腫細胞系と融合する。この融合はケ
ーラー（Ｋhler）とミルスタイン（Milstein）の公知
方法（Nature、第256巻、1975年、第495〜497頁）によ
り行なう。この際形成されたハイブリツド細胞の第１次
培養物を常法で、例えば市販の細胞種の使用下に、又は
“制限希釈法（limiting dilution）”によりクローン
化する。そのつど、好適なテスト法、例えば酵素−イム
ノアツセイ法（ELISA−法）においてB12に対してプラス
であり、前記交差活性を示す培養物を継続して処理す
る。このようにして本発明によるモノクローナル抗体が
生産する多くのハイプリドーマー細胞系が得られる。公
知法によりこの細胞系を培養し、これから生産されるモ
ノクローナル抗体を単離することができる。
このようにして本発明において使用する抗体、特に５
×109/molより大きく、有利に1010/molより大き
く、特に有利に５×10/molより大きい親和定数並びに
メチルコバラミン及びシアノコバラミンに対して100％
の、コビナミドに対して0.05％より小さい、プリニルコ
ビナミドに対して1.1％の、コブリリン酸ジアミドに対
して0.05％より小さい、２−ヒドロキシ−5,6−ジメチ
ルベンズイミダゾリルコバミドに対して1.5％の、かつ
（カルボキシ（２−シアナミノ−4,5−ジメチルフエニ
ル）−アミノ）−コバミドに対して0.07％の交差反応性
を示す抗体が得られる。このように高い特異性を示す抗
体は、例えばこのように得られた細胞系ECACC88101301
及びECACC88101302から生産される。
×109/molより大きく、有利に1010/molより大き
く、特に有利に５×10/molより大きい親和定数並びに
メチルコバラミン及びシアノコバラミンに対して100％
の、コビナミドに対して0.05％より小さい、プリニルコ
ビナミドに対して1.1％の、コブリリン酸ジアミドに対
して0.05％より小さい、２−ヒドロキシ−5,6−ジメチ
ルベンズイミダゾリルコバミドに対して1.5％の、かつ
（カルボキシ（２−シアナミノ−4,5−ジメチルフエニ
ル）−アミノ）−コバミドに対して0.07％の交差反応性
を示す抗体が得られる。このように高い特異性を示す抗
体は、例えばこのように得られた細胞系ECACC88101301
及びECACC88101302から生産される。
これらの細胞系はそれぞれ記載した番号で寄託機関EC
ACC（European Collection of Animal Cell Cultures、
Porton Down、GB）にブタペスト条約に基づき国際寄託
されている。
ACC（European Collection of Animal Cell Cultures、
Porton Down、GB）にブタペスト条約に基づき国際寄託
されている。
このように得られたモノクローナル抗体は、B12に関
して著しく高い親和性（親和定数:5×10-9より大）及び
前記交差反応性を有することにより優れている。モノク
ローナル抗体の親和性が1010/molを越えるのが有利で
あり、特に５×1010/molを越えるのが有利である。
して著しく高い親和性（親和定数:5×10-9より大）及び
前記交差反応性を有することにより優れている。モノク
ローナル抗体の親和性が1010/molを越えるのが有利で
あり、特に５×1010/molを越えるのが有利である。
本発明によるモノクローナル抗体は試料、例えば血清
又は血漿中でB12を特異的に測定するために著しく好適
である。この測定法のためにこのモノクローナル抗体を
そのようなキメラ抗体として、又はキメラ抗体の相応す
る免疫学的特性を有するフラグメント、例えばFab−フ
ラグメントとして使用することができる。“モノクロー
ナル抗体”という概念は完全な抗体もフラグメントも包
含する。
又は血漿中でB12を特異的に測定するために著しく好適
である。この測定法のためにこのモノクローナル抗体を
そのようなキメラ抗体として、又はキメラ抗体の相応す
る免疫学的特性を有するフラグメント、例えばFab−フ
ラグメントとして使用することができる。“モノクロー
ナル抗体”という概念は完全な抗体もフラグメントも包
含する。
実施例 次に実施例につき本願を詳細に説明するが、本願はこ
れにのみ限定されるものではない。室温（RT）は25℃＝
２℃を意味する。パーセントの記載は重量％を意味す
る。
れにのみ限定されるものではない。室温（RT）は25℃＝
２℃を意味する。パーセントの記載は重量％を意味す
る。
