CN102885056A - 一种纳他霉素制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳他霉素制剂及其制备方法，该制剂由以下方法制备：采用免提炼方法分离纳他霉素发酵原液，将得到的纳他霉素发酵原液的浓缩液或滤饼加或不加农药助剂，混合均匀，得到纳他霉素制剂，或将得到的浓缩液或滤饼与其他活性成分、加或不加农药助剂混合均匀，制成复配剂。本发明提出了直接将纳他霉素生产菌种的菌丝体加以干燥、膨化和粉碎的免提炼工艺，生产专用于饲料防霉和适用于田间当农药使用的纳他霉素制剂。此种免提炼纳他霉素制剂生产工艺由于过程简单，不使用有机溶剂，所需设备少，所以成本低、收率高、无废渣，同时产品的闪点高，易于贮藏、运输，安全环保，生态有益。

Description

一种纳他霉素制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纳他霉素制剂及其制备方法。

背景技术

纳他霉素(Natamycin)也称游链霉素、匹马菌素或海松素，是一种重要的多烯大环内酯类抗生素。该抗生素是一种很强的抗真菌试剂，能有效的抑制酵母菌等真菌的生长，有些真菌能产生真菌毒素(Mycotoxins)，真菌毒素对人体有致癌、致畸、致震巅、致出血、致皮炎等作用。因此，纳他霉素用于食品防腐不仅可以解决食品腐败，还能减少真菌毒素对人体的毒害，与其他抗菌成分相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，可以广泛应用于真菌引起的疾病，除此之外，由于纳他霉素的溶解度低，可用其对食品的表面进行处理以增加食品保质期却不影响食品的风味和口感。目前，纳他霉素作为一种天然的生物防腐剂已经被批准用于某些乳制品、肉类、饮料。

但是由于纳他霉素的生产成本很高，所以商业化应用受到了极大的限制。其生产成本高，并不是它的发酵水平不够高，而是提炼工艺复杂，提取收得率低所造成的。

已知纳他霉素可由三种链霉素发酵产生，他们是褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)、恰塔努加链霉菌(Streptomyceschattanoganis)和纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)，中国的纳他霉素生产企业多数是以褐黄孢链霉素的不同生产菌株进行生产。

纳他霉素从发酵原液中提炼出来的过程通常包括用有机溶媒如甲醇、异丙醇从浓缩法或板框压滤法得到的菌丝体中浸提出素来，如美国专利3892850、WO92/07998、WO92/1058、中国专利CN1891709A等；随后进行蒸馏，脱去大部分有机溶剂，再经除蛋白杂质、脱色、沉淀等过程将浸提出的纳他霉素提纯为初提物。此种初提取物再用离子交换或其它方法进一步纯化，最后通过结晶，得到纯度大于92％的纳他霉素晶体。将纳他霉素晶体加上食盐或者乳糖或者其它糖类物质，经混合粉碎，形成纳他霉素制剂。

整个纳他霉素制剂生产过程繁杂，周期长，有机溶剂与酸、碱消耗多，且纳他霉素的失活率高，总收得率往往低于70％，甚至低于50％。

专利CN101307299和CN101709072A公开从纳他霉素发酵液中高效提取纯化纳他霉素的工艺方法，其步骤为：(1)将富含纳他霉素的发酵液，进行弱酸性分离沉淀；(2)对沉淀稀释；(3)在酸性条件下溶解；(4)离心或板框压滤取上清液；(5)滤清液调回到中性结晶；(6)分离干燥，得到纳他霉素产品。这两个专利公开了纳他霉素的水提法，是目前行业内广泛采用的甲醇浸提法的简化，主要利用纳他霉素在中性和弱酸性水中溶解度低，将纳他霉素沉淀出来，然后在强酸性水中令粗提取物溶解、过滤去杂质后在中性水中结晶。由于纳他霉素在强酸性水中溶解度并不大，所以酸性条件下溶解的损失是可想而知的。根据发明人大量的研究结果证明，这两个专利所述的水提取法总收得率很低，而且比甲醇法低很多。若用此法生产饲料防霉和农药用纳他霉素制剂，其成本必然不能得到市场的认同。

专利CN101693732A公开了采用5个步骤提取纳他霉素的方法，包括：(1)调节发酵液的ph值，过滤收集固体和过滤液备用；(2)洗涤收集到的固体，过滤，分别收集固体和过滤液，固体中再加入一定量的有机溶剂，搅拌均匀，浸泡。(3)调节上述溶液的PH值，过滤，收集上清液；(4)将上清液通过离子交换树脂柱进行吸附，吸附后的上清液收集备用；用有机溶剂洗离子交换树脂柱，收集洗脱液，调节ph值，浓缩，收集固体；(5)用纯净水洗涤收集到的固体，洗涤完的水收集备用，固体干燥后即得纳他霉素。该专利公开的是将有机溶媒提取法、水提法和离子交换法等三种常见的纳他霉素提取纯化方法各取一段组合而成的一种纳他霉素提取工艺。由于在提取的第一步通过过滤的方法将发酵液中的固液进行了初步分离，然后用离子交换的办法将滤液中残留的纳他霉素收集起来。这样设计的优点是可以提高素的收率，减少素的损失；缺点是要对大于发酵液体积的液体进行反复处理，消耗酸多，占用的提取罐多，操作成本高、工作量大。离子交换法是会消耗大量酸碱及有机溶媒，不仅污染环境而且收率不高。总之，对纳他霉素工业化生产来说该专利所述的提取工艺是一种步骤复杂、工作量大、污染大、最终收率也不很高的提取方法。

