CN111808158B

CN111808158B - 一种维生素b12粗品的制备方法

Info

Publication number: CN111808158B
Application number: CN202010717891.8A
Authority: CN
Inventors: 户鹏东; 裴立忠; 高宏伟; 沈毅; 马琼
Original assignee: Ningxia Kingvit Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Ningxia Kingvit Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2040-07-23
Also published as: CN111808158A; WO2022017390A1

Abstract

本发明涉及一种维生素B12粗品的制备方法，其工艺是将脱氮假单孢杆菌经酸化、水解、絮凝沉淀后过滤，分别收集滤渣和滤液；其中滤渣用丙酮复合溶媒浸提后与滤液混合，再经大孔树脂吸附、丙酮水溶液解析、减压浓缩得到浓缩液；用氰胺水溶液转化、丙酮结晶得到维生素B12粗品。本发明采用由丙酮、异丙醇和水组成的混合液浸提菌渣中腺苷钴胺，可有效提高提取收率，且生产操作连贯性强，产生废水量少；用氰胺替代氰化钠、氰化钾作转化剂，转化过程不易造成VB12水解，转化收率较好，且氰胺毒性较低，减少安全、环保压力，有利于企业安全有序开展日常生产经营。

Description

一种维生素B12粗品的制备方法

技术领域

本发明属于生物发酵与提取技术领域，特别是涉及一种维生素B12粗品的制备方法。

背景技术

维生素B12（VB12），英文名称Vitamin B12，又称钴胺素或氰钴素,是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素，包括腺苷钴胺(deoxyadenosylcobalamin)、氰钴胺(cyanocobalamin）、甲钴胺(methylcobalamin)、羟钴胺(hydroxycobalamin)，所含的三价钴位于类似卟啉的咕啉环平面的中心。现有技术中，维生素B12一般特指氰钴胺，其分子的特点含有钴原子及氰基团而形成的一种复合体。

维生素B12是目前已发现的最大、最复杂的维生素分子，也是唯一含有金属离子的维生素；植物不含VB12，也不能制造VB12。肝脏是VB12的最好来源，其次为奶、肉、蛋、鱼等。VB12是核糖核酸和脱氧核糖核酸合成过程中必需的一种辅酶，体内VB12缺乏可以引起周围神经和中枢性脑病等神经系统的病理性改变。

VB12的分子式为 C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P，分子量 1355.38,其结构式为：

VB12系深红色结晶或结晶性粉，300℃不溶化；有吸湿性，在空气中能吸收12%水分，其含水结晶在空气中稳定。在210～220℃时颜色变深；能溶于水和醇，不溶于丙酮、氯仿和醚；其溶液呈中性，在pH4.5～5时最稳定，在碱性或强酸性溶液中可缓慢水解。

工业生产中，一般采用脱氮假单孢菌(Pseμdomonas denitrificans)进行有氧发酵生产腺苷钴胺发酵液，再经提取、转化、纯化得到VB12产品。其中，将腺苷钴胺分子中的钴原子上脱去脱氧腺苷钴胺基团，再结合上-CN基团成为氰钴胺的过程，称为转化。一般生产工艺中，通过加入氰化钠或氰化钾，实现转化。这种工艺存在的问题是：

1、腺苷钴胺为胞内发酵产物，腺苷钴胺主要存在于菌丝细胞中，为提高释放率，需要将板框过滤后的滤渣多次加水浸泡，再经离心机高速旋转破壁。由于离心机易污染，需要多次拆洗，影响连贯性作业，且产生废水多，增加了环保处理压力。

2、氰化钠、氰化钾为剧毒药品，安全风险大，管理费用高。需在采购、运输、使用、贮存、包装桶回收等环节，进行特别监管，而且转化过程产生的废气、废水、废固等需进行无害化处理，以确保生态环境的安全。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种可实现连续化生产，无毒害作用，安全可靠，减少污水产生，降低环保压力，且能有效提高转化收率的维生素B12粗品的制备方法。

