CN110777173B - 一种利用罗汉果离心废渣制备罗汉果氨基酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用罗汉果离心废渣制备罗汉果氨基酸的方法，包括以下步骤：发酵、水提、离心、膜分离、真空浓缩、结晶洗涤、干燥，其特征在于，所述发酵是三个阶段的覆膜发酵，所述三个阶段分别是酸性发酵、中性发酵和碱性发酵。本发明提供的方法实现了鲜罗汉果的综合利用，在生产主产品罗汉果提取物的同时，利用离心废渣制备了副产品罗汉果氨基酸，变离心废渣为宝，提高了罗汉果的附加值；生产工艺简单，且无需添加生产设备，可以利用罗汉果提取物主产品生产线实现副产品的生产，提高了设备利用率；由于原料是离心废渣，故生产成本低。本专利产品罗汉果氨基酸可用于食品、饮料、保健品领域。

Description

一种利用罗汉果离心废渣制备罗汉果氨基酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程和植物提取分离技术领域，涉及一种利用罗汉果离心废渣制备罗汉果氨基酸的方法。具体涉及一种以鲜罗汉果或鲜无籽罗汉果在生产罗汉果提取物过程中的提取液(包括提取罐提取液和逆流提取槽提取液)经离心(包括卧螺离心和碟式离心)所得沉淀制备罗汉果氨基酸的方法。

背景技术

罗汉果(Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey)，英文名：fructusmomordicae，葫芦科多年生藤本植物的果实。别名拉汗果、假苦瓜、光果木鳖、金不换、罗汉表、裸龟巴，被人们誉为“神仙果，其叶心形，雌雄异株，夏季开花，秋天结果。主要产于广西壮族自治区桂林市永福县龙江乡、百寿镇，龙胜各族自治县，以及湖南省怀化、永州、邵阳等地。罗汉果有青皮果、长滩果、冬瓜果、拉江果、红毛果、油桐果等品种，青皮果种植较多。罗汉果也是国家首批批准的药食两用材料之一，其主要功效是能润肺止咳、生津化痰。

无籽罗汉果，系将罗汉果的三倍体植株和二倍体雄株进行种植，开花时用二倍体的雄株对三倍体的雌株人工授粉，雌株挂果后得到无籽罗汉果。

罗汉果及无籽罗汉果含有丰富的风味和营养成分，以及三萜皂苷类非糖甜味成分。

一、化学成分

罗汉果及无籽罗汉果均含有罗汉果三萜皂苷，还有蔗糖、葡萄糖(glucose)，果糖(fructose)占14％，十多种人体必需氨基酸、蛋白质、脂肪酸、黄酮类化合物、维生素C以及锰、铁、镍、硒、锡、碘、钼等26种无机元素和微量元素等。

1、葫芦素烷三萜类这类化合物是罗汉果中主要有效成分，它们有共同的苷元结构。罗汉果中这类物质除少数外，均为甜味物质或微甜物质。其中罗汉果苷V为主要的甜味成分、它无毒、低热量、高甜度、热稳定性好，是作为天然甜味剂开发的物质之一。

2、蛋白质、氨基酸罗汉果干果中含蛋白质7.1％-7.8％。在其水解物中，除色氨酸未被测定外，18种氨基酸齐全。在测定的氨基酸中，含量较高的有谷氨酸(108.2-113.3mg/kg)、天冬氨酸(93.9-112.5mg/kg)、缬氨酸(52.5-55.5mg/kg)、丙氨酸(49.9-66.8mg/kg)、亮氨酸(48.5-56.7mg/kg)。谷氨酸是人体中需要量最大的非必需氨基酸，是合成谷胱甘肽的重要原料，可见，罗汉果具有较高的营养价值。

3、无机元素罗汉果果实中含有24种无机元素，其中人体必需的微量元素和广泛元素有16种，含量较高的元素有钾(12290mg/kg)、钙(667mg/kg)、镁(550mg/kg)。罗汉果中含有的硒达到0.186mg/kg，是粮食的2倍～4倍，而元素硒在冠心病防治、抗衰老、抗癌方面有较好的疗效。