专利CN101062934A虽然不用大量有机溶剂进行菌丝体浸提，而是用NaOH、KOH或氨水将发酵培养物调成强碱性(如pH 10.0-14.0)，然后固液分离收集滤液后，活性炭脱色，再通过回调pH至5.0～9.0，让纳他霉素结晶，以无盐水洗沉淀数次得到纯度大约80％的粗结晶。从该专利公开的数据推算，其粗晶体的收得率为68.0％，晶体纯度82.4％。为达到食品级纳他霉素制剂的要求，这种粗晶体还需要继续纯化、再结晶，其总收率最终会降到60％以下。

美国专利WO97/29207也公开过一种不用有机溶媒提取纳他霉素的方法，该法是用物理的或者化学的方法在发酵液中破碎菌丝体细胞，令发酵液中的纳他霉素固体悬浮在水中，然后采用重力梯度离心技术使纳他霉素与细胞碎片分离得到纳他霉素产品。该方法虽然不用有机溶剂，但由于发酵液中的纳他霉素固体大小不一，而且一部分纳他固体与菌细胞残片混在一起，不易分开。这种方法提取纳他霉素的损失率很高，设备投资大，并且很难实现规模化商品化生产。

根据已查阅的文献资料，所有纳他霉素提炼工艺都是以食品防腐剂生产为最终目的的。虽然有少数专利中偶尔提到纳他霉素可以用于饲料防霉，但因为成本问题，未见到生产低成本的饲料防霉专用纳他霉素制剂的生产方法及相关报道，也未见有人公开低成本的纳他霉素农药制剂生产方法。要做到低成本，而且是低到农民可接受，可与化学防霉剂竞争的程度(一吨饲料的防霉变成本应控制在2-3元人民币)只有采用免提炼直接生产制剂的工艺才是最佳选择。

因此，本发明人致力于纳他霉素从发酵液直接制剂化的生产工艺研究，形成了以水为分散介质的纳他霉素干混悬剂、胶悬剂以及六种免提炼直接制剂化的纳他霉素制剂生产方法。

发明内容

本发明是提供一种专门用于生产饲料防霉剂和农药杀真菌剂的纳他霉素制剂及其制备方法。

本发明提供的纳他霉素制剂，由以下方法制备：采用免提炼方法分离纳他霉素发酵原液，将得到的纳他霉素发酵原液的浓缩液或滤饼加或不加农药助剂，混合均匀，得到纳他霉素制剂，或将得到的浓缩液或滤饼与其他活性成分、加或不加农药助剂混合均匀，制成复配剂。

所述免提炼方法为离心或压滤，其中压滤为板框压滤。

优选地，该制剂的制备方法包括以下步骤(简称为方法1)：

1)发酵原液调pH：将纳他霉素发酵原液的温度降到10℃，边加碱溶液边将发酵原液的pH值调节至5.5-7.0；

2)板框压滤：对调节pH值后的发酵原液板框压滤；

3)闪蒸干燥：将滤饼闪蒸干燥，得到含水量小于15％；

4)膨化处理：对闪蒸干燥的物料进行膨化处理；

5)气流粉碎：将膨化后的物料加入气流粉碎机中粉碎，细度达到425目即可，加入农药助剂，混合均匀，即得纳他霉素粉剂或干混悬剂。

进一步优选，该制剂的制备方法包括以下步骤：

1)发酵原液调pH：将纳他霉素发酵原液的温度降到10℃，边加碱溶液边将发酵原液的pH值调节至5.5-7.0；

2)板框压滤：对调节pH值后的发酵原液按公知的方法进行板框压滤；

3)闪蒸干燥：将滤饼放入快速旋转式闪蒸干燥机中，闪蒸机温度设定为140～180℃，时间控制在30秒以内，控制干物料含水量小于15％，然后快速将物料温度降到50℃以下；

4)膨化处理：将闪蒸干燥的物料加入饲料挤压膨化机中，料温控制在180℃以下，膨化时间控制在30秒之内，膨化过的物料尽快降温到室温；

5)气流粉碎：将膨化后的物料加入喷射式气流粉碎机中粉碎，细度达到425目即可，加入农药助剂，即得纳他霉素粉剂或干混悬剂。

上述方法1中，所述步骤1)还包括按照发酵原液与絮凝剂的重量比为1000∶1，将调节pH值后的发酵原液中加入絮凝剂，絮凝1～2小时；所述步骤4)可替换为：4)初级粉碎：将闪蒸干燥的物料用常规粉碎机粉碎到100目。