例１ ビタミンB12に対するモノクローナル抗体の獲得 免疫原の製造 ビタミンB12−ｄ−酸（JACS、第102巻、1980年、第22
15頁により製造）を１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド（EDC）を介してエデ
スチンに結合する。
15頁により製造）を１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド（EDC）を介してエデ
スチンに結合する。
ビタミンB12−複合体でのマウスの免疫化 生後８〜12週のBalb/c−マウスを完全フロイントのア
ジユバンス中の免疫原100μｇで腹腔内に第１回免疫化
を行なつた。６週間後に、４週間の間隔で更に３回の免
疫化を実施した。この際、不完全フロイントのアジユバ
ンス中の免疫原100μｇを腹腔内投与した。融合の４日
前、３日前及び２日前に試験官中で更にもう１度免疫原
100μｇで免疫化した。
ジユバンス中の免疫原100μｇで腹腔内に第１回免疫化
を行なつた。６週間後に、４週間の間隔で更に３回の免
疫化を実施した。この際、不完全フロイントのアジユバ
ンス中の免疫原100μｇを腹腔内投与した。融合の４日
前、３日前及び２日前に試験官中で更にもう１度免疫原
100μｇで免疫化した。
融合 免疫化マウスの脾臓細胞をP3×64Ag8−653骨髄腫細胞
（ATCCCRL8375）と1:5の割合で混合し、かつ遠心分離し
た（10分間、300g、４℃）。この細胞を更に１回BSS（B
alanced Salt Solution）−緩衝液で洗浄し、尖頭管50m
l中400gで遠心分離した。上澄を捨て、細胞沈殿物をほ
ぐして、PEG（分子量4000、メルク社）1mlを加え、ピペ
ツトで撹拌した。水浴中で１分後、FKS（胎児性子牛血
精）不含のRPMI1640−培地（RPMI＝Rosewell Rarker Me
mory Institut）5mlを室温で４〜５分かけて滴下し、混
合し、培地で50mlに満たし、かつ引き続き400gで、４℃
で10分間遠心分離した。沈殿した細胞をRPMI1640−培地
＋10％KFS中に取り込み、脾臓細胞各５×104〜１×105
又は腹腔浸出液細胞５×104を“飼料細胞”として添加
した。翌日、ヒポキサンチン−アザセリン−選択培地
（ヒポキサンチン100m mol/、アザセリン１μg/ml）
を添加した。
（ATCCCRL8375）と1:5の割合で混合し、かつ遠心分離し
た（10分間、300g、４℃）。この細胞を更に１回BSS（B
alanced Salt Solution）−緩衝液で洗浄し、尖頭管50m
l中400gで遠心分離した。上澄を捨て、細胞沈殿物をほ
ぐして、PEG（分子量4000、メルク社）1mlを加え、ピペ
ツトで撹拌した。水浴中で１分後、FKS（胎児性子牛血
精）不含のRPMI1640−培地（RPMI＝Rosewell Rarker Me
mory Institut）5mlを室温で４〜５分かけて滴下し、混
合し、培地で50mlに満たし、かつ引き続き400gで、４℃
で10分間遠心分離した。沈殿した細胞をRPMI1640−培地
＋10％KFS中に取り込み、脾臓細胞各５×104〜１×105
又は腹腔浸出液細胞５×104を“飼料細胞”として添加
した。翌日、ヒポキサンチン−アザセリン−選択培地
（ヒポキサンチン100m mol/、アザセリン１μg/ml）
を添加した。
融合後約７〜10日後、すでに多くのクローンが可視で
あつた。第１次培養物の上澄を例２に記載したELISA−
法により試験した。所望の交差反応を示す第１次培養物
をFACS（Fluorescence activated cell sorter;蛍光活
性化細胞選択機）により96−穴−細胞培養プレート中で
クローン化した。“飼料細胞”としては“穴”あたり腹
腔浸出液細胞１×104又は脾臓細胞２×104を添加した。
このようにして、例えば両方のハイブリドーマー細胞系 ECACC88101301及びECACC88101302を単離することがで
き、これは寄託機関ECACCにそれぞれ記載した寄託番号
で寄託されている。
あつた。第１次培養物の上澄を例２に記載したELISA−
法により試験した。所望の交差反応を示す第１次培養物
をFACS（Fluorescence activated cell sorter;蛍光活
性化細胞選択機）により96−穴−細胞培養プレート中で
クローン化した。“飼料細胞”としては“穴”あたり腹
腔浸出液細胞１×104又は脾臓細胞２×104を添加した。