二、研究现状

目前国内对罗汉果和无籽罗汉果研究很多，研究内容包括罗汉果的化学成分、提取分离工艺、罗汉果提取物(罗汉果苷V)及其应用、罗汉果浓缩汁、生产废水处理、罗汉果相关产品等，但对于鲜罗汉果或鲜无籽罗汉果在生产罗汉果提取物过程中的提取液(包括提取罐提取液和逆流提取槽提取液)经离心(包括卧螺离心和碟式离心)所得沉淀即离心废渣研究较少。现阶段国内生产罗汉果提取物的厂家，一部分将鲜罗汉果生产过程中的离心废渣晒干，作为饲料添加物销售；一部分晒干，作为锅炉燃料；一部分不能及时处理的作为固体废弃物排放。这些处理方式虽然简单，但造成了有一定经济价值的罗汉果离心废渣资源浪费，无法实现罗汉果离心废渣的综合利用，不能提升罗汉果提取物副产品的附加值，或对环境有一定污染和破坏。主要原因是各生产企业生产设备和处理能力不同，拥有的技术不同导致处理离心废渣水平不同，或是未有罗汉果提取物副产品的终端应用的供应链等，均导致了有一定附加值的罗汉果生产过程中的离心废渣资源的浪费。

罗汉果生产过程中的离心废渣主要含有蛋白质、植物纤维、果胶、粘液质、色素等成分，通过自有的专利技术，结合主产品罗汉果提取物的生产过程，可以有效地利用鲜罗汉果生产过程中的离心废渣制备罗汉果氨基酸，得到有一定经济价值的罗汉果氨基酸，实现罗汉果的综合利用，变废为宝，创造明显的经济和社会效益。

国内发明专利：申请号为CN201811158344.X、CN201810508219.0、CN201711034468.2、CN201010107948.9的专利涉及到了罗汉果叶和罗汉果生产废液中的蛋白质和氨基酸。

国内发明专利详述：

1、申请号为CN201811158344.X的专利，公开了一种从罗汉果叶中提取茶多酚、总氨基酸、黄酮化合物的方法，所述提取茶多酚的方法，包括以下步骤：(1)渗漉提取：将罗汉果干叶粉碎，投入渗漉器中，压紧，加水，在室温下，渗漉提取，得渗漉液；(2)茶多酚的分离：加入有机溶剂，在室温下，搅拌萃取，静置分层，将分离所得的有机层用酸水溶液洗涤至无色，浓缩，干燥，重结晶，得茶多酚。本发明方法还公开了同时提取总氨基酸、黄酮化合物的方法。该方法以罗汉果叶为原料提取氨基酸，相应的文献报导很少，且原料本身含量低直接导致产品得率低以及分离精制困难，没有工业生产价值和应用前景。

2、申请号为CN201810508219.0的专利，公开了一种从罗汉果废液中分离水溶性膳食纤维和胶原蛋白的方法，包括以下步骤：(1)调节罗汉果生产废液pH值至中性，加入蛋白酶制剂，加热保温酶解，得酶解液；(2)用超滤膜过滤，收集超滤膜透过液；(3)上葡聚糖凝胶层析柱进行层析，收集流出液，减压浓缩，干燥，得水溶性膳食纤维；(4)将收集流出液后的葡聚糖凝胶层析柱，用洗脱剂进行洗脱，洗脱液用纳滤膜过滤，收集纳滤膜截留液，减压浓缩，冷冻干燥，得纳米胶原蛋白。该方法制备的目标产物是胶原蛋白，而不是罗汉果氨基酸；所用的葡聚糖凝胶价格昂贵，且处理样品量少，直接导致生产成本过高，是否具有工业生产价值，需要进一步确定；水溶性膳食纤维和胶原蛋白同为大分子物质，且罗汉果废液中含有大量色素，经此工艺，是否能得到合格的目标产物，目标产物纯度如何，科学性有待研究。

3、申请号为CN201711034468.2的专利，公开了一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法。该专利方法从罗汉果甜甙吸附树脂柱排出的废液生产罗汉果蛋白粉，充分提高了总蛋白转化率以及罗汉果蛋白的转化率。该方法的原料是罗汉果的甜甙提取废液，目标产物是罗汉果蛋白，但是此原料是在罗汉果提取物生产过程中经一定时间加热所得，而蛋白质加热会变性，直接导致水溶性差，此法的酶解是否能增加蛋白质的水溶性，或者酶解是转化成多肽还是氨基酸，有待进一步研究；此法收集是的超滤膜透过液，且限定了分子量范围，经蛋白吸附树脂层析，并且用到了解吸溶剂，之后无其他纯化步骤，所得目标产物蛋白质是否含有其他杂质和色素，纯度如何？也有待进一步研究。

