CN101709072B

CN101709072B - 一种纳他霉素提取纯化方法

Info

Publication number: CN101709072B
Application number: CN2009102227926A
Authority: CN
Inventors: 江正兵; 宋慧婷; 马立新
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2008-03-11
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2028-03-11
Also published as: CN101709072A

Abstract

本发明提出了一种纳他霉素发酵培养生产中的提取纯化工艺方法，其步骤为：(1)将富含纳他霉素的发酵液，进行弱酸性分离沉淀；(2)对沉淀稀释；(3)在酸性条件下溶解；(4)过滤取上清液；(5)调回到中性结晶；(6)分离干燥，得到纳他霉素产品。本发明是先将原本酸性发酵液调节至弱酸性，使纳他霉素附着与菌体，收集菌体后在酸性环境下用甲醇溶解纳他霉素，这样避免了甲醇和酸碱的大量使用，而且提高了提取的得率和纯化的纯度。本发明综合利用有机溶剂、pH值调节和温度控制的方法，并采用残液套用二次提取、二级纯化的方法，实现纳他霉素的高效提取和纯化，提取得率达到90％，纯度达到95％。本发明能够实现纳他霉素的低成本、高产量、高品质的生产。

Description

一种纳他霉素提取纯化方法

本申请是名称为“纳他霉素高产菌株的选育及纳他霉素高效发酵提取纯化方法”、申请号为200810047019.6、申请日为20080311专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及纳他霉素发酵提取纯化的工艺方法，属于工业微生物技术领域。

背景技术

纳他霉素(Natamycin)也称游链霉素(Pimaricin)，是一种重要的多烯类抗菌素，该抗菌素是一种很强的抗真菌试剂，由于它能够专一性的抑制酵母菌和霉菌，阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成。1955年Struyk等人从南非Natal州Pietermaritzburg镇附近的土壤中分离得到纳塔尔链霉菌Streptomyces natalensis，并从中首次分离得到了纳他霉素。现在可由Streptomyces natalensis和StrePtomyces chatanoogensis等链霉菌发酵经微生物发酵生产。

纳他霉素外观白色(或奶油色)，为无色、无味的结晶粉末，分子量为665.73，结构式如下图。纳他霉素是一种两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5，熔点为280℃。微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂。室温下在水中的溶解度为30～100mg/L。在pH值高于9或低于3时，其溶解度会有所提高，在大多数食品的pH范围内非常稳定。纳他霉素具有一定的抗热处理能力，在干燥状态下相对稳定，能耐受短暂高温(100℃)。

纳他霉素结构式

Natamycin作为食品防腐剂、添加剂广泛应用于乳制品生产、果蔬汁生产、肉制品加工、焙烤类食品以及饲料加工等许多领域，因其抗真菌也广泛应用于医药领域，具有良好的应用前景。限制Natamycin广泛应用的主要问题是其较高的生产成本和昂贵的价格。

纳他霉素在通常条件下不溶于水，常用一些有机溶剂进行提取，如美国专利3,892,850、WO92/07998、WO92/1058中均采取有机溶剂提取的方法。这些方法需要使用甲醇、异丙醇等易燃、易挥发的有机溶剂，势必导致较高的溶剂损耗、回收费用以及较高的安全设施要求、高昂的环保费用。而且甲醇的使用，容易导致纳他霉素甲酯这种副产物的产生，从而影响产品的纯度。在中国国家专利CN101062934A中，公开了一种不使用有机溶剂从发酵液中提取纳他霉素的方法。该专利是利用纳他霉素在不同pH条件下的水溶液中溶解度不同的性质，来实现纳他霉素的提取。在其碱化过程中，发酵液的pH值均要求在11以上，这样势必使用大量的碱液来调节原本显酸性的发酵液。该方法虽然避免了有机溶剂的使用，但大量酸碱的使用同样会带来不可预知的环保问题和酸碱的消耗、回收问题。另外，由于发酵液中纳他霉素的含量较低，这些方法在进行提取前都需要进行发酵液的浓缩处理，以提高提取得率及纯度，这样势必增加生产中的能耗。

常规的采用甲醇提取纳他霉素的步骤为：浓缩发酵液→加入甲醇，升高pH值(10以上)→去除菌丝体→降低pH值(7.0左右)，蒸发甲醇→回收沉淀、干燥得产品。这种工艺是升高发酵液的pH值至碱性，再用甲醇溶解纳他霉素，去菌体后降低pH得到纳他霉素沉淀。虽然发酵液经过浓缩，但体积仍然较大，酸碱和甲醇的用量较大。

发明内容

本发明的目的是提出一种污染小、能耗低、提取得率高的纳他霉素发酵培养生产中提取纯化的工艺方法，从而实现纳他霉素的低成本、高产量、高品质的生产。

本发明的纳他霉素提取及纯化工艺如下：

1.将纳他霉素发酵培养生产中产生的富含纳他霉素的发酵液，进行弱酸性分离沉淀。将发酵液用NaOH调节pH值至6.0(弱酸性)，并在50℃保温10～12小时。离心去除上清，保留沉淀，或板框过滤去除部分水份。

2.稀释。测定上述保留的沉淀或滤渣中水分含量，用甲醇/水溶液悬浮沉淀，使甲醇与水(包括沉淀或滤渣中残存的水)的比例为65/35(v/v)，降温至5～10℃。

3.酸性条件下溶解。将上述悬浮液用HCL调节pH值至3.0，在5～10℃条件下，搅拌30～50分钟，使纳他霉素完全溶解。

4.过滤取上清液。将第3步中的悬浮液离心或板框过滤，保留上清。将沉淀或滤渣用甲醇/水溶液(70/30，v/v)洗涤，保留上清，并与第一次上清合并，以提高纳他霉素得率。

