CN107586820A - 一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物提取领域，特别涉及一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法。本发明提供的方法从罗汉果甜甙吸附树脂柱排出的废液生产罗汉果蛋白粉，充分提高了总蛋白转化率以及罗汉果蛋白的转化率。得到的罗汉果蛋白可以广泛应用于保健品行业、医药行业，变废为宝，使废液资源化，提高了罗汉果的附加值；消减了废液中的COD，大大地减轻了污水处理站的处理压力，对环境友好；本发明生产工艺简单，自动化程度高，效率高，稳定可靠。

Description

一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法

技术领域

本发明涉及植物提取领域，特别涉及一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法。

背景技术

罗汉果(学名：Siraitia grosvenorii)是葫芦科多年生藤本植物。其叶心形，雌雄异株，夏季开花，秋天结果。中医以其果实入药，含有罗汉果甜苷、多种氨基酸和维生素等药用成分，主治肺热痰火咳嗽、咽喉炎、扁桃体炎、急性胃炎、便秘等，是中国广西桂林市著名特产。罗汉果甜苷又称为甜味素，因其甜度高、热量低而作为甜味剂广泛使用，常作为肥胖者和糖尿病患者的代用糖。

罗汉果为卫生部首批公布的药食两用名贵中药材，其所含罗汉果甜甙比蔗糖甜300倍，不产生热量，是饮料、糖果行业的名贵原料，是蔗糖的最佳替代品。常饮罗汉果茶，可防多种疾病，现代医学证明，罗汉果对支气管炎、高血压等疾病有显著疗效，还是起到防治冠心病、血管硬化、肥胖症的作用。

鲜罗汉果生产过程的大孔吸附树脂柱排出的废液中主要含有罗汉果蛋白、膳食纤维以及少量氨基酸、无质盐、色素等。罗汉果蛋白和色素膳食纤维易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂，不溶于石油醚、氯仿、乙酸乙酯等低极性有机溶剂。

目前国内以鲜罗汉果为原料，生产高端罗汉果提取物——50％罗汉果苷V需要采用大孔吸附树脂富集。大孔吸附树脂本质是范德华力吸附，而732树脂本质是离子交换；大孔树脂吸附了大量罗汉果甜苷和色素而对罗汉果蛋白没有吸附，因此，当罗汉果甜苷进行富集时，罗汉果蛋白的水溶液则完全流出吸附树脂柱造成了严重的环境污染。

国内外学者对罗汉果蛋白的化学结构与理化性质进行了研究，但对罗汉果蛋白粉的生产少有报导。从2000年开始，生产50％罗汉果苷V的罗汉果提取物企业，都是将新鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废液作为生产废水。条件好的公司是先排入公司的污水站，经过滤、厌氧、好氧、脱色等处理，使处理废水的COD≦500后排入园区污水管网做进一步处理；条件差的公司仅靠自己公司简单处理即排放。虽然都经过了环保处理，但并未真正达到直排水标准，只是处理程度上有区别，仍然造成了环境污染，并且是造成生产罗汉果污染环境的重要原因。

目前尚未有从新鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废液生产成罗汉果蛋白粉的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法。该方法从罗汉果甜甙吸附树脂柱排出的废液中生产罗汉果蛋白粉的工艺；本工艺可以变废为宝，保护环境，提高罗汉果的附加值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：获得罗汉果甜甙提取废液；

步骤2：取所述废液调节pH值后，与蛋白酶混合酶解，制得前处理溶液；

步骤3：取步骤2获得的所述前处理溶液经陶瓷膜澄清、超滤膜超滤，收集分子量为500～50000的部分，得超滤膜透过液；

步骤4：取步骤3所述的超滤膜透过液经蛋白吸附树脂层析，洗脱后收集洗脱液，回收溶媒，冷却离心，收集上清液；

所述蛋白吸附树脂层析采用非极性大孔吸附树脂或强酸性阳离子树脂；所述洗脱液为体积浓度为65％的乙醇水溶液或2N的氨水。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述pH值为5.5～6.5。

在本发明的一些具体实施方案中，所述酶解的温度为50℃～55℃，所述酶解的时间为120～240min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蛋白酶为中性蛋白酶，所述中性蛋白酶的活性为6万u/g，所述蛋白酶的加入量为所述废液质量的0.1～0.3％。