为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种维生素B12粗品的制备方法，其特征在于其工艺步骤为：

1）将脱氮假单孢杆菌发酵液经酸化、水解、絮凝沉淀后过滤，分别收集滤渣和滤液；

2）将滤渣用丙酮复合溶媒浸提后离心处理，减压浓缩得到浸提浓缩液，所述丙酮复合溶媒为丙酮、异丙醇和水的混合物，其体积比为：V_丙酮：V_异丙醇：V_水=5.5～6.5:1.5～2.5:5.5～6.5,投料比为W_滤渣：W_{丙酮复合溶媒}=1:3.5～5.5；

3）将上述浸提浓缩液同滤液混合，经大孔树脂吸附、丙酮水溶液解析、减压浓缩得到腺苷钴胺解析浓缩液；

4）在腺苷钴胺解析浓缩液加入氰胺水溶液进行转化，之后二次絮凝沉淀、过滤得到维生素B12过滤液；

5）在维生素B12过滤液加入丙酮结晶，抽滤，干燥即可得到维生素B12粗品。

过程2）中，采用丙酮复合溶媒浸提2～3次，每次3～5小时。

过程4）中，所述转化是指在30～35℃温度条件下，在腺苷钴胺解析浓缩液中加入质量浓度40～45%的氰胺水溶液，搅拌反应90～120min，氰胺加入量为W_{腺苷钴胺解析浓缩液}：W_氰胺=1:0.028～0.029。

过程4）中，所述二次絮凝沉淀、过滤是指在转化反应液中，加入0.1～0.3%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，然后依次经板框过滤、液体过滤器过滤。

过程5）中，所述丙酮结晶是指在维生素B12过滤液中加入其体积8～10倍的丙酮。

所述进大孔树脂吸附、解吸，系指浸提浓缩液与滤液混合,经大孔树脂吸附，再经30、40、50%（v/v）丙酮水溶液解析，减压浓缩，得到腺苷钴胺解析浓缩液。

本发明的技术优势体现在：

1 本发明采用丙酮、异丙醇和水组成的混合液复合溶媒进行浸提提取腺苷钴胺，改变了单一使用水带来的极性，提高了酯溶性，增加菌丝细胞壁亲和性，有利于进入菌丝细胞内将腺苷钴胺提取出来。本发明比单纯用水浸泡、离心机高速破壁提取方式，收率高3～5%，而且生产操作连贯性强，产生废水量少。

2 本发明中转化工艺用氰胺替代氰化钠（NaCN)、氰化钾（KCN)，氰胺（CNNH₂)等，由于氰胺在水溶液中显弱酸性，转化过程不易造成VB12水解，而氰化钠、氰化钾水解呈较强碱性，转化过程易发生局部过碱，造成VB12水解，因而，用氰胺作转化剂，转化收率较高；同时氰化钠、氰化钾是剧毒，而氰胺毒性较低，因此，转化工艺用氰胺替代氰化钠、氰化钾，能减少安全、环保压力，有利于企业安全有序开展日常生产经营。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

对脱氮假单孢杆菌发酵液进行酸化和水解处理得到脱氮假单孢杆菌酸化水解液，其中酸化所用的酸为盐酸或者硫酸，水解时入水的体积为发酵液体积的1～1.5倍，水的加热温度为75～95℃。

取脱氮假单孢杆菌酸化水解液10000L（菌体浓度12%（w/v）、效价230μg/ml），分别按水解液体积，加入0.4%（w/v）聚合氯化铝40kg和0.2%（w/v）珍珠岩20kg，搅拌30分钟，静置，进板框过滤，得到滤液8760L（效价180μg/ml），含腺苷钴胺1.577kg；滤渣1260kg（效价560μg/g），含腺苷钴胺0.706kg，将滤液、滤渣均匀分成7份，分别进行以下实验：