5.调回到中性结晶。用NaOH将第4步中的上清液pH调节至7.0，并室温孵育16～20小时，使纳他霉素完全结晶，溶液残存纳他霉素应低于1.5g/L。

6.分离干燥。离心或板框过滤收集纳他霉素晶体，水洗两次后真空干燥或其他方式去除水分，使水分含量低于9％，得到纳他霉素产品。纳他霉素一次提取得率到达85％，纯度达到90％。将5中的残液收集后二次提取，总得率达到90％；二级纯化可使纯度达到95％。

本发明在利用高产菌株发酵，得到高含量纳他霉素发酵液的基础上，综合利用有机溶剂、 pH值调节和温度控制的方法，并采用残液套用二次提取、二级纯化的方法，实现纳他霉素的高效提取和纯化，提取得率达到90％，纯度达到95％。本发明是先将原本酸性发酵液调节至弱酸性，使纳他霉素附着与菌体，收集菌体后在酸性环境下用甲醇溶解纳他霉素，这样避免了甲醇和酸碱的大量使用，而且提高了提取的得率和纯化的纯度。

具体实施实方式：

实施例1：10L发酵罐发酵、及纳他霉素提取纯化

将纳他霉素菌种分别在1L摇瓶、1L发酵罐、5L发酵罐进行种子液的逐级放大培养，各级培养时间分别为12小时、16小时和26小时，获种子液1L，种子液最终pH值为4.7。在10L发酵罐中装入发酵培养基5L(大豆蛋白粉，38g/L；酵母粉，8g/L；葡萄糖，40/L)，接入种子液1L，发酵过程共流加60％葡萄糖2.6L。通过转速和通气量控制溶氧在20％～30％之间，发酵周期144小时(6天)，最终发酵液体积7.8L，生物量45.3g/L，纳他霉素含量13.8g/L。本发明采用的菌种是保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M208028的纳他霉素高产菌株Streptomyces gilvosporeus HBJ591。

将上述7.8L发酵液按提取、纯化工艺进行提取，一次性提取得到纳他霉素产品92.3g，提取得率为85.7％。经在酸性环境下重新溶解、结晶进行二级纯化后纯度为93.8％。

实施例2：30L发酵罐发酵、及纳他霉素提取纯化

将纳他霉素菌种(采用菌种与实施例1相同)分别在1L摇瓶、5L发酵罐、10L发酵罐进行种子液的逐级放大培养，各级培养时间分别为12小时、18小时和24小时，获种子液4L，种子液最终pH值为4.6。在30L发酵罐中装入发酵培养基20L(大豆蛋白粉，40g/L；酵母粉，8g/L；葡萄糖，45/L)，接入种子液4L，发酵过程共流加60％葡萄糖8.2L。通过转速和通气量控制溶氧在20％～30％之间，发酵周期150小时，最终发酵液体积25.3L，生物量46.1g/L，纳他霉素含量15.1g/L。

将25.3L发酵液按上述提取、纯化工艺进行提取，一次性提取得到纳他霉素产品330.3g，提取得率为87.5％。经在酸性环境下重新溶解、结晶进行二级纯化后纯度为94.5％。

实施例3：100L发酵罐发酵、及纳他霉素提取纯化

将纳他霉素菌种(采用菌种与实施例1相同)分别在1L摇瓶、10L发酵罐、30L发酵罐进行种子液的逐级放大培养，各级培养时间分别为12小时、18小时和26小时，获种子液14L，种子液最终pH值为4.6。在100L发酵罐中装入发酵培养基70L(大豆蛋白粉，38g/L；酵母粉，8g/L；葡萄糖，45/L)，接入种子液14L，发酵过程共流加60％葡萄糖26.7L。通过转速和通气量控制溶氧在20％～30％之间，发酵周期158小时，最终发酵液体积87.4L，生物量45.8g/L，纳他霉素含量14.8g/L。

将85L发酵液按上述提取、纯化工艺进行提取，一次性提取得到纳他霉素产品1093.2g，提取得率为86.9％。经在酸性环境下重新溶解、结晶进行二级纯化后纯度为93.6％。

Claims

1.一种纳他霉素提取纯化工艺方法，其特征在于步骤为：

(1)将纳他霉素发酵培养生产中产生的富含纳他霉素的发酵液，进行弱酸性分离沉淀----将发酵液用NaOH调节pH值至6.0，并在50℃保温10～12小时；离心去除上清液，保留沉淀，或板框过滤去除部分水份；

(2)稀释----测定沉淀或滤渣中水分含量，用甲醇/水溶液悬浮沉淀，使上述甲醇与水的比例稀释为65/35，v/v，降温至5～10℃；

(3)酸性条件下溶解----将上述悬浮液用HCl调节pH值至3.0，在5～10℃条件下，搅拌30～50分钟，使纳他霉素完全溶解；

(4)过滤取上清液----将第(3)步中的悬浮液离心或板框过滤，保留上清液；将沉淀或滤渣用比例为70/30，v/v的甲醇/水溶液洗涤，保留上清液，并与第一次上清合并，以提高纳他霉素得率；

(5)调回到中性结晶----用NaOH将第(4)步中的上清液pH调节至7.0，并室温孵育16～20小时，使纳他霉素完全结晶，溶液残存纳他霉素应低于1.5g/L，残液收集后二次提取；

(6)分离干燥----离心或板框过滤收集纳他霉素晶体，水洗两次后真空干燥或其他方式去除水分，使水分含量低于9％，得到纳他霉素产品。