在本发明的一些具体实施方案中，所述陶瓷膜的孔径为0.45μm。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蛋白吸附树脂层析的上料比为10:4；上料的流速为2400L/h～3600L/h(1.0～1.5BV/h)。

在本发明的一些具体实施方案中，所述洗脱为：取离子交换树脂重量2.5倍，体积浓度为65％的乙醇水溶液或2N的氨水以流速2400L/h(1.0BV/h)解吸，收集溶剂解吸液后，进纯化水洗柱，洗至流出液溶剂浓度＜10％止，收集水洗溶剂液；合并所述溶剂解吸液和所述水洗溶剂液，得解吸液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述回收溶媒为在真空度为0.085～0.095Mpa、温度55～65℃的条件下，回收溶媒至4～7波美。

在本发明的一些具体实施方案中，所述冷却离心之后还包括真空减压浓缩和喷雾干燥的步骤；

所述真空减压浓缩具体为：在真空度位0.085～0.095Mpa、温度为55～65℃的条件下，浓缩至14～17波美；所述喷雾干燥的进风温度为185～195℃，出风温度80～90℃。

本发明提供了所述的方法制得的罗汉果蛋白。

本发明提供的方法从罗汉果甜甙吸附树脂柱排出的废液生产罗汉果蛋白粉，充分提高了总蛋白转化率以及罗汉果蛋白的转化率。得到的罗汉果蛋白可以广泛应用于保健品行业、医药行业，变废为宝，使废液资源化，提高了罗汉果的附加值；消减了废液中的COD，大大地减轻了污水处理站的处理压力，对环境友好；本发明生产工艺简单，自动化程度高，效率高，稳定可靠。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是本发明提供的从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的工艺流程。

具体实施方式

本发明公开了一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实现本发明目的的技术方案是：

罗汉果甜甙吸附树脂柱排出的废液→调节pH→提高溶液稳定性→0.45um陶瓷膜澄清→分子量超滤分离→蛋白吸附树脂层析→洗脱→回收溶媒→低温冷却离心→真空减压浓缩制膏→干燥。

一种从罗汉果甜甙吸附树脂柱排出的废液中生产罗汉果蛋白粉的工艺，包括如下步骤：

1)调节pH

将鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废液泵入搅拌罐中，向搅拌罐内加入浓度为2～4％的稀氢氧化钠溶液，不断搅拌混匀，调节溶液pH为5.5～6.5之间，得调pH液。

2)提高溶液稳定性

在不断搅拌、保温50-55℃下向调pH液中加入溶液重量0.1～0.3％的蛋白酶，水解完全后升温至90℃进行灭酶，冷却至室温得到理化性质稳定的前处理溶液。

3)0.45um陶瓷膜澄清

将前处理溶液泵入陶瓷膜上游罐，陶瓷膜孔径0.45um，开启陶瓷膜成套设备运行，去除后沉淀及冷不溶杂质，得陶瓷膜清液；

4)分子量超滤分离

将陶瓷膜清液泵入超滤膜上游罐，开启超滤膜成套设备运行，根据罗汉果蛋白的分子量大小在常温常压下进行分离，滤除无质盐后收集分子量在500～50000的部分，得超滤膜透过液。

5)蛋白吸附树脂层析

将超滤膜透过液泵入层析高位罐，控制高位罐进料及层析柱出料流速为2400L/h～3600L/h(1.0～1.5BV/h)，上料比为每1000kg超滤膜透过液用型号AMBERLITE XAD16(非极性大孔聚苯乙烯吸附)、或AMBERLITE XAD2(非极性大孔聚苯乙烯吸附)、或732强酸性阳离子树脂(苯乙烯型)的树脂400kg。

进完料以后，用纯化水以流速3600L/h～4800L/h(1.5～2.0BV/h)洗柱，洗至流出液澄清透明接近无色。开启空压反冲3min，继续用纯化水以相同流速洗至流出液澄清透明接近无色。共开启空压反冲洗柱3次。

水洗柱完成以后，用离子交换树脂重量2.5倍，浓度65％的食用乙醇水溶液或2个当量浓度的氨水以流速2400L/h(1.0BV/h)解吸，收集溶剂解吸液；进完洗脱溶剂解吸后，继续进纯化水洗柱，洗至流出液溶剂浓度＜10％止，收集此部分水洗溶剂液。

