CN101974075A - 从发酵技术培养物中提取多粘菌素b、e的方法 - Google Patents

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常晓菲
张利强
于雪梅
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Abstract

一种从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，在0-25℃条件下将发酵技术培养物用碱性物质调节pH值至10.0-14.0后搅拌30分钟；固液分离收集菌渣得到多粘菌素B、E游离碱沉淀；将通过固液分离技术得到的游离碱沉淀用酸性物质或溶液调节pH值至1.0-6.0，待多粘菌素B、E游离碱沉淀溶解后，经固液分离得到多粘菌素B、E盐的浓缩液，经纳滤去除无机盐，最后喷干得到成品。本发明以简便、高效从发酵液中提取多粘菌素B、E为特征，解决了其它提取方法生产过程中劳动强度高、工序长、提取收率低造成的生产成本较高的问题，具有不使用溶媒、成本低、环保、收率高、对发酵液及设备的特性要求低的特点。

Description

从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法
技术领域：
本发明涉及一种从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法。
背景技术：
多粘菌素也称硫酸粘菌素，英文通用名：Polymyxin BSulfate，分子式：C56H98N16O13H2SO4，分子量：1301.56。
多粘菌素是1947年发现由多粘杆菌(Bacillus polymyxa)所产生，由多种氨基酸和脂肪酸组成的一族碱性多肽类抗生素的总称，不同菌种所产生的多粘菌素，由于所含氨基酸和脂肪酸的不同，又分为多粘菌素A、B、C、D、E、M。多粘菌素B(polymyxin B)又分为B1和B2，多粘菌素E(polymyxin E，colistin，)又分为E1和E2，多粘菌素M又称多胜菌素甲，多粘菌素B和多粘菌素E二者具有相似的药理作用，应用较广，多粘菌素B多用于人用药，多粘菌素E多用于兽用药。
本品为抗革兰氏阴性杆菌的抗生素，对大多数的革兰氏阴性杆菌有较强的抗菌作用，对绿脓杆菌的作用更为显著，对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、流感杆菌、百日咳杆菌、产气杆菌及肺炎杆菌等也有良好的作用。多粘菌素对生长繁殖期和静止期的细菌都有效，其杀菌作用机制是改变细菌细胞的渗透性。多肽类抗生素具有表面活性，因其中含有亲脂性官能基团(带阳电荷的游离氨基)，可引入脂蛋白，和细胞膜磷脂中的磷酸根结合，使细菌合成的胞浆膜的成分发生改变，细胞膜表面积增大，破坏了原来胞浆膜的屏蔽功能，使其通透性增加，导致细胞内成分大量外漏而死亡。细菌对本品不易产生耐药性。口投消化道不易吸收，排泄迅速，毒性小，无副作用，多粘菌素E是最安全的禽畜促生长抗生素之一。同时多粘菌素B及其类似结构物被发现具有抗内毒素作用(CN1583245、CN1493368、WO2006/108586、WO2006/112934)引起了广泛关注。
多粘菌素已通过由枯草芽孢杆菌经生物发酵产生，多粘菌素B的发酵单位一般可以达到1g-2g/L。通过适当的抗生素提取技术就可以从多粘菌素发酵液中分离纯化出多粘菌素。US2565057公布了通过活化活性炭的特征吸附来获得多肽类抗生素的方法。通过调节pH值，酸性条件下吸附杂质，调节pH值中性条件下吸附产品，最后用丙酮解析。该提取方法由于活性炭的吸附选择性较差，造成收率损失，且成品含量较低。同时活性炭的大量使用不利于工业扩大化生产。
专利GB742589、GB782926、WO2007/142611等都涉及到用树脂提取分离多粘菌素B、E的方法。专利GB742589、GB782926公布的方法为：滤液用弱酸性阳离子树脂吸附，通过pH3-5水溶液来解析，继续用阴离子树脂或强酸性阳离子树脂来纯化。专利WO2007/142611涉及到用非离子聚苯乙烯树脂来吸附滤液，用有机溶剂的水溶液来解析。由于多粘菌素类抗生素发酵单位较低，树脂法生产存在工时过长、吸附收率难以提高等缺点，提高了该产品的生产成本。
专利GB9798887公布的方法为通过反应萃取到有机溶剂(如二辛脂、二壬酯)中，达到分离富集的目的。此操作需在滤液pH7.0条件下进行，此时产品的稳定性差，生产收率较低，且由于运用到有机溶媒，增加了环保费用，对产品质量也有一定的影响。
专利CN1583245涉及到一种用泡沫分离的方法从多粘菌素E的发酵液中提取分离的方法。该方法的使用局限性较大，对发酵液质量有较高的要求。同时劳动生产率较低，不利于生产的连续操作。且泡沫分离机的使用也提高了产品的成本。
发明内容：
本发明的目的是提供一种从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，以简便、高效从发酵液中提取多粘菌素B、E为特征，解决了其它提取方法生产过程中劳动强度高、工序长、提取收率低造成的生产成本较高的问题，是一种经济、绿色环保的适于产业化生产的提取方法。
本发明的目的是以如下方式实现的：本发明以通过工业上常用的微生物培养手段培养可以生产多粘菌素B、E的芽孢杆菌的发酵液或发酵液经预处理后的产物为对象，经过一定的工序及工艺条件后得到多粘菌素B、E成品。该方法包括：发酵技术培养物直接碱化；固液分离收集菌渣；然后调节pH值至1.0-6.0使多粘菌素B、E从菌渣中溶解；然后通过纳滤浓缩去除无机盐；然后喷干得到成品。具体方法如下：
在0-25℃条件下将发酵技术培养物用碱性物质调节pH值至10.0-14.0后搅拌30分钟；固液分离收集菌渣得到多粘菌素B、E游离碱沉淀，固液分离采用一般抗生素提取纯化专业技术人员所能利用的固液分离方法，如板框过滤、重力离心、离心过滤、错流过滤等；将通过固液分离技术得到的游离碱沉淀用酸性物质或溶液调节pH值至1.0-6.0，待多粘菌素B、E游离碱沉淀溶解后，选用任一种常规的固液分离方法，如离心过滤、抽滤、板框过滤等将溶解液进行固液分离得到多粘菌素B、E盐的浓缩液，为提高色泽度可以通过加入0.06-0.1％(W/V)的高锰酸钾搅拌30分钟对得到的浓缩液进行脱色处理，然后经纳滤去除无机盐，最后喷干得到成品。
多粘菌素B、E发酵技术培养物包括多粘菌素B、E发酵液、多粘菌素B、E发酵液通过固液分离技术得到的上清液，优选多粘菌素B、E发酵液。
碱性物质为工业上常用的碱性物质，包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨水。
固液分离收集菌渣得到多粘菌素B、E游离碱沉淀以5-10倍游离碱沉淀体积的无盐水洗涤2-4次后再加入酸性物质或溶液调节pH值。
将发酵技术培养物用碱性物质调节pH值优选12.5-13.5。
将发酵技术培养物用碱性物质调节pH值至10.0-14.0时的温度优选5-15℃。
酸性物质为工业上常用的酸性物质，包括硫酸、磷酸、草酸、盐酸。
用酸性物质调节溶液pH值优选3.0-4.5。
本发明以简便、高效从发酵液中提取多粘菌素B、E为特征，解决了其它提取方法生产过程中劳动强度高、工序长、提取收率低造成的生产成本较高的问题，具有不使用溶媒、成本低、环保、收率高、对发酵液及设备的特性要求低的特点。
具体实施方式：
实施例1
多粘菌素B发酵液3.0L含量1.7g/l。先将发酵液降温至15℃；再用4mol/L的KOH溶液调节pH至12.5后搅拌30分钟并保持温度15℃；将碱化的发酵液在3000转速下离心15分钟后，收集离心物，以60ml无盐水洗涤两次后，然后用1.0mol/L的HCL溶液调节上清液pH至3.0-4.0使多粘菌素B沉淀溶解；抽滤溶解液，得到浓缩液加0.08％高锰酸钾搅拌30分钟，抽滤所得脱色浓缩液，纳滤处理，所得除盐的浓缩液喷干进风温度120℃，出风温度80℃，得多粘菌素B盐酸盐4.10克，含量80.5％。
实施例2
多粘菌素B发酵液4.0L含量1.5g/l。先将发酵液降温至20℃；再用4mol/L的NaOH溶液调节PH至13.5后搅拌30分钟并保持温度20℃；将碱化的发酵液在3000转速下离心20分钟后，收集离心物，以75ml无盐水洗涤两次后，然后用1.0mol/L的H2SO4溶液调节上清液pH至3.0-4.0使多粘菌素B沉淀溶解。抽滤溶解液，得到浓缩液加0.07％高锰酸钾搅拌30分钟，抽滤所得脱色浓缩液，纳滤处理得到除盐的浓缩液，喷干进风温度120℃，出风温度75℃，得多粘菌素B硫酸盐4.76克，含量80.0％。
实施例3
多粘菌素E发酵液3.0L含量5g/l。先将发酵液降温至20℃；再用4mol/L的NaOH溶液调节pH至11.O后保持温度20℃搅拌30分钟；将碱化的发酵液在3000转速下离心15分钟后，收集离心物，以100无盐水洗涤三次后，然后用1.0mol/L的H2SO4溶液调节上清液pH至3.0-4.0使多粘菌素E沉淀溶解；抽滤溶解液，得到浓缩液加O.1％高锰酸钾搅拌30分钟，抽滤所得脱色浓缩液，纳滤处理得到除盐的浓缩液，喷干进风温度110℃，出风温度75℃，得多粘菌素E硫酸盐13克，含量81.5％。

