CN101289394B - 从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，该工艺采取乙醇水渗漉法提取，聚酰胺柱层析法纯化绿原酸，同时将分离出绿原酸后的葵粕渣再次分离提取出其中有用得分离蛋白和蛋白小肽，从而大大增加了葵粕的附加值。本发明的工艺可防止绿原酸在提取过程中得氧化，提高绿原酸纯度和收率，同时降低生产成本。

Description

从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺 

技术领域

本发明涉及葵粕的综合利用技术，特别是涉及一种从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺。 

背景技术

葵粕就是葵花籽经剥壳萃取油后留下的残渣。葵粕的有效成分为含有绿原酸等物质的葵花蛋白和粗纤维。其中蛋白含量高达30％～48％，绿原酸含量为1％～3％。绿原酸是植物在有氧呼吸过程中形成的一种苯丙素类物质，具有利胆、抗菌、降压、增高白血球及兴奋中枢神经系统等多种药理作用，同时，还具有很强的抗氧化性，在化妆品、食品、医药领域都有很高的应用价值。 

中国专利：申请号200510047693.0提供了一种从葵粕中连续提取绿原酸及葵花蛋白的方法，该方法存在如下技术缺陷：1.采用盐水浸泡提取方法，这种提取方式对于盐水的温度和浓度要求非常高，否则容易造成葵粕中蛋白质变性影响浸出率，且浸出率很低；2.浸泡后的葵粕用胶体磨磨碎后直接分离，由于研磨后的物质为乳浊液，直接通过大孔树脂时将会堵塞树脂，影响吸附；3.洗脱液通过加热一定的时间去除其中所含的溶剂，这种方式会导致绿原酸氧化。 

现有技术中还有诸如《一种葵花粕中提取纯化绿原酸的方法》(申请号200510094347.8)等技术，但是这些技术大都采用搅拌提取或萃取的方式，溶媒用量大，提取成本高，且没有对葵粕中变性蛋白和结合蛋白进行分离提取，未能做到葵粕物尽其用。 

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种产品纯度高，收率高，生产成本低，且使葵粕资源得到充分利用的从葵粕中连续提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺。 

本发明的具体工艺步骤如下： 

原料葵粕需用去壳油葵仁经6号溶剂油萃取葵花籽油后的葵粕，因为油葵壳外面是黑色的，葵壳色素影响分离蛋白和蛋白小肽的颜色。 

1、粉碎：选取葵仁萃取油后的葵粕，将其粉碎通过20～80目筛。 

2、渗漉：将葵粕粉装入渗漉器中。渗漉器的直径与高度比为1∶3～10，装料高度与渗漉器的直径比为2～8∶1，用渗漉液湿法装柱，渗漉液为用稳定剂调PH至4～5的40％～60％的乙醇水溶液，所述的稳定剂为抗坏血酸和乙酸的水溶液或者或者为抗坏血酸和磷酸的水溶液，其中抗坏血酸∶乙酸＝2∶3～4∶1，抗坏血酸∶磷酸＝2∶3～4∶1，上述混合酸与 水的比例为2∶1～1∶3。稳定剂可以起到防止绿原酸在提取过程中酚羟基氧化、烯酸酯键水解和相继分子内酯基迁移而发生异构。装料后浸泡3～15h，开始渗漉。流速为1/10-1BV/h，共收集6倍渗漉液，收集前1～4倍渗漉液提取绿原酸，5～6倍渗漉液套用作下批渗漉的湿法装柱用。渗漉后的葵粕提取分离蛋白用。 

3、减压浓缩：将上述1～4倍渗漉液进行减压浓缩(用旋转蒸发器)，回收乙醇至浓缩液无醇。 

4、聚酰胺柱层析：将处理好的50～200目聚酰胺用10％～50％乙醇湿法装柱，柱直径与高度比为1∶5～1∶30，装柱高度与直径比为5～10∶1，上样量浓缩液与聚酰胺的比为0.5～2∶1，洗脱剂为10％～50％乙醇水溶液，自然流速，收集3.5～16倍洗脱液。 

5、减压浓缩、结晶：将收集的3.5～16倍洗脱液进行减压浓缩回收乙醇至无醇，冰箱4℃冷藏结晶，分离晶体，分别用少量丙酮和乙酸乙酯洗涤晶体，真空干燥，即得到绿原酸成品。 