合并溶剂解吸液以及水洗溶剂液，得解吸液。

6)回收溶媒

用真空将解吸液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.085～0.095Mpa、温度55～65℃，回收溶媒至4～7波美，得初步浓缩膏。

7)低温冷却离心

将初步浓缩膏通过控温-8～0℃的二级板式换热器冷却，降温至10～15℃，使解吸液中的后沉淀及冷不溶杂质析出，得低温冷却液；

8)真空减压浓缩制膏

用真空将低温冷却液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.085～0.095Mpa、温度55～65℃，浓缩至14～17波美，得浓缩膏。

9)喷雾干燥

将浓缩膏放入洁净区的加热搅拌罐，开启喷雾干燥成套设备运行，控制进风温度185～195℃，出风温度80～90℃，得罗汉果蛋白粉。

经检验，罗汉果蛋白粉产品颜色为米白色至浅黄色、罗汉果蛋白含量50～60％(国标)。

步骤1)中，所述的调节pH所用碱为浓度2～4％的氢氧化钠，最终溶液所调pH为5.5～6.6。

步骤2)中，所述的提高溶液稳定性所用物质为广西南宁庞博公司的中性蛋白酶(6万u/g)，加入量为溶液重量的0.1～0.3％

步骤3)中，所述的陶瓷膜孔径为0.45um。

步骤4)中，所述的分子量分离采用的超滤膜的截留分子量为500～50000。

步骤5)中，所述蛋白吸附树脂层析的吸附树脂型号为AMBERLITE XAD16(非极性大孔聚苯乙烯吸附)、或AMBERLITE XAD2(非极性大孔聚苯乙烯吸附)、或732强酸性阳离子树脂(苯乙烯型)，树脂使用量为每1000kg前处理溶液用400kg吸附树脂，解吸溶媒为浓度65％的食用乙醇水溶液或2个当量浓度的氨水，解吸溶媒加入量为大孔吸附树脂重量2.5倍。

步骤6)中，所述回收溶媒的真空度为0.085～0.095Mpa、温度为55～65℃，回收溶媒至4～7波美。

步骤7)中，所述的低温冷却离心的设备为控温-8～0℃的二级板式换热器，冷却程度为10～15℃。

步骤8)中，所述真空减压浓缩的真空度为0.085～0.095Mpa、温度为55～65℃，浓缩至14～17波美。

步骤9)中，所述喷雾干燥的进风温度185～195℃，出风温度80～90℃。

从鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废水显酸性，罗汉果蛋白以分子形式存在且不稳定，需要将溶液的pH调节至近中性，并加入蛋白酶酶解以提升溶液的稳定性。罗汉果甜苷和色素可以被特定的大孔吸附树脂吸附，而蛋白质、膳食纤维、无机盐类等不被甜苷吸附树脂吸附而从树脂柱流出，通过调节PH值、酶解澄清，然后用特定树脂吸附，最后溶媒解吸分离提纯罗汉果蛋白。在富集蛋白前期，通过陶瓷膜的澄清、超滤分子分离技术将物料进行初步提纯。为避免后期产品出现浑浊，需要对解吸液低温冷却以使后沉淀和冷不溶成分析出。

本发明的优点：

1、本发明提供的方法从罗汉果甜甙吸附树脂柱排出的废液生产罗汉果蛋白粉，可以广泛应用于保健品行业、医药行业，变废为宝，使废液资源化，提高了罗汉果的附加值；

2、消减了废液中的COD，大大地减轻了污水处理站的处理压力，对环境友好；

3、本发明生产工艺简单，自动化程度高，效率高，稳定可靠。

本发明提供的一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

新鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废液来源，新鲜罗汉果3000KG经过喷淋水洗，然后破碎，用连续逆流提取机在90-95℃进行提取，得到提取液12吨冷却到室温后离心，去除固体物；去除固体物的提取液采用陶瓷膜严密过滤，滤过液上1000升AB-8树脂，其流出液即为废液(加上水洗树脂柱的水量，废液总量大概为18吨，干物率0.8-1.0％)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

新鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废液来源，新鲜罗汉果3000KG经过喷淋水洗，然后破碎，用连续逆流提取机在90-95℃进行提取，得到提取液12吨冷却到室温后离心，去除固体物；去除固体物的提取液采用陶瓷膜严密过滤，滤过液上1000升AB-8树脂，其流出液即为废液(加上水洗树脂柱的水量，废液总量大概为18吨，干物率0.8-1.0％)。