优选地，本发明提供的制剂的制备方法还包括以下步骤(该方法简称为方法3)：

1)两级离心分离：先用制冷机将发酵原液温度降到10℃，边加碱溶液边将纳他霉素的发酵原液的pH值调至5.5-7.0，然后按照发酵原液与絮凝剂的重量比为1000∶1加入絮凝剂，絮凝1～2小时，收集沉淀；将上部清液加入分离因素大于10000g的碟片式离心机中离心分离，得到重液，即“菌浆”；当碟片离心的轻液中纳他霉素含量大于500mg/L时，则须再通过分离因素大于20000g的管式离心机中离心分离，回收离心所得纳他霉素的沉淀，然后将菌浆与二次的沉淀混合均匀，得到混合浆液；

2)胶体磨研磨：将步骤1)得到的混合浆液输入胶体磨中进行研磨，细度要求在80-100目筛；

3)砂磨研磨：将步骤2)得到的物料经过三级砂磨，磨成胶体状；

4)调配：加入农药助剂，或者加入农药助剂和其他活性成分，充分混合均匀；

5)第二次过胶体磨：通过胶体磨将调配好的物料再次研磨，得到纳他霉素农药制剂或复配剂。

优选地，本发明包括以下步骤(该方法简称为方法4)：

1)发酵原液调pH：用制冷设备将料温降到10℃左右，再用少量碱液将纳他霉素发酵原液调节pH值为5.5-7.0，加壳聚糖(壳聚糖用量为发酵原液的0.1％(W/W)左右)，搅匀，静置一定时间；

2)板框压滤：将絮凝的发酵液泵入板框进行压滤，得滤饼；

3)胶体磨研磨滤饼：将滤饼放入胶体磨中，研磨时加压滤出的滤液，调整到胶体磨磨出的浆液中含固体的量≤20％；

4)砂磨、调配：加入农药助剂，加或不加预先溶于水的其他活性成分，混合均匀后，经过三级砂磨机研磨成胶体状，其中其他活性成分为井冈霉素或春雷霉素，然后用高速混合机混匀，即得纳他霉素制剂或复配剂。

上述方法4中，步骤3)和4)可替换为：3)用胶体磨研磨滤饼：滤饼在剪切机中打散，并加滤液到滤饼中，调整到胶体磨磨出的浆液中含固量≤20％，经二次胶体磨研磨；4)调配、高压均质：加入农药助剂，加或不加其他活性成分，高压均质破壁二轮，第1轮20mpa，第2轮20-40mpa，即得纳他霉素制剂或复配剂(简称方法5)。

上述方法4中，步步骤3)和4)替换为：3)剪切：滤饼和农药助剂，通过剪切机械剪切；4)调配和砂磨：加入农药助剂，加或不加其他活性成分，然后进行三级砂磨机砂磨，然后用高速混合机混匀，即得纳他霉素制剂或复配剂。(简称方法6)

本发明还提供了一种制备上述纳他霉素制剂的方法，包括以下步骤：采用免提炼方法分离纳他霉素发酵原液，将得到的纳他霉素发酵原液的浓缩液或滤饼加或不加农药助剂，混合均匀，得到纳他霉素制剂，或将得到的浓缩液或滤饼与其他活性成分、加或不加农药助剂混合均匀，制成复配剂。

在上述制剂、制备方法中：

所述纳他霉素原液是指由褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoganis)或纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)发酵生产的原液(原液中纳他霉素的含量大于4500g/L)；

制备成的纳他霉素粉剂中含纳他霉素的量为1.0-70％，优选为10-50％；

所述碱溶液为1％-10％浓度的Ca(OH)₂水溶液或NaOH水溶液；

所述pH值优选为6.0；

所述农药助剂选自分散剂、润湿剂、填充剂、稳定剂、增稠剂、防腐剂或防冻剂中的一种或几种；

所述其他活性成分为井冈霉素A或春雷霉素；

所述分散剂选自甲基纤维素(MC)、羧甲基纤维素(CMC)/羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、西黄蓍胶、水解淀粉、乙氧基丙氧衍生物、苯氧基酚磷酸酯、月桂醇聚氧乙烯醚、三聚氰胺树脂、乙二醇或硅酸镁铝中的一种或几种；

所述润湿剂选自烷基苯磺酸盐、三苯乙烯苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯、烷基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚及其硫酸盐中的一种或两种。