实施例1

将以上滤渣180kg（效价560μg/g），投入溶媒浸提罐，按投料比（滤渣（W）：复合溶媒（V）=1：3.5），加入丙酮复合溶媒630L（丙酮（V）：异丙醇（V)：水（V）=5.5:1.5:5.5），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提3hr后，进板框过滤，收集滤渣，照前进行第二次浸提，合并两次浸提液，减压浓缩，得到浸提浓缩液554L（效价165μg/ml）。

将浸提液与滤液合并1251L（效价180μg/ml），混合液体积1805L（效价175μg/ml）,收率96.9%。

将以上混合液进大孔树脂吸附柱，依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，减压浓缩，得到腺苷钴胺解析浓缩液体积368L（效价830μg/ml）,收率96.7%。

将以上腺苷钴胺解析浓缩液投入转化罐中，控制温度30～32℃，搅拌转速60rpm，按W_腺苷钴胺：W_氰胺=1:0.028，加入质量浓度40%（w/v)氰胺水溶液，转化反应90min。

转化反应结束，在转化反应液中，加入0.1%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，水顶洗，得到VB12过滤液420L（效价622μg /ml）,收率85.5%。

将以上VB12过滤液投入结晶罐中，室温下，加入8倍VB12过滤液体积的丙酮，使VB12结晶析出，抽滤、干燥，得到VB12粗品0.303kg（含量82%），收率95%。总收率76.1%。废水总量2173L。

实施例2

将以上滤渣180kg（效价560μg /g），投入溶媒浸提罐，按投料比（滤渣（W）：复合溶媒（V）=1：4.0），加入丙酮复合溶媒720L（丙酮（V）：异丙醇（V)：水（V）=6.5:2.5:6.5），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提6hr后，进板框过滤，收集滤渣，照前进行第二次浸提，合并两次浸提液，减压浓缩，得到浸提浓缩液604L（效价146μg/ml），合并滤液1251L（效价180μg/ml），混合液体积1855L（效价169μg/ml）,收率96.1%。

将以上混合液进大孔树脂吸附柱，依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，减压浓缩，得到腺苷钴胺解析浓缩液体积420L（效价722μg /ml）,收率96.8%。

将以上腺苷钴胺解析浓缩液投入转化罐中，控制温度32～34℃，搅拌转速70rpm，按W_腺苷钴胺：W_氰胺=1:0.028，加入42%（w/w)氰胺水溶液，转化反应100min。

转化反应结束，在转化反应液中，加入0.2%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，水顶洗，得到VB12过滤液490L（效价529μg/ml）,收率85.7%。

将以上VB12过滤液投入结晶罐中，室温下，加入9倍VB12过滤液体积的丙酮，使VB12结晶析出，抽滤、干燥，得到VB12粗品0.306kg（含量80%），收率94.4%。总收率75.2%。废水总量2275L。

实施例3

将以上滤渣180kg（效价560μg/g），投入溶媒浸提罐，按投料比（滤渣（W）：复合溶媒（V）=1：4.5），加入丙酮复合溶媒810L（丙酮（v）：异丙醇（v)：水（V）=6.0:2.0:6.0），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提5hr后，进板框过滤，收集滤渣，照前进行第二次浸提，合并两次浸提液，减压浓缩，得到浸提浓缩液694L（效价135μg/ml），合并滤液1251L（效价180μg/ml），混合液体积1945L（效价164μg/ml）,收率98.1%。

将以上混合液进大孔树脂吸附柱，依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，减压浓缩，得到腺苷钴胺解析浓缩液体积470L（效价663μg/ml）,收率97.8%。

将以上腺苷钴胺解析浓缩液投入转化罐中，控制温度34～35℃，搅拌转速60rpm，按W_腺苷钴胺：W_氰胺=1:0.0285，加入42.5%（w/w)氰胺水溶液，转化反应110min；

转化反应结束，在转化反应液中，加入0.3%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，水顶洗，得到VB12过滤液530L（效价507μg/ml）,收率86.2%。