4,申请号为CN201010107948.9的专利，公开了一种从干罗汉果中提取多种活性成分的方法，其中涉及废渣用胃酶水解得多糖、低聚糖、氨基酸，该方法不是针对罗汉果离心废渣制备氨基酸的工艺，对于蛋白质/氨基酸的利用率不高，而且胃酶酶解不充分，氨基酸收率很低，

总之，目前还是缺乏一种以有效制备罗汉果氨基酸的方法，特别是从罗汉果离心废渣中制备罗汉果氨基酸的方法。

发明内容

本发明克服现有技术存在的上述缺陷，以鲜罗汉果或鲜无籽罗汉果在生产罗汉果提取物过程中的离心废渣为原料，规模生产制备有一定经济价值的罗汉果氨基酸，实现罗汉果的综合利用，变废为宝，创造明显的经济和社会效益；找寻一条简单可行的工艺路线，降低生产成本，提高工作效率，实现规模生产。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用罗汉果离心废渣制备罗汉果氨基酸的方法，包括以下步骤：发酵、水提、离心、膜分离、真空浓缩、结晶洗涤、干燥，其特征在于，所述发酵是三个阶段的覆膜发酵，所述三个阶段分别是酸性发酵、中性发酵和碱性发酵。

所述罗汉果离心废渣制是以鲜罗汉果或鲜无籽罗汉果在生产罗汉果提取物过程中的提取液(包括提取罐提取液和逆流提取槽提取液)经离心(包括卧螺离心和碟式离心)所得沉淀，即鲜罗汉果生产过程中的离心废渣为原料。

所述覆膜发酵是指样品在湿润的固体状态下加水和不同规格型号的蛋白酶覆膜保温发酵，本发明的覆膜保温发酵区别于一般溶液体系中的液体状态加蛋白酶发酵，覆膜发酵的好处包括：首先，原料-罗汉果离心废渣是水不溶的固体状态，虽然含有较高的蛋白质含量，但溶液发酵的效率不高，而且需要大量试剂，提高了成本，而且并不绿色环保；其次，覆膜发酵具有效率高、效果好、操作简便、不占用生产设备的显著优点，使用外部发酵池实现高效发酵；最后，覆膜发酵过程易于控制，操作安全。

所述覆膜发酵的操作是先将罗汉果离心废渣与温水拌匀，覆膜发酵分3阶段进行，每个阶段采用不同的酶和不同的条件。

所述温水温度为45℃～55℃，温水的加入量为罗汉果离心废渣重量的0.3～0.7倍。

在本发明优选技术方案中，所述酸性发酵条件是调节体系pH为酸性，然后加入食品级酸性蛋白酶和植物提取酶，覆膜，保温发酵；所述中性发酵条件是调节体系pH为中性或弱碱性，加入食品级中性蛋白酶，覆膜，保温发酵；所述碱性发酵条件是调节体系pH为碱性，加入食品级碱性性蛋白酶，覆膜，保温发酵。

优选地，所述食品级酸性蛋白酶规格型号为APRL型FDY-2205，主要作用酰胺键，可以切开多种氨基酸构成的肽键，优先切开两端是芳香族或疏水性氨基酸残基之间的肽键；植物提取酶规格型号为SPE-008，主酶系为蛋白酶，兼有纤维素酶等复合酶系，能将蛋白质水解成氨基酸，并能减少溶液后浑浊，降低提取液粘度，加快过滤速度，有效解决沉淀分层絮状等现象，具有良好的澄清效果，该2种酶作用体系的最适pH为4-5，与原料的pH基本符合。

更优选地，所述食品级酸性蛋白酶添加量为0.5～1.0kg/吨原料，植物提取酶用量为0.3～0.6kg/吨原料。

进一步优选地，酸性发酵条件为调节体系pH为4.0～5.0，保温温度为45℃～55℃，发酵时间为3～5h。

优选地，所述食品级中性蛋白酶规格型号为高活力浓缩型PDG-2230，主含内肽酶活性，兼具少量氨肽酶和羧肽酶活性，氨肽酶和羧肽酶水解最接近蛋白质底物N端或C端的肽键，而内肽酶的作用点位于蛋白质内部，远离其N端和C端，这些酶共同作用，可以实现良好的酶解转化；该中性蛋白质酶具有较宽的pH作用范围，在中性及偏碱性条件下均具有良好的活性，故以中性蛋白酶作为酸性和碱性之间的过渡酶，以实现无缝衔接，保证酶解转化的效果。