1)调节pH

将鲜罗汉果(1500Kg)生产过程的脱色树脂柱排出的废液6000L泵入搅拌罐中，向搅拌罐内加入浓度为2％的稀氢氧化钠溶液，不断搅拌混匀，调节溶液pH为5.5，得调pH液。

2)提高溶液稳定性

在不断搅拌下，调节调pH液温度为51℃下加入6kg中性蛋白酶(6万u/g)，溶解混匀并酶解3小时，水解完全后升温至90℃进行灭酶，冷却至室温，得到理化性质稳定的前处理溶液。

3)0.45um陶瓷膜澄清

将前处理溶液泵入陶瓷膜上游罐，陶瓷膜孔径0.45um，开启陶瓷膜成套设备运行，去除后沉淀及冷不溶杂质，得陶瓷膜清液；

4)分子量超滤分离

将陶瓷膜清液泵入超滤膜上游罐，开启超滤膜成套设备运行，根据罗汉果蛋白的分子量大小在常温常压下进行分离，收集分子量在500～10000的部分，得超滤膜液6500Kg。

5)树脂吸附

将超滤膜液泵入层析高位罐，通过装有2400kg型号为AMBERLITE XAD2的树脂柱，控制高位罐进料及层析柱出料流速为2400L/h。

进完料以后，用纯化水以流速3800L/h洗柱，洗至流出液澄清透明接近无色。开启空压反冲3min，继续用纯化水以相同流速洗至流出液澄清透明接近无色。共开启空压反冲洗柱3次。

水洗柱完成以后，用6000L浓度65％的食用乙醇水溶液以流速2400L/h解吸，收集65％乙醇解吸液；进完65％乙醇解吸后，继续进纯化水洗柱，洗至流出液乙醇＜10％止，收集此部分水洗乙醇液。

合并65％乙醇解吸液以及水洗乙醇液，得解吸液。

6)真空减压回收溶剂

用真空将解吸液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.087Mpa、温度60℃，回收乙醇并浓缩至5波美，得初步浓缩膏。

7)低温冷却离心

将初步浓缩膏通过控温-4℃的二级板式换热器冷却，降温至12℃，使解吸液中的后沉淀及冷不溶杂质析出，然后物料通过卧螺和碟式串联离心得低温冷却液；

8)真空减压浓缩制膏

用真空将低温冷却液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.087Mpa、温度60℃，浓缩至15波美，得浓缩膏。

9)喷雾干燥

将浓缩膏放入洁净区的加热搅拌罐，开启喷雾干燥成套设备运行，控制进风温度185℃，出风温度84℃，得罗汉果蛋白粉51kg。

经检验，罗汉果蛋白粉产品颜色为浅黄色，其中，总蛋白的含量为52.3％(UV)，总蛋白的提取率为100％。

实施例2

新鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废液来源，新鲜罗汉果3000KG经过喷淋水洗，然后破碎，用连续逆流提取机在90-95℃进行提取，得到提取液12吨冷却到室温后离心，去除固体物；去除固体物的提取液采用陶瓷膜严密过滤，滤过液上1000升AB-8树脂，其流出液即为废液(加上水洗树脂柱的水量，废液总量大概为18吨，干物率0.8-1.0％)。

1)调节pH

将鲜罗汉果(1500Kg)生产过程的脱色树脂柱排出的废液6000L泵入搅拌罐中，向搅拌罐内加入浓度为4％的稀氢氧化钠溶液，不断搅拌混匀，调节溶液pH为6.5，得调pH液。

2)提高溶液稳定性

在不断搅拌下，调节调pH液温度为55℃下加入12kg中性蛋白酶(6万u/g)，溶解混匀并酶解3小时，水解完全后升温至90℃进行灭酶，冷却至室温，得到理化性质稳定的前处理溶液。

3)0.45um陶瓷膜澄清

将前处理溶液泵入陶瓷膜上游罐，陶瓷膜孔径0.45um，开启陶瓷膜成套设备运行，去除后沉淀及冷不溶杂质，得陶瓷膜清液；

4)分子量超滤分离

将陶瓷膜清液泵入超滤膜上游罐，开启超滤膜成套设备运行，根据罗汉果蛋白的分子量大小在常温常压下进行分离，收集分子量在500～30000的部分，得超滤膜液6300Kg。