将以上VB12过滤液投入结晶罐中，室温下，加入10倍VB12过滤液体积的丙酮，使VB12结晶析出，抽滤、干燥，得到VB12粗品0.312kg（含量80%），收率92.8%。总收率76.7%。废水总量2415L。

实施例4

将以上滤渣180kg（效价560μg/g），投入溶媒浸提罐，按投料比（滤渣（W）：复合溶媒（V）=1：5.0），加入丙酮复合溶媒900L（丙酮（v）：异丙醇（v)：水（V）=6.0:1.5:6.5），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提3hr后，进板框过滤，收集滤渣，照前进行第二次、第三次浸提，合并三次浸提液，减压浓缩，得到浸提浓缩液1254L（效价72μg/ml），合并滤液1251L（效价180μg/ml），混合液体积2505L（效价126μg/ml）,收率97.3%。

将以上混合液进大孔树脂吸附柱，依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，减压浓缩，得到腺苷钴胺解析浓缩液体积520L（效价594μg/ml）,收率97.9%。

将以上腺苷钴胺解析浓缩液投入转化罐中，控制温度31～33℃，搅拌转速60rpm，按W_腺苷钴胺：W_氰胺=1:0.029，加入45%（w/w)氰胺水溶液，转化反应120min。

转化反应结束，在转化反应液中，加入0.2%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，水顶洗，得到VB12过滤液560L（效价474μg/ml）,收率85.9%。

将以上VB12过滤液投入结晶罐中，室温下，加入9倍VB12过滤液体积的丙酮，使VB12结晶析出，抽滤、干燥，得到VB12粗品0.308kg（含量82%），收率95.1%。总收率77.8%。废水总量3025L。

实施例5

将以上滤渣180kg（效价560μg/g），投入溶媒浸提罐，按投料比（滤渣（W）：复合溶媒（V）=1：5.5），加入丙酮复合溶媒990L（丙酮（v）：异丙醇（v)：水（V）=6.0:2.5:6.0），控制搅拌转速60rpm，室温下进行浸提，浸提3hr后，进板框过滤，收集滤渣，照前进行第二次浸提，合并两次浸提液，减压浓缩，得到浸提浓缩液819L（效价114μg/ml），合并滤液1251L（效价180μg/ml），混合液体积2070L（效价154μg/ml）,收率97.8%。

将以上混合液进大孔树脂吸附柱，依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，减压浓缩，得到腺苷钴胺解析浓缩液体积572L（效价542μg/ml）,收率97.2%。

将以上腺苷钴胺解析浓缩液投入转化罐中，控制温度31～33℃，搅拌转速60rpm，按W_腺苷钴胺：W_氰胺=1:0.029，加入42.5%（w/w)氰胺水溶液，转化反应105min；

转化反应结束，在转化反应液中，加入0.2%（w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，静置15分钟，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，水顶洗，得到VB12过滤液620L（效价425μg/ml）,收率85.3%。

将以上VB12过滤液投入结晶罐中，室温下，加入9倍VB12过滤液体积的丙酮，使VB12结晶析出，抽滤、干燥，得到VB12粗品0.305kg（含量82%），收率94.9%。总收率76.9%。废水总量2642L。

对比案例1

将以上滤渣180kg（效价560μg/g），投入水浸提罐中，按投料比（滤渣（w）：水（v）:1：5.0），加入水，控制搅拌转速80rpm，室温下进行浸泡，浸泡3hr后，进板框过滤，收集滤渣，照前再进行二次浸提，合并三次浸提液，总计2700L（效价32μg/ml），合并滤液1251L（效价180μg/ml），混合液体积3951L（效价79μg/ml）,收率95.6%。

将以上混合液进大孔树脂吸附柱，依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，减压浓缩，得到腺苷钴胺解析浓缩液体积1120L（效价270μg/ml）,收率96.9%。

将以上腺苷钴胺解析浓缩液投入转化罐中，控制温度70℃，搅拌下，将腺苷钴胺浓缩液中，按W_腺苷钴胺：W_NaCN=1:0.032，加入30%（w/w)氰化钠水溶液，氰化转化反应90min；