更优选地，所述食品级中性蛋白酶添加量为1.0～3.0kg/吨原料。

进一步优选地，中性发酵条件为调节体系pH为7.0-8.5，优选为7.0-7.5，保温温度为40℃～50℃，发酵时间为4～6h。

优选地，食品级碱性蛋白酶规格型号为高活力浓缩型PDG-2227，酶活中心含丝氨酸，属丝氨酸内切蛋白酶，具有较强的分解蛋白质的能力，可以将酸性和中性蛋白酶没有酶解的蛋白质基本转化成水溶性氨基酸。

更优选地，所述食品级碱性蛋白酶添加量为1.5～3.5kg/吨原料。

进一步优选地，所述碱性发酵条件为调节体系pH为9.0-10.0，保温温度45℃～55℃，发酵时间为2～4h。

通过以上不同蛋白酶的协同作用，实现了将水不溶蛋白质基本完全转化成水溶性氨基酸。氨基酸是一类特殊物质，分子结构中具有氨基和羧基基团，具有两性，若提取条件控制不好，则容易破坏氨基酸的分子结构。在本专利的pH和温度条件下，一方面保护氨基酸分子结构不被破坏，另一方面可以基本完全将发酵后的氨基酸提取出来，且易于与杂质分离。若按常规提取，则由于部分氨基酸被破坏，最终提取产物只有本方法的65％左右。

所述水提具体是将发酵好的离心废渣投入提取罐，加水搅拌提取，调节溶液的pH为弱酸性，提取温度为50℃～60℃，提取次数为1-5次,，优选为3-4次，提取完成以后，经提取系统的滤网过滤，得提取液。

优选地，水提步骤中调节溶液pH弱酸性是指将溶液用稀盐酸调节pH为5.5-6.5。

所述离心是将提取液依次通过卧螺离心机和碟式离心机，收集离心液；

所述膜分离为二级膜过滤，离心液通过无机陶瓷膜系统得到澄清透明的陶瓷膜滤液；再将陶瓷膜滤液通过有机纳滤膜系统，得到淡黄色的纳滤膜精制与脱色液。

优选地，无机陶瓷膜材质为氧化铝或氧化锆，孔径为50～500nm；有机纳滤膜材质为聚酰胺，截留分子量为500～1000，操作压力为2.0～3.0MPa。

所述真空浓缩是将纳滤膜精制与脱色液通过真空浓缩至一定固形物含量，得真空浓缩液。

优选地，真空浓缩是在0.01-0.1MPa真空度下浓缩至固形物含量大于40wt％。

所述结晶洗涤是向真空浓缩液中加入一定量的乙醇，优选为食用乙醇，经充分搅拌与冷置，罗汉果氨基酸结晶逐渐析出，待结晶完全以后，过滤，得罗汉果氨基酸结晶；再向罗汉果氨基酸结晶中加入高浓度乙醇，充分搅拌与静置，残存色素逐渐溶解，过滤，所得沉淀再加适量高浓度乙醇洗涤，得白色的罗汉果氨基酸结晶。

优选地，结晶过程中，是向浓缩液中逐渐加入高浓度乙醇，体系中醇浓度是逐渐增加的，当体系中乙醇浓度达到85％时，经充分搅拌后将混合溶剂系统放置于1℃～5℃冷藏，以使结晶充分析出。所述过滤包括抽滤和布袋离心，要求所用溶剂逐渐透过固体层。所述洗涤过程中两次加入的高浓度乙醇的用量和待洗涤的结晶物质的体积重量比(kg/L)依次为1.5-3：1和0.5-1：1。

本发明所述高浓度乙醇优选为食用乙醇，乙醇浓度大于90wt％。

所述干燥是将罗汉果氨基酸结晶鼓风干燥或真空干燥，干燥温度为55℃～65℃，干燥程度为水分小于5％，得产品罗汉果氨基酸。

本发明的原理是以鲜罗汉果或鲜无籽罗汉果在生产罗汉果提取物过程中的提取液(包括提取罐提取液和逆流提取槽提取液)经离心(包括卧螺离心和碟式离心)所得沉淀，即鲜罗汉果生产过程中的离心废渣为原料，规模生产制备有一定经济价值的罗汉果氨基酸。