このようにして、例えば両方のハイブリドーマー細胞系 ECACC88101301及びECACC88101302を単離することがで
き、これは寄託機関ECACCにそれぞれ記載した寄託番号
で寄託されている。
腹水の誘発 ハイブリツド細胞５×106をプリスタン0.5mlで前処理
したマウスに１回〜２回で腹腔内注射した。その後１〜
３週間で、５〜20mg/mlのIgG−濃度の腹水を得ることが
できた。これから常法で抗体を単離することができる。
このモノクローナル抗体は特異的にビタミンB12に作用
し、所望の交差反応性を示す。モノクローナル抗体をMA
K1（ECACC88101301からのもの）もしくはMAK2（ECACC88
101302からのもの）と呼ぶ。抗体MAK1の親和定数は5.1
×1010/mol以上であって、5.6×1010/mol以下であ
る。抗体MAKの親和定数は1.1×1010/mol以上であっ
て、1.5×1010/mol以下である。
したマウスに１回〜２回で腹腔内注射した。その後１〜
３週間で、５〜20mg/mlのIgG−濃度の腹水を得ることが
できた。これから常法で抗体を単離することができる。
このモノクローナル抗体は特異的にビタミンB12に作用
し、所望の交差反応性を示す。モノクローナル抗体をMA
K1（ECACC88101301からのもの）もしくはMAK2（ECACC88
101302からのもの）と呼ぶ。抗体MAK1の親和定数は5.1
×1010/mol以上であって、5.6×1010/mol以下であ
る。抗体MAKの親和定数は1.1×1010/mol以上であっ
て、1.5×1010/mol以下である。
例２ ビタミンB12に対する抗体に関するスクリーニングテス
ト 免疫化マウスの血清中又はハイプリツド細胞の培養上
澄中の又は腹水中のビタミンB12に対する抗体の存在及
び特異性を知るためには、ELISA法がテスト原理として
使用される：被覆緩衝液（0.2mol/炭酸ナトリウム／
炭酸水素ナトリウム、pH9.3〜9.5）中のB12−複合体（B
12−ｄ−酸がEDCを介して子牛血清アルブミンに結合）
１μg/mlで、37℃で１時間被覆する。0.9％塩化ナトリ
ウム溶液及び１％アルブミン溶液で10分間後処理する。
引き続き、0.9％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。その
後試料100μと共に37℃で１時間恒温保持し、新たに
0.9％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。交差反応を調べ
るために、試料溶液に試験すべきビタミンB12−誘導体5
0、500及び5000μg/mlを添加する。この誘導体の存在化
で測定シグナルの低下は交差反応を示す。羊−Fab−抗
−マウスFcγ−ペルオキシダーゼ−複合体4500U/mlと更
に恒温保持を行なう（１時間、37℃）。0.9％塩化ナト
リウムでの新たな洗浄工程の後、ペルオキシダーゼ活性
を常法で測定する（例えば、2,2′−アジノージ−〔３
−エチルベンズチアゾリン−スルホネート（６）〕（AB
TS を用いて、室温で30分間、吸光度差、ΔmE、を422n
mで読み取る）。
ト 免疫化マウスの血清中又はハイプリツド細胞の培養上
澄中の又は腹水中のビタミンB12に対する抗体の存在及
び特異性を知るためには、ELISA法がテスト原理として
使用される：被覆緩衝液（0.2mol/炭酸ナトリウム／
炭酸水素ナトリウム、pH9.3〜9.5）中のB12−複合体（B
12−ｄ−酸がEDCを介して子牛血清アルブミンに結合）
１μg/mlで、37℃で１時間被覆する。0.9％塩化ナトリ
ウム溶液及び１％アルブミン溶液で10分間後処理する。
引き続き、0.9％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。その
後試料100μと共に37℃で１時間恒温保持し、新たに
0.9％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。交差反応を調べ
るために、試料溶液に試験すべきビタミンB12−誘導体5
0、500及び5000μg/mlを添加する。この誘導体の存在化
で測定シグナルの低下は交差反応を示す。羊−Fab−抗
−マウスFcγ−ペルオキシダーゼ−複合体4500U/mlと更
に恒温保持を行なう（１時間、37℃）。0.9％塩化ナト
リウムでの新たな洗浄工程の後、ペルオキシダーゼ活性
を常法で測定する（例えば、2,2′−アジノージ−〔３
