CN108467416A - 山茱萸提取莫诺苷、马钱苷和熊果酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种山茱萸提取熊果酸、马钱苷和莫诺苷的方法，将山茱萸果实干燥粉碎，醇提，过滤，真空或减压浓缩，过滤得滤液，滤渣经枯草芽孢杆菌发酵，醇提，过滤得合并滤液，上AB‑8大孔树脂柱，得莫诺苷纯品；将滤渣和滤渣甲醇溶解，上硅胶柱分别获得熊果酸、马钱苷，结晶重结晶一次得纯品。

Description

山茱萸提取莫诺苷、马钱苷和熊果酸的方法

技术领域

本发明属于天然产物提取技术领域，涉及一种山茱萸提取熊果酸、马钱苷和莫诺苷的方法。

背景技术

山茱萸的成熟干燥果实，去核后即为名贵药材山芋肉。果肉内含有16种氨基酸，另外，含有大量人体所必需的元素。另外，含有生理活性较强的皂甙原糖、多糖、苹果酸、酒石酸、酚类、树脂、鞣质和维生素A、C等成分。果肉入药，为收敛性补血剂及强壮剂；可健胃、补肝肾、治贫血、腰痛、神经及心脏衰弱等症。其性味酸涩、入肝、肾经。酸涩收敛，有滋肝补肾、固肾涩精的作用，适用于肝肾不足所致的腰膝酸软、遗精滑泄、眩晕耳鸣之症。

莫诺苷主要来源于山茱萸，山茱萸的果肉内含有16种氨基酸，另外，含有大量人体所必需的元素。另外，含有生理活性较强的皂甙原糖、多糖、苹果酸、酒石酸、酚类、树脂、鞣质和维生素A、C等成分。其味酸涩，具有滋补、健胃、利尿、补肝肾，益气血等功效。主治血压高、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、阳萎遗精、月经过多等症。

熊果酸高含量为有光泽的棱柱状(无水乙醇)或细毛样针状结晶(稀乙醇)，低含量为棕黄色或黄绿色粉末，具特殊的气味，是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物。不溶于水，尚溶于甲醇，乙醇，丙酮，吡啶，石油醚。具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能，因而被广泛地用作医药和化妆品原料。熊果酸临床表现有显著而迅速降低谷丙转氨酶、血清转氨酶、消退黄疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能的作用，具有见效快、疗程短、效果稳定的特点。现已有较多文献资料公开了熊果酸提取纯化工艺研究。

公开号为CN1569867的中国专利公开了一种山茱萸提取物莫诺苷的制备方法，包括下列步骤：山茱萸药材用乙醇提取，减压浓缩，浓缩液加水沉淀，上清液用大孔吸附树脂或活性炭进行柱层析，用水和稀醇洗去杂质，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩并干燥后，经反相硅胶分离得到粉末状山茱萸提取物莫诺苷。

公开号为CN101385735的中国专利公开了一种莫诺苷的制备方法，`山茱萸药材粉碎后水洗醇沉；醇沉液浓缩，调节PH值至1～3上非极性～弱极性的大孔树脂，水洗至无色，再用10％～30％的乙醇溶液洗脱3～5倍柱体积，收集洗脱液，浓缩；浓缩液上非极性～弱极性的大孔树脂，水洗，再用10％～30％的乙醇溶液洗脱3～5倍柱体积，收集洗脱液，低温减压干燥，结晶即得。该方法在低pH条件下易发生莫诺苷水解，会造成其产率下降。

公开号为CN101974048A的中国专利公开了一种从山茱萸中提取莫诺苷的方法，包括以下几个步骤：1)超声醇提：将山茱萸原料粉碎加4‐15倍量乙醇，常温超声提取1‐3小时提取2‐3次；2)大孔树脂吸附：将提取液回收乙醇，过滤，加入大孔树脂柱吸附，水→醇梯度洗脱，收集莫诺苷流分；3)膜过滤：上述莫诺苷流分加入超滤膜超滤，再加入纳滤膜纳滤，收集浓缩液；4)萃取；将上述浓缩液加水饱和正丁醇萃取3‐5次，合并萃取液，减压浓缩，得浓缩浸膏；5)结晶：将浸膏溶于乙酸乙酯，除去不溶物和水层，加入无水硫酸钠回收乙酸乙酯至小体积，滤过加入二氯甲烷，有白色沉淀析出至，放置结晶，重复结晶2‐3次，减压干燥即得莫诺苷产品。

公开号为CN102127140A的中国专利公开了一种从山茱萸中联合提取莫诺苷、山茱萸多糖和熊果酸的方法，包含以下步骤：1)提取：将山茱萸粉碎，加入10‐15倍量水加热提取2‐3次，合并提取液，水提后的残渣加6‐8倍量90％醇回流提取，提取液浓缩；2)大孔树脂柱I吸附：把上述水提取液加入大孔树脂柱I吸附，收集下柱液，依次用水和乙醇溶液洗脱，将水洗脱液与下柱液合并，加醇沉淀，滤出沉淀干燥即得山茱萸多糖，收集醇洗脱液，浓缩无醇，加水分散，加等体积的正丁醇萃取2‐4次，正丁醇萃取液浓缩回收正丁醇，干燥即得莫诺苷；3)大孔树脂柱II吸附：上述醇提浓缩液上大孔树脂柱II吸附，用90％乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液加入活性炭回流脱色，滤除活性炭，放冷结晶，滤出结晶，干燥即得熊果酸。