氰化转化反应液中，加入0.3%（w/v)聚合硫酸铝，搅拌20min，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，水顶洗，得到VB12过滤液1200L（效价216μg/ml）,收率85.7%。

上述VB12过滤液中，加入9倍VB12过滤液体积的丙酮，使VB12结晶析出，抽滤、干燥，得到VB12粗品0.308kg（含量80%），收率95.2%。总收率75.6%。废水总量5151L。

对比案例2

将以上滤渣180kg（效价560μg/g），投入水浸提罐中，按投料比（滤渣（w）：水（v）:1：5.0），加入水，控制搅拌转速80rpm，室温下进行浸泡，浸泡3hr后，进板框过滤，收集滤渣，照前再进行二次浸提，合并三次浸提液，总计2620L（效价32μg/ml），合并滤液1251L（效价180μg/ml），混合液体积3871L（效价80μg/ml）,收率95.9%。

将以上混合液进大孔树脂吸附柱，依次用30%（v/v)、40%（v/v)、50%（v/v)丙酮水溶液解析，收集解析液，减压浓缩，得到腺苷钴胺解析浓缩液体积1100L（效价272μg/ml）,收率96.6%。

将以上腺苷钴胺解析浓缩液投入转化罐中，控制温度70℃，搅拌下，将腺苷钴胺浓缩液中，按W_腺苷钴胺：W_KCN=1:0.043,加入30%（w/w)氰化钾水溶液，氰化转化反应90min；

氰化转化反应液中，加入0.3%（w/v)聚合硫酸铝，搅拌20min，依次经板框过滤、液体过滤器过滤（1μm)，水顶洗，得到VB12过滤液1220L（效价211μg/ml）,收率86.2%。

上述VB12过滤液中，加入9倍VB12过滤液体积的丙酮，使VB12结晶析出，抽滤、干燥，得到VB12粗品0.305kg（含量80%），收率94.8%。总收率75.7%。废水总量5091L。

效果对比：

Claims

1.一种维生素B12粗品的制备方法，其特征在于其工艺步骤为：

1)将脱氮假单孢杆菌发酵液经酸化、水解、絮凝沉淀后过滤，分别收集滤渣和滤液；

2)将滤渣用丙酮复合溶媒浸提后离心处理，减压浓缩得到浸提浓缩液，所述丙酮复合溶媒为丙酮、异丙醇和水的混合物，其体积比为：V丙酮：V异丙醇：V水＝5.5～6.5:1.5～2.5:5.5～6.5,投料比为W滤渣：W丙酮复合溶媒＝1:3.5～5.5；

3)将上述浸提浓缩液同滤液混合，经大孔树脂吸附、丙酮水溶液解析、减压浓缩得到腺苷钴胺解析浓缩液；

4)在腺苷钴胺解析浓缩液加入氰胺水溶液进行转化，之后二次絮凝沉淀、过滤得到维生素B12过滤液，所述转化是指在30～35℃温度条件下，在腺苷钴胺解析浓缩液中加入质量浓度40～45％的氰胺水溶液，搅拌反应90～120min，氰胺加入量为W腺苷钴胺解析浓缩液：W氰胺＝1:0.028～0.029；

5)在维生素B12过滤液加入丙酮结晶，抽滤，干燥即可得到维生素B12粗品。

2.按照权利要求1所述的维生素B12粗品的制备方法，其特征在于，过程2)中，采用丙酮复合溶媒浸提2～3次，每次3～5小时。

3.按照权利要求1所述的维生素B12粗品的制备方法，其特征在于，过程4)中，所述二次絮凝沉淀、过滤是指在转化反应液中，加入0.1～0.3％(w/v)聚合硅酸铝铁，搅拌15～20min，然后依次经板框过滤、液体过滤器过滤。

4.按照权利要求1所述的维生素B12粗品的制备方法，其特征在于，过程5)中，所述丙酮结晶是指在维生素B12过滤液中加入其体积8～10倍的丙酮。