6、将3中渗漉后的葵粕加8～15倍水稀释，用10％～20％氢氧化钠液调PH8～10，加氯化钠5％～10％、40℃～55℃搅拌提取1～2h，渣液分离，渣生产蛋白小肽。所得清液用10％～20％盐酸溶液调至葵粕蛋白等电点PH4～5.5，离心分离得蛋白凝乳，凝乳用提取液等体积的调整PH4～5的纯水洗涤1～3次，用纯水将凝乳分散，使蛋白浓度达15％～25％，均质，喷雾干燥，得分离蛋白粉。 

7、将6中分出的渣，加8～15倍纯水稀释，用10～20％氢氧化钠液调PH8～10，加0.2％～0.4％(w/v)(每100毫升加入0.2～0.4克)葵粕不溶蛋白提取剂(宁夏银川索然生物科技研究中心研制)，水溶40℃～55℃提取1～2h，调整温度45℃～48℃，PH7.5，加2121复合蛋白酶(葵粕不溶蛋白和结合蛋白专用，宁夏银川索然生物科技研究中心研制、提供)0.2％～0.4％(w/v)(每100毫升加入0.2～0.4克)，搅拌酶解4～6h，85℃～90℃灭酶15分钟，渣液分离，渣作饲料用，液加2％～5％(w/v)活性炭脱色、脱炭、浓缩至固含量35％～55％，均质，喷雾干燥，得葵粕蛋白小肽。 

本发明同现有技术相比具有以下技术特点： 

1、一次投料连续提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽，使葵粕资源得到充分利用，大大提高葵粕的附加值。 

2、采有渗漉法首先提取绿原酸，高浓度绿原酸集中在1～4倍体积渗漉液中，溶剂乙醇水溶液从文献报道至少24倍，减少至4倍，大大节省溶剂用量，降低了生产成本。 

3、渗漉液用稳定剂调节PH4.0～5.5，既保证了绿原酸在该PH值下比较稳定，防止绿原酸在提取过程中酚羟基氧化、烯酸酯键水解和相继分子内酯基迁移而发生异构，同时抑制葵粕中的部分蛋白溶入水醇中，影响分离蛋白的提取。 

4、葵粕中变性蛋白和结合蛋白(谷蛋白)在葵粕蛋白提取剂的提取下溶入溶液中，而后在2121葵粕蛋白专用复合蛋白酶的作用下，将其酶解成分子量1500D以下的蛋白小肽，酶解率达到不溶解蛋白的76％以上。 

具体实施方式

经测定，实验用葵粕含绿原酸3.92％，蛋白质含量48％，以下同。 

实施例1 

取经粉碎通过40目筛的葵粕粉100克，用稳定剂调PH4.5的45％乙醇水溶液湿法装入渗漉器中。渗漉器为玻璃柱，Φ40mm×320mm，料高188mm，浸泡5h。稳定剂为抗坏血酸和乙酸与水混合液，其中抗坏血酸∶乙酸为3∶2，混合酸∶水1∶1。渗漉液同装柱液，渗漉流速为2ml/分，收集渗漉液600ml。经测定绿原酸的提取率达98％以上，其中前400ml含绿原酸占总量92％以上。前400ml渗漉液用旋转蒸发器浓缩至无醇，约50ml左右，后200ml作下一批装料用。取处理好的100～200目聚酰胺100克，湿法装入Φ30×300mm层析柱中，用10％乙醇水溶液平衡后，将上述50ml浓缩液上在聚酰胺顶端，用10％乙醇洗脱，收集第350ml至1500ml洗脱液，旋转蒸发减压浓缩至20ml左右，转移入50ml烧杯中，放入4℃冰箱中冷藏24h，分离晶体，用少量丙酮和乙酸乙酯洗涤，真空干燥，得绿原酸晶体1.1g，纯度为90.2％，收率为28.06％。 

提取绿原酸后的葵粕转入2000ml烧杯中，加1000ml水和氯化钠60g，搅拌溶解，用10％氢氧化钠调PH9.0，水溶50℃搅拌提1.5h，离心分离，渣提取蛋白小肽。清液用20％盐酸调PH4.5，离心分离，凝乳用PH4.5纯水1000ml洗涤凝乳，离心分离凝乳，加水60ml分散，喷雾干燥，得分离蛋白14.5g，收率为14.5％，蛋白含量87％。 