所述填充剂选自沸石粉、麸皮、硅藻土、高岭土或白炭黑中的一种或多种；

所述稳定剂为乳糖、蔗糖、预胶化淀粉、水解淀粉或糊精中的一种或几种；

所述增稠剂选自海藻酸钠、黄原胶、聚乙烯醇(PVA)；

所述防冻剂选自丙二醇、乙二醇或甘油中的一种或几种。

本发明还提供了纳他霉素制剂在制备饲料防霉和农作物防治真菌病害的药物中的应用。

本发明提供的方法具有以下优点：

1、纳他霉素是一种高效、广谱的抗真菌抗生素，在食品、饮料、医药等领域已经得到广泛的应用。但是，由于纳他霉素提炼工艺复杂，提炼过程损失率高，从而导致产品生产成本高。本发明提出了免提炼工艺，直接将纳他霉素生产菌种的菌丝体浓缩或液固分离后进行制剂生产，制备纳他霉素粉和加入农药助剂采用常规方法制备成防治植物病原真菌的农药制剂，此种免提炼的纳他霉素制剂生产工艺过程简单，不使用有机溶剂，产品的闪点高，易于贮藏、运输，安全环保，生态有益；

2、本发明采取免提的工艺，从发酵原液出发直接进行制剂生产，生产工艺路线短，设备简单，固定资产投资少，收率高，无有机溶剂消耗，无废渣产生，设备简单，生产成本低。

3、纳他霉素产生菌将其合成的纳他霉素大部分贮存在菌丝细胞内。纳他霉素属于典型的多烯类抗菌素，其结构中多个烯键共轭，所以在光照下和有氧环境中分子结构不够稳定。要将这种抗菌素用于农田和仓库储藏物防霉时必须采取适当的保护措施，比如进行化学包被或微胶囊化。本专利申请的菌丝体直接制剂化方法利用了菌丝细胞对素的天然包被作用，可以省去制剂过程中包被和微囊化工序。这样不仅仅可以降低生产成本，提高使用效果和延长有效期，而且由于不使用化学包被的各种溶剂和药物，可以更好地保证制剂的安全性和环保性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中，所述物料的装载和运输均使用不锈钢设备；

所述井冈霉素A、春雷霉素等活性成分皆为公知的抗植物病原真菌农药的药；

所述纳他霉素原液可以采用公知的褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoganis)或纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)制备。本发明实施例中提供的菌种是褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)HBJ591菌株(中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M208028)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoganis)ATCC 13358菌株(中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号为CGMCC 4.1415)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)CBS 700.57菌株，上述菌株购自武汉乐立基生物科技有限公司。

实施例1：20％的纳他霉素粉剂

1、发酵原液：在10M³不锈钢发酵罐中，接种褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)HBJ591菌株，发酵生产纳他霉素，放罐体积为7.2M³，放罐效价12600mg/L；

2、发酵原液调pH值：先用制冷机将发酵液温度降到10℃，测得发酵液pH值为4.86，然后边加浓度为2％(W/V)的Ca(OH)₂水溶液边搅拌，调节发酵原液的pH值至6.0，加碱后控制物料温度为10℃；

3、板框压滤：物料打入板框进行板框压滤，用冷风吹滤饼2小时，去除上清液，收集滤饼；

4、闪蒸干燥：滤饼用人工适当打散投入闪蒸干燥机，闪蒸机温度为160℃，物料干燥的高温过程历时小于25秒钟，干燥至物料含水量小于10％，出料口用不锈钢斗车接料，并在斗外吹冷风快速将物料温度降到50℃以下；

5、膨化处理：冷却之后的闪蒸物料接着进挤压膨化机，膨化机中物料温度控制为170℃，时间为20秒，然后将膨化过的物料送至有冷风的缓冲室，待料温降至室温(25℃)；

6、气流粉碎：将冷却后的物料投入气流粉碎机的专用双锥混合机中，边混合边进行气流粉碎，通过控制分级轮转速保证粉碎细度425目以上；

7、粉剂：收集粉碎好的产品，并加入细度在38μm以下的饲料用沸石粉57.6kg，充分混合均匀，总共得到纳他霉素粉剂376.8kg。

8、检测：用HPLC检测粉剂中的纳他霉素含量为21.33％，纳他霉素总收率为88.47％。

实施例2：20％纳他霉素干混悬剂

1、发酵原液：按照实施例1制备褐黄孢链霉菌发酵原液，效价14400mg/L；

2、调节pH值：在3.2吨发酵原液中边加浓度为2％(W/V)的Ca(OH)₂水溶液边搅拌，调节发酵原液的pH值至5.5，然后加入了3.2kg壳聚糖进行絮凝，同时将料液温度降到10℃；

3、板框压滤：具体方法同实施例1的步骤3。

4、闪蒸干燥：方法同实施例1的步骤4，闪蒸干燥温度为170℃，干燥至物料含水量为9.2％；

5、初级粉碎：使用锤片式粉碎机在室温下将物料粉碎至100目，所得纳他霉素干粉中纳他霉素的含量为29.91％；取纳他霉素的干粉160kg，淀粉23kg，MC(甲基纤维素)4.6kg，沸石粉42.4kg，混合均匀。