5)树脂吸附

将超滤膜液泵入层析高位罐，通过装有2400kg型号为AMBERLITE XAD2的树脂柱，控制高位罐进料及层析柱出料流速为3200L/h。

进完料以后，用纯化水以流速3600L/h洗柱，洗至流出液澄清透明接近无色。开启空压反冲3min，继续用纯化水以相同流速洗至流出液澄清透明接近无色。共开启空压反冲洗柱3次。

水洗柱完成以后，用6000L浓度65％的食用乙醇水溶液以流速2400L/h解吸，收集65％乙醇解吸液；进完65％乙醇解吸后，继续进纯化水洗柱，洗至流出液乙醇＜10％止，收集此部分水洗乙醇液。

合并65％乙醇解吸液以及水洗乙醇液，得解吸液。

6)真空减压回收溶剂

用真空将解吸液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.095Mpa、温度65℃，回收乙醇并浓缩至4波美，得初步浓缩膏。

7)低温冷却离心

将初步浓缩膏通过控温0℃的二级板式换热器冷却，降温至15℃，使解吸液中的后沉淀及冷不溶杂质析出，然后物料通过卧螺和碟式串联离心得低温冷却液；

8)真空减压浓缩制膏

用真空将低温冷却液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.085Mpa、温度55℃，浓缩至14波美，得浓缩膏。

9)喷雾干燥

将浓缩膏放入洁净区的加热搅拌罐，开启喷雾干燥成套设备运行，控制进风温度195℃，出风温度90℃，得罗汉果蛋白粉44.3kg。

经检验，罗汉果蛋白粉产品颜色为浅黄色，其中，总蛋白的含量为60.0％(UV)，总蛋白的提取率为100％。

实施例3

新鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废液来源，新鲜罗汉果3000KG经过喷淋水洗，然后破碎，用连续逆流提取机在90-95℃进行提取，得到提取液12吨冷却到室温后离心，去除固体物；去除固体物的提取液采用陶瓷膜严密过滤，滤过液上1000升AB-8树脂，其流出液即为废液(加上水洗树脂柱的水量，废液总量大概为18吨，干物率0.8-1.0％)。

1)调节pH

将鲜罗汉果(1500Kg)生产过程的脱色树脂柱排出的废液6000L泵入搅拌罐中，向搅拌罐内加入浓度为3％的稀氢氧化钠溶液，不断搅拌混匀，调节溶液pH为6.0，得调pH液。

2)提高溶液稳定性

在不断搅拌下，调节调pH液温度为50℃下加入18kg中性蛋白酶(6万u/g)，溶解混匀并酶解3小时，水解完全后升温至90℃进行灭酶，冷却至室温，得到理化性质稳定的前处理溶液。

3)0.45um陶瓷膜澄清

将前处理溶液泵入陶瓷膜上游罐，陶瓷膜孔径0.45um，开启陶瓷膜成套设备运行，去除后沉淀及冷不溶杂质，得陶瓷膜清液；

4)分子量超滤分离

将陶瓷膜清液泵入超滤膜上游罐，开启超滤膜成套设备运行，根据罗汉果蛋白的分子量大小在常温常压下进行分离，收集分子量在500～50000的部分，得超滤膜液6700Kg。

5)树脂吸附

将超滤膜液泵入层析高位罐，通过装有2400kg型号为AMBERLITE XAD2的树脂柱，控制高位罐进料及层析柱出料流速为2800L/h。

进完料以后，用纯化水以流速4800L/h洗柱，洗至流出液澄清透明接近无色。开启空压反冲3min，继续用纯化水以相同流速洗至流出液澄清透明接近无色。共开启空压反冲洗柱3次。

水洗柱完成以后，用6000L浓度65％的食用乙醇水溶液以流速2400L/h解吸，收集65％乙醇解吸液；进完65％乙醇解吸后，继续进纯化水洗柱，洗至流出液乙醇＜10％止，收集此部分水洗乙醇液。

合并65％乙醇解吸液以及水洗乙醇液，得解吸液。

6)真空减压回收溶剂

用真空将解吸液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.085Mpa、温度55℃，回收乙醇并浓缩至7波美，得初步浓缩膏。