Claims (8)

1.一种从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于：在025℃条件下将发酵技术培养物用碱性物质调节pH值至10.0-14.0后搅拌30分钟；固液分离收集菌渣得到多粘菌素B、E游离碱沉淀；将通过固液分离技术得到的游离碱沉淀用酸性物质或溶液调节pH值至1.0-6.0，待多粘菌素B、E游离碱沉淀溶解后，经固液分离得到多粘菌素B、E盐的浓缩液，经纳滤去除无机盐，最后喷干得到成品。
2.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于：多粘菌素B、E发酵技术培养物包括多粘菌素B、E发酵液、多粘菌素B、E发酵液通过固液分离技术得到的上清液。
3.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于：碱性物质为工业上常用的碱性物质，包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨水。
4.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于：固液分离收集菌渣得到多粘菌素B、E游离碱沉淀以5-10倍游离碱沉淀体积的无盐水洗涤2-4次后再加入酸性物质或溶液调节pH值。
5.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于：将发酵技术培养物用碱性物质调节pH值为12.5-13.5。
6.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于：将发酵技术培养物用碱性物质调节pH值至10.0-14.0时的温度保持在5-15℃。
7.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于：酸性物质为工业上常用的酸性物质，包括硫酸、磷酸、草酸、盐酸。
8.根据权利要求1所述的从发酵技术培养物中提取多粘菌素B、E的方法，其特征在于：用酸性物质调节溶液pH值为3.0-4.5。
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