6、气流粉碎：用喷射式气流粉碎机将步骤5得到的混合物进一步粉碎，达到成品细度98％过300目筛，得到纳他霉素干混悬剂230kg。

7、对本实施例产品进行检测，测定结果如下：

1)HPLC法检测，产品中含纳他霉素20.87％；

2)最终得到的干混悬剂流动性良好，粒度范围为4μm～8μm颗粒相对体积占78.8％；

3)40℃、75％湿度存放6个月以上测定，含量稳定，分散性能好。

实施例3：10％纳他霉素胶悬剂

1、发酵原液：按照实施例1的方法，用褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)HBJ591菌株发酵原液，发酵液效价13400mg/L；

2、发酵原液调pH值及两级离心：先用制冷机将发酵原液温度降到10℃，在7000kg发酵原液中边加浓度为2％的Ca(OH)₂水溶液边搅拌，将发酵原液的pH值调至6.5，然后加入7kg壳聚糖絮凝，搅拌，室温下静置1.5小时，然后收集沉淀，将上清液加入分离因素大于10000g的碟片式离心机中离心，得到菌浆(重液)；因为用碟片离心机离心后的轻液效价高于500mg/L，故而这些轻液通过分离因素大于20000g的管式离心机离心分离，进一步回收纳他霉素的沉淀，混匀菌浆和两次所收集的沉淀，得到混合浆液563kg；

3、胶体磨研磨：先将步骤4得到的混合浆液用胶体磨中研磨，细度要求过100目筛；

4、砂磨研磨：然后将步骤3得到的物料进行三级砂磨机研磨，磨成胶体状；

5、调配：将研磨后的胶体状物料装入带搅拌器的贮罐中，向贮罐中添加农药助剂：40.5kg乙氧基丙氧衍生物33号或34号(江苏省钟山石化生产)、24.3kg苯氧基酚磷酸酯601(江苏省钟山石化生产)、0.8kg黄原胶、8.1kg硅酸镁铝、81kg丙二醇、92.3kg水，共247kg，充分混合均匀；

6、第二次过胶体磨：将调配后的物料放入胶体磨中研磨，得到纳他霉素胶悬剂810kg。

7、检测：

1)用HPLC测得此批产品中纳他霉素含量为10.35％，纳他霉素总收率为89.38％；

2)纳他霉素胶悬剂中的悬浮率为90％；

3)有≥98％通过75μm筛。

实施例4：6.5％纳他·井冈胶悬剂制备(4％井冈霉素A+2.52％纳他霉素)

1、发酵原液：用恰塔努加链霉菌(S.chattanoganis)ATCC 13358菌株发酵纳他霉素原液6500L，发酵效价4810mg/L；

2、发酵原液调pH值及两级离心：先用制冷机将发酵液温度降到10℃，在上述发酵原液中边加浓度为2％的NaOH水溶液边搅拌，调节发酵原液的pH值至6.2，经过同实施例3的碟片离心机离心分离得到菌泥(重液)386kg，由于离心后的轻液中纳他霉素含量不到200mg/L，故轻液排入污水处理系统，不再用管式机离心；

3、调配、砂磨：将所得菌泥投入胶体磨内，然后加入井冈霉素A含量为7.5％的井冈霉素A溶液675kg，混匀，加入胶悬剂助剂组合：31.5kg月桂醇聚氧乙烯醚、19kg三苯乙烯苯酚聚氧乙烯醚磷酸酯、118kg乙二醇、12.5kg EO-PO嵌断共聚物、15kg烷基萘甲醛缩合物、1.5kg黄原胶、1.5kg苯甲酸钠共199kg，经过胶体磨研磨之后，将浆液先后送入三级砂磨机再反复研磨，共获得纳他·井冈胶悬剂1260kg。

4、检测：

1)经HPLC测定，复配剂中纳他霉素含量2.56％，井冈霉素A含量4.01％，总有效成份含量6.57％，悬浮率92％；

2)湿筛试验(通过75um筛)≥98％。

实施例5：5.5％纳他·春雷霉素胶悬剂(5％纳他霉素+0.5％春雷霉素)

1、发酵原液：用实施例1的方法发酵原液，菌株为纳塔尔链霉菌(S.natalensis)CBS 700.57菌株，得到发酵原液6600L，发酵效价6100mg/L；

2、发酵原液调pH值，两级离心：按实施例1、实施例3的方法调发酵原液的pH值和离心浓缩，由于碟片离心的轻液中纳他霉素含量不到200mg/L，故轻液不再进行管式离心，仅重液进行了管式离心，得到菌泥507kg；