−エチルベンズチアゾリン−スルホネート（６）〕（AB
TS を用いて、室温で30分間、吸光度差、ΔmE、を422n
mで読み取る）。
例３ 交差反応の測定 該テストを例２に記載したように実施する。
該モノクローナル抗体にそれぞれ交差反応に関して試
験すべき抗原を上昇濃度（50μｇ、500μｇ、5000μg/m
l）で添加する。引き続き、この交差反応を次の式によ
り計算する： ｃ＝最大シグナルの50％到達に必要である抗原の濃
度。
験すべき抗原を上昇濃度（50μｇ、500μｇ、5000μg/m
l）で添加する。引き続き、この交差反応を次の式によ
り計算する： ｃ＝最大シグナルの50％到達に必要である抗原の濃
度。
モノクローナル抗体MAK1及びMAK2に関し同一である、
調べた値を次の表にまとめる。 交差反応性抗原 交差反応 メチル−コバラミン 100 シアノ−コバラミン 1000 コビナミド ＜0.05 ブリニルコビナミド 1.1 コブリイン酸−ジアミド ＜0.05 ２−ヒドロキシ−5,6−ジメチル 1.5 ベンズイミダゾリルコバミド （カリボキシ（２−シアナミノ− 0.07 4,5−ジメチルフエニル）アミノ コバミド 例４ ビタミンB12の測定 ａ）試料予備調製 人血清250μを切断試薬（0.5mol/NaOH中に溶かし
たリポン酸8mg/ml、シアン化カリウム1mg/mlからなる）
125μと混合し、室温で15分間恒温保持する。引き続
き、200m mol/燐酸塩緩衝液、pH4.1、125μを添加
する。
調べた値を次の表にまとめる。 交差反応性抗原 交差反応 メチル−コバラミン 100 シアノ−コバラミン 1000 コビナミド ＜0.05 ブリニルコビナミド 1.1 コブリイン酸−ジアミド ＜0.05 ２−ヒドロキシ−5,6−ジメチル 1.5 ベンズイミダゾリルコバミド （カリボキシ（２−シアナミノ− 0.07 4,5−ジメチルフエニル）アミノ コバミド 例４ ビタミンB12の測定 ａ）試料予備調製 人血清250μを切断試薬（0.5mol/NaOH中に溶かし
たリポン酸8mg/ml、シアン化カリウム1mg/mlからなる）
125μと混合し、室温で15分間恒温保持する。引き続
き、200m mol/燐酸塩緩衝液、pH4.1、125μを添加
する。
ｂ）試薬： Thermo−RSA−ストレプトアビジン（ヨーロツパ特許
公開第0269092号公報により製造）で被覆したポリスチ
ロール管 試薬１ ビオチニル化MAK1又はMAK2（JACS、 第100巻、1978年、第3585〜 3590頁によりビオチニル化） 95ng/ml、 燐酸塩緩衝液、pH7.2 40m mol/、 試薬２ B12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2（Ｏ−CH2−CH2）３−
Ｏ−CH2−CO−NH−Ｎ＝POD（活性約60mU/ml） 燐酸塩緩衝液、pH7.2 40m mol/ 試薬３ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液、ph4.4 100m mol/、 ABTS 1.9m mol/、 過硼酸ナトリウム 3.2m mol/ ｃ）測定の実施 測定の実施のためには前処理した試料200μを試薬
１ 800μと共にストプトアビジン管に加え、室温で6
0分間恒温保持する。引き続き、洗浄溶液で洗浄し、試
薬２ 1000μを添加し、30分間室温で恒温保持する。
洗浄溶液で洗浄し、試薬３ 1000μを添加し、30分間
室温で恒温保持し、かつ生じた色をビタミンB12−含量
に関する尺度として422nmで測定する。
公開第0269092号公報により製造）で被覆したポリスチ
ロール管 試薬１ ビオチニル化MAK1又はMAK2（JACS、 第100巻、1978年、第3585〜 3590頁によりビオチニル化） 95ng/ml、 燐酸塩緩衝液、pH7.2 40m mol/、 試薬２ B12−ｄ−CO−NH−NH−CO−CH2（Ｏ−CH2−CH2）３−
Ｏ−CH2−CO−NH−Ｎ＝POD（活性約60mU/ml） 燐酸塩緩衝液、pH7.2 40m mol/ 試薬３ 燐酸塩−クエン酸塩緩衝液、ph4.4 100m mol/、 ABTS 1.9m mol/、 過硼酸ナトリウム 3.2m mol/ ｃ）測定の実施 測定の実施のためには前処理した試料200μを試薬
１ 800μと共にストプトアビジン管に加え、室温で6
0分間恒温保持する。引き続き、洗浄溶液で洗浄し、試
薬２ 1000μを添加し、30分間室温で恒温保持する。