原料中主要含有蛋白质、植物纤维、果胶、粘液质、色素等成分，其中原本水溶性较好的蛋白质由于在提取过程中经加热等操作而变成难溶于水的变性蛋白质成分，从而降低了蛋白质的提取效率。本发明的发明人预料不到地发现，使用特定的酶的组合，作用于蛋白质分子不同结构部位，分别在最适条件下酶解，反应温和而彻底，将大分子蛋白质完全水解成小分子的水溶性氨基酸；控制提取条件，在保护转化后的氨基酸不被破坏的同时实现完全提取，并通过提取设备的过滤系统和离心工艺使水溶性的罗汉果氨基酸与其他水难溶杂质，如植物纤维、部分果胶、粘液质等成分分离；再通过集成膜系统，其中无机陶瓷膜系统的错流过滤澄清技术，实现了离心液的澄清，完全去除了细小机械杂质即水不溶成分对产品品质的影响，可以保证最终产品氨基酸的溶解液澄清；有机纳滤膜系统的分子量截留技术，实现了大分子杂质，如部分果胶、粘液质等成分和未完全酶解的蛋白质、大部分色素等物质与目标产物罗汉果氨基酸的分离，效果好且效率高；通过真空浓缩，将纳滤膜精制与脱色液浓缩至一定固形物含量，以利于后期结晶；再利用混合溶剂系统脱色与结晶、洗涤技术，即向高固形物含量的真空浓缩液中加入高浓度食用乙醇，使氨基酸结晶析出，而色素溶解在母液中，再通过洗涤，进一步去除残存色素，从而得到纯度高、色泽好的罗汉果氨基酸产品；通过干燥，即得成品罗汉果氨基酸。

本发明的有益效果如下：

(1)以鲜罗汉果生产过程中的离心废渣为原料，制备了罗汉果氨基酸。所得产品全部来自罗汉果或无籽罗汉果，生产过程中只使用纯化水和食用乙醇，无其它任何添加，食用安全，具有高的营养价值。

(2)实现了鲜罗汉果的综合利用，变废为宝，充分利用了鲜罗汉果生产过程中的离心废渣，在生产主产品罗汉果提取物的同时，也制备了有经济价值的副产品罗汉果氨基酸，创造明显的经济和社会效益。

(3)用不同类型的酶，作用于蛋白质分子不同结构部位，在最适条件下酶解，反应温和而彻底，将大分子蛋白质完全水解成小分子的水溶性氨基酸，而不是采用对氨基酸有破坏作用的酸水解或碱水解等剧烈水解条件，也不是简单的加入蛋白酶酶解，因为溶液中酶解无法对产品的品质进行有效、稳定的控制。

(4)本发明筛选了合适的提取条件，在保护转化后的氨基酸不被破坏的同时实现完全提取，提高氨基酸产品得率；用集成膜系统，其中无机陶瓷膜系统的错流过滤澄清技术，实现了离心液的澄清，完全去除了细小机械杂质对产品品质的影响，可以保证最终产品氨基酸的溶解液澄清；有机纳滤膜系统的分子量截留技术，实现了大分子杂质和未完全酶解的蛋白质、大部分色素等物质与目标产物氨基酸的分离，效果好且效率高；用混合溶剂系统脱色与结晶、洗涤，进一步去除残存色素，并得到纯度高、色泽好的罗汉果氨基酸产品，只用到食用乙醇和纯化水，而不用到复杂的脱色和结晶技术，也不用到对人体有害的有机溶剂，从而提高了产品的食用性和安全性。

(5)用创新的方法解决了鲜罗汉果生产过程中的离心废渣对环境影响的问题，从根本上解决了鲜罗汉果固体废弃物的问题。

(6)建立了新型的有关鲜罗汉果离心废渣的治理方法，且生产工艺简单可行，生产成本低，设备简单，治理成本低，适合推广。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的原料即鲜罗汉果生产过程中的离心废渣来自本公司生产车间。本发明实施例所使用的纯化水，系本公司生产车间用纯水设备制备。本发明实施例所使用的原辅材料，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，罗汉果氨基酸含量根据国标《GB/T 5009.124-2003食品中氨基酸的测定》采用茚三酮比色法测定。