7)低温冷却离心

将初步浓缩膏通过控温-8℃的二级板式换热器冷却，降温至10℃，使解吸液中的后沉淀及冷不溶杂质析出，然后物料通过卧螺和碟式串联离心得低温冷却液；

8)真空减压浓缩制膏

用真空将低温冷却液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.095Mpa、温度65℃，浓缩至17波美，得浓缩膏。

9)喷雾干燥

将浓缩膏放入洁净区的加热搅拌罐，开启喷雾干燥成套设备运行，控制进风温度190℃，出风温度80℃，得罗汉果蛋白粉53kg。

经检验，罗汉果蛋白粉产品颜色为浅黄色，其中，总蛋白的含量为50.0％(UV)，总蛋白的提取率为100％。

实施例4

新鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废液来源，新鲜罗汉果3000KG经过喷淋水洗，然后破碎，用连续逆流提取机在90-95℃进行提取，得到提取液12吨冷却到室温后离心，去除固体物；去除固体物的提取液采用陶瓷膜严密过滤，滤过液上1000升AB-8树脂，其流出液即为废液(加上水洗树脂柱的水量，废液总量大概为18吨，干物率0.8-1.0％)。

1)调节pH

将鲜罗汉果(1500Kg)生产过程的脱色树脂柱排出的废液6000L泵入搅拌罐中，向搅拌罐内加入浓度为3％的稀氢氧化钠溶液，不断搅拌混匀，调节溶液pH为5.8，得调pH液。

2)提高溶液稳定性

在不断搅拌下，调节调pH液温度为52℃下加入18kg中性蛋白酶(6万u/g)，溶解混匀并酶解3小时，水解完全后升温至90℃进行灭酶，冷却至室温，得到理化性质稳定的前处理溶液。

3)0.45um陶瓷膜澄清

将前处理溶液泵入陶瓷膜上游罐，陶瓷膜孔径0.45um，开启陶瓷膜成套设备运行，去除后沉淀及冷不溶杂质，得陶瓷膜清液；

4)分子量超滤分离

将陶瓷膜清液泵入超滤膜上游罐，开启超滤膜成套设备运行，根据罗汉果蛋白的分子量大小在常温常压下进行分离，收集分子量在500～50000的部分，得超滤膜液6400Kg。

5)树脂吸附

将超滤膜液泵入层析高位罐，通过装有2400kg型号为AMBERLITE XAD2的树脂柱，控制高位罐进料及层析柱出料流速为3600L/h。

进完料以后，用纯化水以流速4200L/h洗柱，洗至流出液澄清透明接近无色。开启空压反冲3min，继续用纯化水以相同流速洗至流出液澄清透明接近无色。共开启空压反冲洗柱3次。

水洗柱完成以后，用6000L浓度65％的食用乙醇水溶液以流速2400L/h解吸，收集65％乙醇解吸液；进完65％乙醇解吸后，继续进纯化水洗柱，洗至流出液乙醇＜10％止，收集此部分水洗乙醇液。

合并65％乙醇解吸液以及水洗乙醇液，得解吸液。

6)真空减压回收溶剂

用真空将解吸液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.088Mpa、温度57℃，回收乙醇并浓缩至8波美，得初步浓缩膏。

7)低温冷却离心

将初步浓缩膏通过控温-8℃的二级板式换热器冷却，降温至9℃，使解吸液中的后沉淀及冷不溶杂质析出，然后物料通过卧螺和碟式串联离心得低温冷却液；

8)真空减压浓缩制膏

用真空将低温冷却液吸入内循环减压浓缩器，开启真空减压浓缩设备运行，控制真空度0.092Mpa、温度63℃，浓缩至16波美，得浓缩膏。

9)喷雾干燥

将浓缩膏放入洁净区的加热搅拌罐，开启喷雾干燥成套设备运行，控制进风温度188℃，出风温度85℃，得罗汉果蛋白粉46kg。

经检验，罗汉果蛋白粉产品颜色为浅黄色，其中，总蛋白的含量为58.7％(UV)，总蛋白的提取率为100％。

对比例1

新鲜罗汉果生产过程的吸附树脂柱排出的废液来源，新鲜罗汉果3000KG经过喷淋水洗，然后破碎，用连续逆流提取机在90-95℃进行提取，得到提取液12吨冷却到室温后离心，去除固体物；去除固体物的提取液采用陶瓷膜严密过滤，滤过液上1000升AB-8树脂，其流出液即为废液(加上水洗树脂柱的水量，废液总量大概为18吨，干物率0.13-0.15％)。