3、砂磨研磨：将所得菌泥用第一级砂磨机研磨成浆，装入贮罐中，向贮罐中投入浓度为5.5％(g/g)春雷霉素水溶液61kg，搅拌均匀，再加入胶悬剂填料组合：0.7kg硅酸镁铝、46.9kg乙二醇、26.8kg月桂醇聚氧乙烯醚、10kg苯氧基酚磷酸酯、1.5kg苯甲酸钠、16.1kg水共102kg，再次搅拌均匀，复配浆先后经过第二级、第三级砂磨机研磨后成为半成品，得到半成品670klg。

4、经检测此半成品中：

1)经过HPLC检测，该半成品中含纳他霉素5.11％，春雷霉素0.493％，总有效成分含量为5.60％，半成品分装成为成品之后即可出厂；

2)湿筛试验(通过75um试验筛)≥98％；

3)倾倒后残余物3.6％，洗涤后残余物0.39％。

实施例6：6.5％纳他·井冈胶悬剂

1、发酵原液：采用实施例1的方法发酵原液，菌株为褐黄孢链霉菌(S.gilvosporeus)HBJ591菌株，发酵效价12970mg/L；

2、絮凝：取6700kg发酵原液，其pH值为5.0，加入壳聚糖6.7kg，搅匀，室温下静置2小时；

3、板框压滤：将絮凝的发酵原液泵入板框进行压滤，得滤饼；

4、胶体磨研磨：滤饼卸下后马上进胶体磨，研磨时加压滤的滤液，调整到胶体磨磨出的浆液中含固体的量≤20％，本例中加滤液425kg，胶体磨研磨完毕时获得浆液566kg；

5、砂磨、调配：向浆液中加入胶悬剂的组合助剂46kgNNO、14.1kg三苯乙烯酚聚氧乙烯醚磷酸酯、1.6kg黄原胶、76.7kg乙二醇、1.6kg苯甲酸钠共140kg，混合均匀后经过三级砂磨机研磨，成胶体状；磨完后向所得浆料贮罐，加入井冈霉素A溶液(含量7.5％)828kg，充分搅拌均匀，最终获得纳他·井冈胶悬剂1534.5kg；

6、检测：

1)经HPLC检测此批产品中含纳他霉素2.60％，井冈霉素A 4.05％，悬浮率95％，有效成份总含量6.65％；

2)湿筛试验(通过75um试验筛)≥98％；

3)倾倒后残余物4.1％，洗涤后残余物0.32％。

实施例7：20％纳他霉素干混悬剂制备

1、配方：纳他霉素干粉288kg、蔗糖38kg、CMC(羧甲基纤维素)3.8kg、沸石粉52kg。

其中纳他霉素发酵干物质经粉碎在500目以上(其干物质的获得同实施例1，其中纳他霉素发酵原液7200L，放罐效价12600ug/mL)

2、制备方法参考实施例2的方法。

制剂生产过程总收率为88.4％，即最终获得纳他霉素干混悬剂重381.8kg。

3、检测：对本实施例生产的制剂进行检测，测定结果：

1)用HPLC检测干混悬剂粉中的纳他霉素含量为20.83％；

2)粒度测定为4um～6um粉粒相对体积＞75％；

3)40℃，75％湿度存放6个月以上，含量稳定，再分散性能好；

4)NDJ-1旋转粘度测为70～80mpas之间，流动性良好。

实验例1：用20％纳他霉素粉剂防止饲料生产原料麦麸霉变的试验

处理1：取麦麸1000g，20％纳他霉素粉剂(实施例1生产)0.5g，充分混匀，装在带盖的方形塑料盒中，达到保持湿度比较稳定的目的；

处理2：取麦麸1000g，20％纳他霉素粉剂(实施例2生产)0.5g，充分混匀后装入第二个小塑料盒中；

处理3、处理4分别同处理1和处理2，但20％纳他霉素的用量均提高到1g；

处理5为空白对照，即小塑料盒中只加1000g麦麸，不再加任何东西。

将上述5个处理的方形塑料盒放在恒温(25±2℃)恒湿(相对湿度70％-90％)无光照培养室内贮存。30天后检查结果，麦麸是否霉变通过肉眼观察确定。

结果显示：空白对照长满霉菌，严重霉变；处理1、处理2、处理3、处理4无一长霉。

实验例2：将20％纳他霉素粉剂用于粪链球菌的半固体发酵以防止霉变的试验

在南方梅雨季节，本企业固体发酵车间内，按半固体发酵方法在通风曲床上生产粪链球菌，每个曲床物料(干重)为1吨，物料含水量55％，曲室温度30-32℃，发酵后在原位干燥时间54小时。

处理1：每个曲床在装毕物料并耙平之后，将1kg10％的纳他霉素胶悬剂(实施例3生产)用10L凉开水稀释之后用喷雾器均匀喷在发酵床表面，共三个曲床。发酵24小时之后翻床1次，每床再取1kg 10％的胶悬剂用10L凉开水稀释之后用喷雾器再均匀地喷在物料表面一次。