实施例1

以鲜罗汉果在生产罗汉果提取物过程中的逆流提取槽提取液经卧螺离心和碟式离心所得沉淀为原料，进行以下步骤

1、覆膜发酵：取鲜罗汉果生产过程中的离心废渣500kg，加200kg温度55℃温水拌匀，覆膜发酵分3阶段进行：

①用稀盐酸水溶液调节体系的pH至5.0，然后加入0.3kg活化好的食品级酸性蛋白酶APRL型FDY-2205和0.25kg植物提取酶SPE-008，充分混合均匀，覆膜，50℃保温发酵5h；

②用稀氢氧化钠水溶液重新调节体系的pH至7.0，然后加入0.8kg活化好的食品级中性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2230，充分混合均匀，覆膜，50℃保温发酵5h；

③用稀氢氧化钠水溶液重新调节体系的pH至9.0，然后加入1.0kg活化好的食品级碱性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2227，充分混合均匀，覆膜，50℃保温发酵4h。

2、水提：将700kg发酵好的离心废渣混合物投入6m³提取罐，加水搅拌提取3次；水的加入量分别是4500L、4000L、3500L，第3次为套提；用稀盐酸水溶液调节第1次提取时溶液的pH至6.0，第2、3次提取不需要调；控制提取温度55℃；提取时间2.0h、1.5h、1.0h。提取完成以后，经提取系统的滤网过滤，得7900L提取液。

3、离心：将提取液依次通过卧螺离心机和碟式离心机，收集离心液。

4、集成膜系统澄清与精制、脱色：先将离心液通过材质为氧化锆、孔径为200nm的无机陶瓷膜系统，进完料以后，再加300L纯化水稀释上游液体后继续过陶瓷膜，合并陶瓷膜系统流出液，得到澄清透明的陶瓷膜滤液。

再将陶瓷膜滤液通过材质为聚酰胺，截留分子量为500的有机纳滤膜系统，控制操作压力为2.5MPa，进完料以后，再加300L纯化水稀释上游液体后继续过纳滤膜，合并纳滤膜流出液，得到8300L淡黄色的纳滤膜精制与脱色液。

5、真空浓缩：将纳滤膜精制与脱色液输入三效真空浓缩器，控制浓缩温度65℃、真空度0.08MPa，通过真空浓缩至浓缩液中固形物含量42wt％，得真空浓缩液。

6、混合溶剂系统脱色与结晶、洗涤：逐渐向真空浓缩液中加入浓度92％的食用乙醇，充分搅拌，当最后乙醇浓度达到85％时，将混合溶剂系统放置于2℃冷藏，使罗汉果氨基酸结晶逐渐析出。待结晶完全以后，抽滤，得罗汉果氨基酸结晶220kg；再向罗汉果氨基酸结晶中加入90％食用乙醇350L，充分搅拌与静置，残存色素逐渐溶解，然后将混合液过布袋离心，待全部物料过完布袋离心以后，再加入100L浓度90％的食用乙醇洗涤沉淀，得白色的罗汉果氨基酸结晶。

7、干燥：将罗汉果氨基酸结晶鼓风干燥，控制干燥温度为60℃，干燥至水分含量2.2wt％，得96.3kg产品罗汉果氨基酸。

用茚三酮比色法测试，成品总氨基酸含量98.62％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.02。

实施例2

以鲜罗汉果在生产罗汉果提取物过程中的逆流提取槽提取液经卧螺离心和碟式离心所得沉淀为原料。

1、发酵：取鲜罗汉果生产过程中的离心废渣300kg，加150kg温度50℃温水拌匀，分3阶段进行：

①用稀盐酸水溶液调节体系的pH至4.5，然后加入0..24kg活化好的食品级酸性蛋白酶APRL型FDY-2205和0.12kg植物提取酶SPE-008，充分混合均匀，覆膜，46℃保温发酵5h；

②用稀氢氧化钠水溶液重新调节体系的pH至7.5，然后加入0.60kg活化好的食品级中性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2230，充分混合均匀，覆膜，46℃保温发酵6h；

③用稀氢氧化钠水溶液重新调节体系的pH至9.5，然后加入0.55kg活化好的食品级碱性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2227，充分混合均匀，覆膜，46℃保温发酵4h。