先排入污水站调节池，加入特制药水循环处理，滤除大部分分子量较大的有机物，初步处理的污水然后经过厌氧塔处理、从厌氧塔出来的污水再一次经过好氧池、沉淀池等处理，使处理废水的COD₅₀₀后排入园区污水管网做进一步处理。

实施例5重铬酸钾法检测COD

一、器材

1.250mL全玻璃回流装置；

2.四联可调电炉；

3.25或50ml酸式滴定管、锥形瓶、移液管、容量瓶等。

二、试剂

1.重铬酸钾标准溶液(C＝0.2500mo1/L)：称取预先在120℃烘干2h的基准或优质纯重铅酸钾12.258g溶于水中，移入1000mL容量瓶，稀释至标线，摇匀。

2.试亚铁灵指示剂：称取1.485g邻菲啰啉(C12H8N2.H2O)、0.695g硫酸亚铁FeSO4.7H2O)溶于水中，稀释至100ml，贮于棕色瓶内。

3.硫酸亚铁铵标准溶液(c≈0.1mol/L)：称取39.5g硫酸亚铁铵溶于水中，边搅拌边缓慢加入20mL浓硫酸，冷却后移入1000ml容量瓶中，加入稀释至标线，摇匀。临用前，用重铬酸钾标准溶液标定。

标定方法：准确吸取10.00ml重铬酸钾标准溶液于500mL锥形瓶中，加入稀释至110ml左右，缓慢加入30mL浓硫酸，混匀。冷却后，加入3滴试亚铁灵指试液(约0.15mL)，用硫酸亚铁铵溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点。

式中；C——硫酸亚铁铵标准溶液的浓度(mol/L)；

V——硫酸亚铁铵标准溶液的用量(ml)。

4.硫酸一硫酸银溶液：于500mL浓硫酸中加入5g硫酸银。放置l

－2d，不时摇动使其溶解。

5.硫酸汞：结晶或粉末。

6.待测样品

三、测定步骤

1.取20.00mL混合均匀的水样(或适量水样稀释至20.00mL)置于250mL磨口的回流锥形瓶中,准确加入10.00mL重铬酸钾标准溶液及数颗小玻璃珠或沸石，连接磨口回流冷凝管，从冷凝管上口慢慢地加入30mL硫酸一硫酸银溶液，轻轻摇动锥形瓶,使溶液摇匀，加热回流2h(自开始沸腾时计时)。对于化学需氧量高的废水样，可先取上述操作所需体积1/10的废水样和试剂于15×150mm硬质玻璃试管中，摇匀，加热后观察是否成绿色。如溶液显绿色，再适当减少废水取样量，直至溶液不变为止，从而确定废水样分析时应取用的体积。稀释时，所取废水样量不得少于5ml。，如果化学需氧量很高，则废水样应多次稀释。废水中氯离子含量超过30mg/L时，应先把0.4g硫酸汞加入回流锥形瓶中，再加20.00mL废水(或适量废水稀释至20.00mL)，摇匀。

2.冷却后，用90ml水冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶。溶液总体积不得少于140mL，否则因酸度太大，滴定终点不明显。

3.溶液再度冷却后，加3滴试亚铁灵指示液，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。

4.测定水样的同时，取20.00mL重蒸馏水，按同样操作空白实验。记录滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的用量。