处理2：为对照，亦设三个曲床，每个曲床两次都只喷11L凉开水，不加任何药物。在24小时翻料前和54小时收干料前检查试验结果。

结果显示：对照即处理2处理的曲床在24小时的时候，平均每平方米曲床表面可见13.5个小霉点；54小时检测发现每kg干料中平均可以检出4.7个霉菌菌丝团；而处理1处理的曲床在24小时和54小时时霉点和霉菌菌丝团均为零，防霉效果为100％。按处理1的方案使用10％纳他霉素胶悬剂于粪链球菌生产中20批次，无一批次发生霉变。

实验例3：用20％纳他霉素粉剂防止全价料(颗粒状)发霉试验

从武汉某禽饲料生产企业购进该厂生产的常规蛋鸡全价饲料(颗粒状)100kg，然后将实验例1生产的20％纳他霉素粉20g与之混匀。混匀过程分三步进行：第一步将20g粉剂与2kg饲料反复拌和数次，达到基本均匀，再将2.02kg混好的物料与10kg饲料反复拌和，至肉眼感觉已基本均匀。最后将剩下的饲料颗粒与第二次混合好的物体混合数次。混好纳他粉剂的饲料不装袋，盛于塑料盆中，放于一楼贮藏室中(温度21-27℃，相对湿度74％-86％)183天。取出观察，未发现饲料颗粒长霉。

实验例4：用6.5％纳他·井冈霉素胶悬剂田间防治水稻纹枯病

试验地点湖南湘乡市双莲村，水稻品种为汕优63杂交稻。

8月22日施用实施例4生产的6.5％的纳他·井冈霉素胶悬剂，防治水稻纹枯病，处理面积60平方米，亩用药量60mL制剂；

同一天在另一处理小区施用实施例3生产的10％纳他霉素胶悬剂，处理面积也为60平方米，亩用药量30mL；

空白对照为清水对照。本试验只施药一次。

20天后检测，结果为：10％的纳他霉素单剂防治效果为76.14％，6.5％纳他·井冈复配剂防治效果为92.65％。

实验例5：用10％纳他霉素胶悬剂防治水稻稻瘟病

在湖北宜昌地区石柱村(海拔800米的二高山地区)做防治中稻稻瘟病的试验(水稻品种川丰32号)，防治病害具体为穗颈瘟，每处理20平方米，每处理重复3次。本试验共施药两次，第一次为7月30日，第二次施药为8月6日。

处理1为喷施10％纳他霉素胶悬剂(实施例3制备)，每亩面积用药量折算为60g制剂；

处理2为喷施富士一号(40％稻瘟灵乳油)，折算为亩用量100ml制剂；

处理3为空白对照，即喷施清水。

于9月10日检查测，结果显示为：纳他霉素防治效果达到72.08％，对照化学农药富士一号防治效果61.38％。本发明生产的纳他胶悬剂显著优于对照的化学农药。

实验例6：免提炼法生产的纳他霉素胶悬剂和用纳他霉素晶体生产的胶悬剂防治水稻穗颈瘟效果比较

取实施例1所述采用褐黄孢链霉菌HBJ591菌株发酵的发酵液20L，经有机溶剂提取再经结晶和重结晶，提取出纳他霉素晶体136g，晶体纯度为93.7％，提炼总收率为50.57％，将所得的纳他霉素晶体按实施例3的制剂配方用实验室的砂磨机反复磨3次制成10％的纳他霉素胶悬剂1244g，HPLC法检测纳他霉素的含量为10.31％。此产品称之为晶体胶悬剂。

另取上述纳他霉素发酵液20L，参照实施例3的办法进行离心，并用与上述同一台砂磨机反复磨3次，按上述相同配方配成10％的纳他霉素胶悬剂，得到制剂2216g，用HPLC法测出纳他霉素的含量为10.26％(生产总收率为90.22％)，此产品称之为菌体胶悬剂。

在湖北省宜昌地区周萍乡石柱村做防治水稻穗颈瘟的对比试验，水稻品种同实验例5，第一次为7月30日，第二次施药为8月6日。

处理一为晶体胶悬剂，处理二为菌体胶悬剂，处理三为清水对照。每处理三个小区，每小区20平方米。

试验方法同实验例5。

于9月10日检测，其结果为：晶体胶悬剂的防治效果为56.78％，菌体胶悬剂的防治效果69.79％，菌体胶悬剂显著优于晶体胶悬剂。

分析其原因：可能是菌体细胞残片对纳他霉素的化学结构有保护作用，避免了素的光分解，故防效得到提升。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (13)

1.一种纳他霉素制剂，其特征在于，该制剂由以下方法制备：采用免提炼方法分离纳他霉素发酵原液，将得到的纳他霉素发酵原液的浓缩液或滤饼加或不加农药助剂，混合均匀，得到纳他霉素制剂，或将得到的浓缩液或滤饼与其他活性成分、加或不加农药助剂混合均匀，制成复配剂。