渣放入2000ml烧杯中，加1000ml纯水，用10％氢氧化钠液调PH9.0，调温度55℃，加葵粕蛋白提取剂3.3g，搅拌提取1h；调温度45℃-48℃、PH7.5，加复合蛋白酶21213.3g，搅拌酶解4h，离心分离，渣作饲料添加剂.清液950ml加活性炭28.5g，60℃-70℃搅拌脱色、精制45分钟，脱炭，清液经旋转蒸发浓缩至固含量40％，均质，喷雾干燥得蛋白小肽成品24.3g，收率为24.3，蛋白含量90.1％，分子量≤1500D占91％。 

实施例2 

取经粉碎通过30目的葵粕粉1000g，用稳定剂调PH5.0的55％水醇溶液湿法装入渗漉器中。渗漉器为有机玻璃，直径Φ80mm×700mm，浸泡12h。稳定剂为抗坏血酸和磷酸与水混合液，其中抗坏血酸∶磷酸为2∶3，混合酸∶水为1∶2。渗漉液同装柱液进行渗漉，流速25ml/分，收集渗漉液6000ml，前4000ml减压浓缩回收乙醇，至浓缩液无醇，约200ml。后2000ml 作下一批装料用。取处理好80～120目聚酰胺600g，用20％乙醇水溶液湿法装入Φ60mm×900mm层析柱中，用20％乙醇水溶液平衡，将上述200ml浓缩液上在聚酰胺顶端，用20％乙醇自然流速洗脱，收集洗脱液4000ml至14000ml，旋转蒸发器减压回收乙醇至100ml左右，转移入烧杯中，4℃冰箱冷藏48h，分离结晶，用少量丙酮、乙酸乙酯洗涤晶体，真空干燥，得绿原酸12.8g，收率为32.6％，纯度91.8％。 

提取绿原酸后葵粕转入适合容器中，加水12L，氯化钠650g，搅拌溶解，用20％氢氧化钠液调PH9.5，55℃提取2h，渣液分离，渣提取蛋白小肽。清液用20％盐酸调PH5.0，分离凝乳，用PH5.0纯水适量洗涤凝乳，分离凝乳，用纯水适量分散凝乳，使蛋白含量达20％，均质，喷雾干燥，得分离蛋白粉156g，收率为15.6％，蛋白含量89.5％。 

渣放入适合容器中，加纯水12L，用氢氧化钠液调PH9.5，加葵粕蛋白提取剂42g，52℃提取2h，调整温度45℃-48℃，PH7.5，加复合蛋白酶212142g酶解5h，渣液分离，渣作饲料添加剂.清液加活性炭354g，65℃-70℃搅拌脱色40分钟，脱炭，清液浓缩至固含量45％，均质，喷雾干燥，得蛋白小肽成品256.0g，收率为25.6％，分子量≤1500D占92.1％。 

实施例3 

取经粉碎通过20目的葵粕粉10千克，用稳定剂调PH4.0的50％乙醇水溶液湿法装入渗漉器中，渗漉器为有机玻璃Φ200mm×1000mm，稳定剂为抗坏血酸和乙酸与水的混合液，其中抗坏血酸∶乙酸为1∶1，混合酸∶水为1∶1。用装柱液进行渗漉，速度300ml/分，收集渗漉液60000ml，前40000ml减压回收乙醇至无醇约1000ml，后20000ml作下一批装料用。取处理好的50-80目聚酰胺4000g，用10％乙醇水溶液湿法装柱，层析柱Φ150mm×1500mm，用10％乙醇水溶液平衡后将浓缩液1000ml上在聚酰胺顶端，用10％乙醇水溶液洗脱，收集第4-14倍洗脱液，减压浓缩至600ml左右，转移入烧杯中置4℃冰箱冷藏36h，分离结晶，用少量丙酮、乙酸乙酯洗涤晶体，真空干燥，得绿原酸晶体132.6g，收率为33.8％，纯度为90.7％。 