2、水提：将450kg发酵好的离心废渣混合物投入6m³提取罐，加水搅拌提取3次；水的加入量分别是2700L、2400L、2100L，第3次套提；用稀盐酸水溶液调节第1次提取时溶液的pH至5.5，第2、3次提取不需要调；控制提取温度56℃；提取时间2.0h、1.5h、1.0h。提取完成以后，经提取系统的滤网过滤，得4700L提取液。

3、离心：将提取液依次通过卧螺离心机和碟式离心机，收集离心液。

4、集成膜系统澄清与精制、脱色：先将离心液通过材质为氧化铝、孔径为500nm的无机陶瓷膜系统，进完料以后，再加200L纯化水稀释上游液体后继续过陶瓷膜，合并陶瓷膜系统流出液，得到澄清透明的陶瓷膜滤液。

再将陶瓷膜滤液通过材质为聚酰胺，截留分子量为500的有机纳滤膜系统，控制操作压力为2.2MPa，进完料以后，再加250L纯化水稀释上游液体后继续过纳滤膜，合并纳滤膜流出液，得到8300L淡黄色的纳滤膜精制与脱色液。

5、真空浓缩：将纳滤膜精制与脱色液输入三效真空浓缩器，控制浓缩温度63℃、真空度-0.085MPa，通过真空浓缩至浓缩液中固形物含量45％，得真空浓缩液。

6、混合溶剂系统脱色与结晶、洗涤：逐渐向真空浓缩液中加入浓度95％的食用乙醇，充分搅拌，当乙醇浓度分别达到85％时，将混合溶剂系统放置于4℃冷藏，使罗汉果氨基酸结晶逐渐析出。待结晶完全以后，抽滤，得罗汉果氨基酸结晶123kg；再向罗汉果氨基酸结晶中加入90％食用乙醇200L，充分搅拌与静置，残存色素逐渐溶解，然后将混合液过布袋离心，待全部物料过完布袋离心以后，再加入80L浓度90％的食用乙醇洗涤沉淀，得白色的罗汉果氨基酸结晶。

7、干燥：将罗汉果氨基酸结晶鼓风干燥，控制干燥温度为62℃，干燥至水分2.0wt％，得57.7kg产品罗汉果氨基酸。

经检测，成品总氨基酸含量98.25％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.03。

实施例3

其它步骤与实施例1一致，区别在于步骤1中食品级酸性蛋白酶APRL型FDY-2205用量为0.15kg。所得产品干燥至水分含量2.2wt％，得93.5kg产品罗汉果氨基酸，成品总氨基酸含量97.55％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.03。

实施例4

其它步骤与实施例1一致，区别在于步骤1中食品级酸性蛋白酶APRL型FDY-2205用量为0.6kg。所得产品干燥至水分含量2.2wt％，得95.8kg产品罗汉果氨基酸，成品总氨基酸含量98.37％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.06。

实施例5

其它步骤与实施例1一致，区别在于步骤1中食品级中性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2230的用量为0.3kg。所得产品干燥至水分含量2.2wt％，得93.6kg产品罗汉果氨基酸，成品总氨基酸含量96.21％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.03。

实施例6

其它步骤与实施例1一致，区别在于步骤1中食品级中性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2230的用量为1.7kg。所得产品干燥至水分含量2.2wt％，得96.2kg产品罗汉果氨基酸，成品总氨基酸含量98.46％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.05。

实施例7

其它步骤与实施例1一致，区别在于步骤1中食品级碱性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2227的用量为0.5kg。所得产品干燥至水分含量2.2wt％，得92.4kg产品罗汉果氨基酸，成品总氨基酸含量96.83％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.04。

实施例8

其它步骤与实施例1一致，区别在于步骤1中食品级中性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2230的用量为2.0kg。所得产品干燥至水分含量2.2wt％，得96.1kg产品罗汉果氨基酸，成品总氨基酸含量97.82％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.05。

对比例1

其它步骤和实施例1相同，区别在于在覆膜发酵步骤中，不加入食品级酸性蛋白酶APRL型FDY-2205。最终干燥后得到91.2kg水分含量2.2wt％罗汉果氨基酸产品，经测试，成品总氨基酸含量95.51％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.12。

对比例2

其它步骤和实施例1相同，区别在于在覆膜发酵步骤中，不加入植物提取酶SPE-008，最终干燥后得到92.7kg水分含量2.2wt％的罗汉果氨基酸产品，经测试，成品总氨基酸含量94.32％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.09。