2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，该方法中：所述免提炼方法为离心或板框压滤。

3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，该制剂生产方法包括以下步骤：

1)发酵原液调pH：将纳他霉素发酵原液的温度降到10℃，边加碱溶液边搅拌将发酵原液的pH值调节至5.5-7.0；

2)板框压滤：对调节pH值后的发酵原液板框压滤；

3)闪蒸干燥：将滤饼闪蒸干燥，得到含水量小于15％；

4)膨化处理：对闪蒸干燥的物料进行膨化处理；

5)气流粉碎：将膨化后的物料加入气流粉碎机中粉碎，细度达到425目即可，加入农药助剂，混合均匀，即得纳他霉素粉剂或干混悬剂。

4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述的步骤3)-4)分别为：

3)闪蒸干燥：将滤饼放入快速旋转式闪蒸干燥机中，闪蒸机温度设定为140～180℃，时间控制在30秒以内，控制干物料含水量小于15％，然后快速将物料温度降到50℃以下；

4)膨化处理：将闪蒸干燥的物料加入饲料挤压膨化机中，料温控制在180℃以下，膨化时间控制在30秒之内，膨化过的物料尽快降温到室温。

5.根据权利要求3或4所述的制剂，其特征在于，所述步骤1)还包括按照发酵原液与絮凝剂的重量比为1000∶1，将调节pH值后的发酵原液中加入絮凝剂，絮凝1-2小时；所述步骤4)替换为：4)初级粉碎：将闪蒸干燥的物料用常规粉碎机粉碎到100目。

6.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)两级离心分离：先用制冷机将发酵原液温度降到10℃，边加碱溶液边搅拌将纳他霉素的发酵原液的pH值调至5.5-7.0，然后按照发酵原液与絮凝剂的重量比为1000∶1加入絮凝剂，絮凝1-2小时，收集沉淀；将上部清液加入分离因素大于10000g的碟片式离心机中离心分离，得到重液，即“菌浆”；当碟片离心的轻液中纳他霉素含量大于500mg/L时，则须再通过分离因素大于20000g的管式离心机中离心分离，回收离心所得纳他霉素的沉淀，然后将菌浆与二次的沉淀混合均匀，得到混合浆液；

2)胶体磨研磨：将步骤1)得到的混合浆液输入胶体磨中进行研磨，细度要求在80-100目筛；

3)砂磨研磨：将步骤2)得到的物料经过三级砂磨，磨成胶体状；

4)调配：加入农药助剂，或者加入农药助剂和其他活性成分，充分混合均匀；

5)第二次过胶体磨：通过胶体磨将调配好的物料再次研磨，得到纳他霉素农药制剂或复配剂。

7.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)发酵原液调pH：用制冷设备将料温降到10℃左右，再用少量碱液将纳他霉素发酵原液调节pH值为5.5-7.0，加壳聚糖搅匀，静置；

2)板框压滤：将絮凝的发酵液泵入板框进行压滤，得滤饼；

3)胶体磨研磨滤饼：将滤饼放入胶体磨中，研磨时加压滤出的滤液，调整到胶体磨磨出的浆液中含固体的量≤20％；

4)砂磨、调配：加入农药助剂，加或不加预先溶于水的其他活性成分，混合均匀后，经过三级砂磨机研磨成胶体状，其中其他活性成分为井冈霉素或春雷霉素，然后用高速混合机混匀，即得纳他霉素制剂或复配剂。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述方法中：步骤3)和4)替换为：3)用胶体磨研磨滤饼：滤饼在剪切机中打散，并加滤液到滤饼中，调整到胶体磨磨出的浆液中含固量≤20％，经二次胶体磨研磨；4)调配、高压均质：加入农药助剂，加或不加其他活性成分，高压均质破壁二轮，第1轮20mpa，第2轮20-40mpa，即得纳他霉素制剂或复配剂。

9.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述方法中：步骤3)和4)替换为：3)剪切：滤饼和农药助剂，通过剪切机械剪切；4)调配和砂磨：加入农药助剂，加或不加其他活性成分，然后进行三级砂磨机砂磨，然后用高速混合机混匀，即得纳他霉素制剂或复配剂。

10.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，农药助剂选自分散剂、润湿剂、填充剂、稳定剂、增稠剂、防腐剂或防冻剂中的一种或几种。

11.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述制剂或复配剂的剂型为粉剂、干混悬剂或胶悬剂。

12.一种制备权利要求1-11所述制剂的方法，其特征在于，采用免提炼方法分离纳他霉素发酵原液，将得到的纳他霉素发酵原液的浓缩液或滤饼加或不加农药助剂，混合均匀，得到纳他霉素制剂，或将得到的浓缩液或滤饼与其他活性成分、加或不加农药助剂混合均匀，制成复配剂。

13.权利要求1-11所述的制剂在制备饲料防霉和农作物防治真菌性病害的药物中的应用。