提取绿原酸后的葵粕转入150立升反应釜中，加水110升，氯化钠8.5kg，用20％氢氧化钠液调PH9.5，50℃-55℃提取1.5h，渣液分离，渣用于提取蛋白小肽.清液用20％盐酸调PH4.7，充分搅匀，分离凝乳，用PH4.7纯水洗涤凝乳，分离凝乳，用纯水将凝乳分散，使蛋白含量达到23％，均质，喷雾干燥，得分离蛋白粉1.61千克，收率为16.1％，蛋白含量90.1％。 

提取分离蛋白后的渣置150L反应釜内，加纯水115L，调PH9.5，加热至50℃，加葵粕蛋白提取剂390克提取1h，调整温度至46℃-47℃，PH7.5-8.0，加复合蛋白酶2121390克酶解4.5h，渣液分离，渣作饲料添加剂。清液减压浓缩至固含量50％，均质，喷雾干燥，得蛋白小肽粉2610g，收率为26.1％，分子量≤1500D占90.3％。 

上述蛋白提取剂和复合蛋白酶2121均为宁夏银川索然生物科技研究中心生产的。 

Claims (10)

1.一种从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其工艺过程为：

a.将粉碎后的葵粕装入渗漉器中用渗漉液渗漉，收集1～6倍渗漉液，其中渗漉液为用稳定剂调PH4-5的40％-60％的乙醇水溶液；

b.将其中1～4倍渗漉液浓缩至无醇，浓缩液上聚酰胺柱层析，用洗脱剂洗脱，收集洗脱液再浓缩，浓缩液冷藏结晶，分离晶体，洗涤，真空干燥，得结晶绿原酸；

c.提取绿原酸后的葵粕用水稀释，调PH8～10，加氯化钠搅拌提取，离心分离渣液，其中清液调PH4～5.5沉淀蛋白，再离心分离，所得凝乳用PH 4～5的水洗涤后喷雾干燥得分离蛋白；

d.将上述离心分离所得渣用水稀释，调PH8～10，加入葵粕蛋白提取剂提取，后再加入复合蛋白酶2121酶解，离心分离，所得清液经活性炭脱色、脱碳、浓缩、喷雾干燥，即得蛋白小肽。

2.按照权利要求1所述的从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其特征是：上述葵粕为葵仁萃取油后的葵粕，其粉碎粒度为20～80目。

3.按照权利要求1所述的从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其特征是：上述渗漉器的直径与高度比为1∶3～10，装料高度与渗漉器直径比为2～8∶1，湿法装料；所述的稳定剂为抗坏血酸和乙酸的水溶液或者为抗坏血酸和磷酸的水溶液，其中抗坏血酸∶乙酸＝2∶3～4∶1，抗坏血酸∶磷酸＝2∶3～4∶1，上述混合酸与水的比例为2∶1～1∶3；装料后浸泡3～15小时后开始渗漉，流速为1/10～1BV/h。

4.按照权利要求1所述的从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其特征是：上述5～6倍渗漉液作为下次渗漉时套用。

5.按照权利要求1所述的从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其特征是：上述聚酰胺为50～200目，层析柱直径与高度比为1∶5～30，装柱高度与直径比为5～10∶1，上样量与聚酰胺比例为0.5～2∶1，湿法装柱。

6.按照权利要求1所述的从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其特征是：上述洗脱剂为10％～50％乙醇水溶液，采用自然流速收集3.5～16倍洗脱液。

7.按照权利要求1所述的从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其特征是：上述浓缩采用旋转蒸发器减压浓缩。

8.按照权利要求1所述的从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其特征是：分离晶体用少量丙酮、乙酸乙酯洗涤。

9.按照权利要求1所述的从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其特征是：上述c过程提取绿原酸后的葵粕加8～15倍水稀释，加氯化钠5％～10％(w/v)，于40℃～55℃搅拌提取1～2小时。

10.按照权利要求1所述的从葵粕中提取绿原酸、分离蛋白和蛋白小肽的工艺，其特征是：上述葵粕蛋白提取剂为宁夏银川索然生物科技研究中心生产的，其用量为0.2％～0.4％(w/v)；上述复合蛋白酶2121为宁夏银川索然生物科技研究中心生产的2121，其用量为0.2％～0.4％(w/v)。