四、计算

COD＝(V0-V1)*c*8*1000/V2

式中C——硫酸亚铁标准溶液的浓度(mol/L)；

V0——滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液用量(mL)；

V1——滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液的用量(mL)；

V2——滴定水样时水样的体积(mL)；

8——氧(l/2)摩尔质量(g/moL)；

试验结果见表1。

表1

注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)；

通过最后污水需要处理的COD值比较，没有经过蛋白回收的污水其COD极显著(P＜0.01)高于经过蛋白回收的污水，进而其污水处理的费用大大增加。

实施例6蛋白质含量的测定

仪器与试剂

仪器：普析1900紫外-可见分光光度计；岛津YU120型万分之一电子分析天平；KQ25超声清洗器；

试剂：

1、0.1当量的氢氧化钠，2％的碳酸钠，1％硫酸铜，2％的酒石酸钾钠；

2、溶液A：0.1当量的氢氧化钠和2％的碳酸钠按1：1混合；

3、溶液B：1％的硫酸铜和2％的酒石酸钾钠按1：1混合；

4、碱性溶剂：100mlA溶液与200mlB溶液混合；

5、福林酚试剂：5ml(2N)当量的福林酚+5ml的蒸馏水。

配置试剂：

1、溶液A：0.1当量的氢氧化钠和2％的碳酸钠按1：1混合

2、溶液B：1％的硫酸铜和2％的酒石酸钾钠按1：1混合

3、碱性溶剂：100mlA溶液与200mlB溶液混合

4、福林酚试剂：5ml(2N)当量的福林酚+5ml的蒸馏水

对照品溶液制备：

1、称取40mg的牛血清蛋白放于50ml的量瓶中

2、溶0.1N的氢氧化钠再以0.1N的氢氧化钠定容至刻度

3、用移液管吸收1ml的上溶液到度管里

4、加入5ml碱性溶液并混合均匀放置10分钟

5、加入0.5ml的福林酚试剂

样品准备：

1、称取50mg的样品放入50ml的量瓶中

2、溶于0.1N的氢氧化钠再以0.1N的氢氧化钠定容至刻度

3、用移液管吸取1ml的以上溶液放到试管里

4、加入5ml碱性溶液并混合均匀放置10分钟

5、加入0.5ml的福林酚试剂

测定：

将制定好的样品和标准品在黑暗的环境下放置30分钟，以660nm测定并以蒸馏水为空白对照。

原始数据记录:

对照品称样量，对照品蛋白质含量，对照品吸光度A标，总蛋白样品称样量，样品吸光度A样。

结果计算：

A--吸光值

V--样品的稀释倍数

M－样品的称样量

表2

注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)；

如上表中实施例与对照组相比，在经过蛋白的回收工艺后获得的产品在蛋白粉含量上具有极显著差异(P＜0.01)。

实施例7生产工艺的测评

实验组：实施例1～实施例4；

对照组：对比例1；

对实验组和对照组进行工艺测评，结果见表3。

表3

注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。

经上表中数据对比，在同样投料罗汉果原料的情况下，经过蛋白回收工序，在污水的处理上可以变废为宝获得价值4万元的产品；而对照组1没有进行蛋白回收工序的污水直接进行污水处理，需发费2160元进行污水处理。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从罗汉果的甜甙提取废液中生产罗汉果蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：获得罗汉果甜甙提取废液；

步骤2：取所述废液调节pH值后，与蛋白酶混合酶解，制得前处理溶液；

步骤3：取步骤2获得的所述前处理溶液经陶瓷膜澄清、超滤膜超滤，收集分子量为500～50000的部分，得超滤膜透过液；

步骤4：取步骤3所述的超滤膜透过液经蛋白吸附树脂层析，洗脱后收集洗脱液，回收溶媒，冷却离心，收集上清液；

所述蛋白吸附树脂层析采用非极性大孔吸附树脂或强酸性阳离子树脂；所述洗脱液为体积浓度为65％的乙醇水溶液或2N的氨水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述pH值为5.5～6.5。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酶解的温度为50℃～55℃，所述酶解的时间为120～240min。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为中性蛋白酶，所述中性蛋白酶的活性为6万u/g，所述蛋白酶的加入量为所述废液质量的0.1～0.3％。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔径为0.45μm。

6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白吸附树脂层析的上料比为10:4；上料的流速为2400L/h～3600L/h。

7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱为：取离子交换树脂重量2.5倍，体积浓度为65％的乙醇水溶液或2N的氨水以流速2400L/h解吸，收集溶剂解吸液后，进纯化水洗柱，洗至流出液溶剂浓度＜10％止，收集水洗溶剂液；合并所述溶剂解吸液和所述水洗溶剂液，得解吸液。

8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述回收溶媒为在真空度为0.085～0.095Mpa、温度55～65℃的条件下，回收溶媒至4～7波美。

9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，所述冷却离心之后还包括真空减压浓缩和喷雾干燥的步骤；

所述真空减压浓缩具体为：在真空度位0.085～0.095Mpa、温度为55～65℃的条件下，浓缩至14～17波美；所述喷雾干燥的进风温度为185～195℃，出风温度80～90℃。

10.根据权利要求1至9任一项所述的方法制得的罗汉果蛋白。