洗浄溶液で洗浄し、試薬３ 1000μを添加し、30分間
室温で恒温保持し、かつ生じた色をビタミンB12−含量
に関する尺度として422nmで測定する。
ｄ）ビオチニル化完全MAK1のかわりにビオチニル化Fab
−フラグメントを使用する時、同様な結果が得られる。
Fab−フラグメントは次のように製造される： Biochem.J.、第73巻、1959年、第119〜126頁に記載さ
れているようにMAK1でパパイン切断を実施する。この際
生じたFab−フラグメントをセフアデツクスG100を介す
るゲル瀘過がDEAE−セルロースを介してイオン交換クロ
マトグラフイー（Enzymology、第73巻、1981年、第418
〜459頁記載の方法）により分離する。
−フラグメントを使用する時、同様な結果が得られる。
Fab−フラグメントは次のように製造される： Biochem.J.、第73巻、1959年、第119〜126頁に記載さ
れているようにMAK1でパパイン切断を実施する。この際
生じたFab−フラグメントをセフアデツクスG100を介す
るゲル瀘過がDEAE−セルロースを介してイオン交換クロ
マトグラフイー（Enzymology、第73巻、1981年、第418
〜459頁記載の方法）により分離する。
例５ B12に関する公知のラジオイムノアッセイとの比較 標準として0.9％塩化ナトリウム、0.9％クロテインｃ
多び0.1％シアン化カリウムを含有する燐酸塩緩衝液40m
mol/、pH7.2中のシアノコバラミンを使用した。比較
のためにベクトン・デイツキインソン（Becton Dickins
on）から販売されているテスト（共通No Biol SHB−B12
/Folat−Radioassay）を使用した。このテストにおいて
は固定固有フアクター及び放射性標識B12（57CoB12）を
使用する。試料調製のためには、このテストにおいてジ
チオトライトール（DDT）をアルカリ性溶液で使用す
る。この放射性イムノアツセイと本発明による方法との
相関性はビタミンB12濃度100〜1400pb/mlの範囲で＞0.9
8である。
多び0.1％シアン化カリウムを含有する燐酸塩緩衝液40m
mol/、pH7.2中のシアノコバラミンを使用した。比較
のためにベクトン・デイツキインソン（Becton Dickins
on）から販売されているテスト（共通No Biol SHB−B12
/Folat−Radioassay）を使用した。このテストにおいて
は固定固有フアクター及び放射性標識B12（57CoB12）を
使用する。試料調製のためには、このテストにおいてジ
チオトライトール（DDT）をアルカリ性溶液で使用す
る。この放射性イムノアツセイと本発明による方法との
相関性はビタミンB12濃度100〜1400pb/mlの範囲で＞0.9
8である。
例６ B12に対するポリクローナル抗体でのビタミンB12−測定
（比較例） ａ）抗血清の獲得 羊10匹を例１に記載した免疫原（完全フロイントのア
ジユバンス中0.5ng/ml）を用いて、４週間の間隔で６ケ
月を越えて免疫化する。引き続き、抗血清を獲得し、か
つ親和性クロマトグラフイーにより精製する。
（比較例） ａ）抗血清の獲得 羊10匹を例１に記載した免疫原（完全フロイントのア
ジユバンス中0.5ng/ml）を用いて、４週間の間隔で６ケ
月を越えて免疫化する。引き続き、抗血清を獲得し、か
つ親和性クロマトグラフイーにより精製する。
ｂ）B12（Fab−ビオチン）に対するポリクローナル抗体
のビオチニル化Fab−フラグメントの製造 ポリクローナル抗体でBiochem.J.、第73巻、1959年、
第119〜126頁に記載されているようにパパイン切断を実
施する。この際生じたフラグメントをセフアデツクスG1
00を介するゲル瀘過及びDEAE−セルロースを介するイオ
ン交換−クロマトグラフイー（Enzymology、第73巻、19
81年、第418〜459頁に記載の方法）を用いて分離する。
ビオチニル化はJACS、第100巻、1978年、第3585〜3590
頁に記載されているように行なう。
のビオチニル化Fab−フラグメントの製造 ポリクローナル抗体でBiochem.J.、第73巻、1959年、
第119〜126頁に記載されているようにパパイン切断を実
施する。この際生じたフラグメントをセフアデツクスG1
00を介するゲル瀘過及びDEAE−セルロースを介するイオ
ン交換−クロマトグラフイー（Enzymology、第73巻、19
81年、第418〜459頁に記載の方法）を用いて分離する。