对比例3

其它步骤和实施例1相同，区别在于在覆膜发酵步骤中，省去了中性发酵的步骤，即不加入食品级中性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2230。最终干燥后得到92.3kg水分含量2.2wt％的罗汉果氨基酸产品，经测试，成品总氨基酸含量92.65％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.13。

对比例4

其它步骤和实施例1相同，区别在于在覆膜发酵步骤中，省去了碱性发酵的步骤，即不加入食品级碱性蛋白酶高活力浓缩型PDG-2227，干燥后得到91.3kg水分含量2.2wt％的罗汉果氨基酸产品，经测试，成品总氨基酸含量92.87％，稀释的水溶液(固体含量1％w/v)在420nm处的吸光度0.11。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种利用罗汉果离心废渣制备罗汉果氨基酸的方法，包括以下步骤：发酵、水提、离心、膜分离、真空浓缩、结晶洗涤、干燥，其特征在于，所述发酵是三个阶段的覆膜发酵，所述三个阶段分别是酸性发酵、中性发酵和碱性发酵；覆膜发酵的操作是将罗汉果离心废渣与温水拌匀，所述温水温度为45℃～55℃，温水的加入量为罗汉果离心废渣重量的0.3～0.7倍；所述酸性发酵条件是调节体系pH为酸性，然后加入食品级酸性蛋白酶和植物提取酶，覆膜，保温发酵，发酵时间为3～5h；所述中性发酵条件是调节体系pH为中性或弱碱性，加入食品级中性蛋白酶，覆膜，保温发酵，发酵时间为4～6h；所述碱性发酵条件是调节体系pH为碱性，加入食品级碱性蛋白酶，覆膜，保温发酵，发酵时间为2～4h；所述食品级酸性蛋白酶添加量为0.5～1.0kg/吨原料，植物提取酶用量为0.3～0.6kg/吨原料；所述食品级中性蛋白酶添加量为1.0～3.0kg/吨原料；所述食品级碱性蛋白酶添加量为1.5～3.5kg/吨原料；

所述食品级酸性蛋白酶规格型号为APRL型FDY-2205，所述植物提取酶规格型号为SPE-008；所述食品级中性蛋白酶为浓缩型PDG-2230；所述食品级碱性蛋白酶为浓缩型PDG-2227。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸性发酵条件为调节体系pH为4.0～5.0，保温温度为45℃～55℃；所述中性发酵条件为调节体系pH为7.0-8.5，保温温度为40℃～50℃；所述碱性发酵条件为调节体系pH为9.0-10.0，保温温度45℃～55℃。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述中性发酵条件为调节体系pH为7.0-7.5。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水提具体是将发酵好的离心废渣投入提取罐，加水搅拌提取，调节溶液的pH为弱酸性，提取温度为50℃～60℃，提取次数为1-5次，提取完成以后，经提取系统的滤网过滤，得提取液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，提取次数为3-4次；水提步骤中调节溶液pH弱酸性是指将溶液用稀盐酸调节pH为5.5-6.5。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜分离为二级膜过滤，离心液通过无机陶瓷膜系统得到黄色澄清透明的陶瓷膜滤液；再将陶瓷膜滤液通过有机纳滤膜系统，得到淡黄色的纳滤膜精制与脱色液。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，无机陶瓷膜材质为氧化铝或氧化锆，孔径为50～500nm；有机纳滤膜材质为聚酰胺，截留分子量为500～1000，操作压力为2.0～3.0MPa。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结晶是向真空浓缩液中逐渐加入高浓度乙醇，经充分搅拌与冷置，罗汉果氨基酸结晶逐渐析出，待结晶完全以后，过滤，得罗汉果氨基酸结晶；所述洗涤是向罗汉果氨基酸结晶中加入高浓度乙醇，充分搅拌与静置，残存色素逐渐溶解，过滤，所得沉淀再加高浓度乙醇，得白色的罗汉果氨基酸结晶。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述结晶过程中，在体系乙醇浓度达到85％以上时，经充分搅拌后将混合溶剂系统放置于1℃～5℃冷藏，以使结晶充分析出；所述高浓度乙醇是指乙醇浓度大于90％的食用乙醇，所述洗涤过程中两次加入的高浓度乙醇的用量和待洗涤的结晶物质的体积重量比，L/kg，依次为1.5-3：1和0.5-1：1。