ビオチニル化はJACS、第100巻、1978年、第3585〜3590
頁に記載されているように行なう。
ｃ）測定の実施 測定の実施を例４に記載したように行なうが、この際
ビオチニル化MAK1 95ng/mlのかわりにFab−ビオチン95
ng/mlを使用する。
ビオチニル化MAK1 95ng/mlのかわりにFab−ビオチン95
ng/mlを使用する。
第２図はポリクローナル抗体を介してのB12測定とモ
ノクローナル抗体を介してのB12−測定との間の比較を
示す。この図によれば、本発明によるモノクローナル抗
体で、著しく急勾配の検量線が得られる。
ノクローナル抗体を介してのB12−測定との間の比較を
示す。この図によれば、本発明によるモノクローナル抗
体で、著しく急勾配の検量線が得られる。
第１図は種々のMAK−濃度での例４によるビタミンB12−
測定に関する標準曲線を示すグラフ図である： 曲線1:85ng/ml MAK 曲線2:90ng/ml MAK 曲線3:95ng/ml MAK 曲線4:100ng/ml MAK 第２図は例４による測定（曲線２）とポリクローナル抗
体を使用する測定（曲線１）との比較を示すグラフ図で
ある。
測定に関する標準曲線を示すグラフ図である： 曲線1:85ng/ml MAK 曲線2:90ng/ml MAK 曲線3:95ng/ml MAK 曲線4:100ng/ml MAK 第２図は例４による測定（曲線２）とポリクローナル抗
体を使用する測定（曲線１）との比較を示すグラフ図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ダンター・パツペルト ドイツ連邦共和国トウツチング・ベリン ガーヴエーク 10 (72)発明者 ミヒヤエル・グロール ドイツ連邦共和国フエルダフイング・ポ センホーフエナー・シユトラーセ 22 (72)発明者 クリスタ・ヒユープナー‐パライツ ドイツ連邦共和国トウツチング・マリー エンシユトラーセ 11 (56)参考文献 米国特許4082738（ＵＳ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】試料溶液を、固相への結合に関与するR1と
標識化されているR2との少なくとも２種のレセプターR1
及びR2と共に恒温保持し、両方の相を分離し、かつ両方
の相の１方の標識を測定することによりビタミンB12を
測定するための方法において、両方のレセプターR1又は
R2の１方としてB12に関する親和定数が少なくとも５×1
09/molであるB12と特異的に結合性のモノクローナル
抗体を有するレセプターを使用し、他のレセプターR2又
はR1としてB12又はその相似体を有するレセプターを使
用することを特徴とするビタミンB12の測定法。 - 【請求項２】固相への結合に関与するレセプターR1と標
識されたレセプターR2とを含有するB12の測定試薬にお
いて、両方のレセプターR1又はR2の１方としてB12に関
して少なくとも５×109/molで親和定数を示すB12と特
異的に結合性のモノクローナル抗体を有するレセプタ
ー、もう１方のレセプターR2又はR1としてB12又はその
相似体を有するレセプター並びに場合により標識に関す
る検出システムを含有するB12の測定試薬。
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| DE3900649A1 (de) * | 1989-01-11 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur abloesung eines analyten von seinem bindeprotein |
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-
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- 1993-10-15 US US08/137,887 patent/US5451508A/en not_active Expired - Lifetime
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1995
- 1995-05-16 US US08/442,160 patent/US5614394A/en not_active Expired - Fee Related
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