公开号为CN102477053A的中国专利公开了一种从山茱萸中提取莫诺苷和马钱苷的方法，包括以下几个步骤：1)提取：将干燥山茱萸粉碎，用6‐8倍量的70％乙醇超声提取2‐3小时，提取2‐3次，合并提取液；2)萃取：将上述提取液浓缩至无醇，加水分散，加等体积的正丁醇萃取2‐4次，正丁醇萃取液浓缩回收正丁醇，至干，得到粗苷；3)高速逆流色谱分离：以正丁醇‐乙醇‐水为两相溶剂系统，将上述粗苷用下相溶解，以上相为固定相，下相为流动相，流出物分别减压蒸干；4)结晶：将上述干燥物正丁醇加热溶解，再加5‐8倍量乙酸乙酯结晶2‐3次，干燥即得产品。

公开号为CN104987354A的中国专利公开了一种制备莫诺苷的方法，包括如下步骤：1)将山茱萸进行渗漉提取，得到山茱萸提取液；2)浓缩所述步骤1)得到的山茱萸提取液浓缩，得到山茱萸浸膏；3)得到所述山茱萸浸膏，与硅胶混匀、干燥、研细后，装填于色谱柱中；所述色谱柱中已装有柱层析用空白硅胶；4)用洗脱液对所述色谱柱进行洗脱并收集流分，再除去所述收集到的流分中的洗脱液，用甲醇溶解残留物，重结晶，得到所述莫诺苷。

公开号为CN107286211A的中国专利公开了一种莫诺苷的制备方法，包括以下几个步骤：(1)原材料加乙醇采用微波、超声波协同提取法进行提取：将山茱萸原料粉碎加5‐10倍量乙醇，通过微波、超声波协助提取40‐60分钟，提取2‐3次；(2)采用大孔树脂吸附提取液：回收提取液中的乙醇，过滤后加入大孔树脂柱进行吸附，然后采用水‐醇梯度洗脱，最后收集莫诺苷流分；(3)莫诺苷流分通过过滤膜进行过滤操作：将莫诺苷流分加入超滤膜进行超滤，超滤完成后再加入纳滤膜进行过滤，然后收集浓缩液；(4)对收集到的浓缩液进行萃取操和结晶操作：将上述浓缩液加水饱和正丁醇萃取2‐4次，然后将萃取液合并，再进行减压浓缩，浓缩后可得到浓缩浸膏，将浸膏溶于乙酸乙酯来除去不溶物和水层，再加入无水硫酸钠回收乙酸乙酯，溶液经过过滤后加入二氯甲烷，随后可看到有白色沉淀析出，最后放置结晶，重复结晶3‐4次，采取减压干燥后即可得到莫诺苷产品。

公开号为CN101422502的中国专利公开了一种含熊果酸的山茱萸提取物的制备方法，包括以下步骤：1)、将山茱萸粉与水相混合，然后接种山茱萸粉重量2％～4％的葡萄酒酵母菌进行摇床发酵，发酵温度为25～35℃，发酵时间4d～8d；得发酵液；2)、在发酵液中加入蒸馏水后于50～70℃水浴0.5～2h，然后在50～70℃和30～40KHZ的频率下超声波处理1～3次，每次的超声波处理时间为10～20min；3)、过滤步骤2)的所得物，在所得的滤渣中加入体积浓度为75％～95％乙醇，于40～60℃和30～40KHZ的频率下超声波萃取5～15min；然后抽滤浓缩，得浓缩液；4)、浓缩液用石油醚萃取，取下层液进行浓缩和干燥，得到含熊果酸的山茱萸提取物。

公开号为CN101537029的中国专利公开了一种山茱萸的含熊果酸的提取物的制备方法，其特征是：在容器中加入茱萸粉和水，山茱萸粉/水的质量比为1/1～1/3.5，再加入山茱萸粉质量的0.02～0.04倍量酵母，摇床发酵，发酵温度为25℃～33℃，摇床转速110rpm～150rpm，发酵时间4d～8d；发酵后样品加入山茱萸粉质量的20～60倍量蒸馏水，50℃～70℃水浴0.5h～2h，超声波处理(频率：30～40KHZ)1～3次，每次10min～20min；过滤，弃去滤液；所得滤渣加入山茱萸粉质量的20～60倍量的75％～95％乙醇，40℃～60℃超声波萃取5～15min，功率为80％～100％，抽滤，浓缩；浓缩液用其1/3～2/3倍体积石油醚萃取，取下层液，浓缩，干燥，得含熊果酸的片状固体。

公开号为CN104072568A的中国专利公开了一种山茱萸核中熊果酸的提取工艺，按以下步骤进行：①原料预处理：选无发霉的优质山茱萸核，作为原料，用清洁水进行漂洗，除去山茱萸核外面的泥土和沙粒，漂洗干净后控去水分；②烤制：将控去外面水分的山茱萸核在50～60℃下烤制1.0h；③一次粉碎：将烤制好的山茱萸核进行第一次粉碎，粉碎成直径80～100目的微粒；④冷冻：将粉碎后的微粒山茱萸核粉，在‐5～0℃下冷冻1h；⑤二次粉碎：将冷冻后的山茱萸核粉，进行细脆破碎，破碎至直径为180～200目的粉状；⑥浸泡：经破碎后的山茱萸核粉，置入蒸馏水浸泡2h，水温控制在22～28℃；⑦超声波处理：将浸泡2h的浸泡液，进行超声波处理，分离处理后的混合液体，去除其中的山茱萸核粉渣，留超声后的液体；⑧蒸馏：将超声后的液体进行蒸馏，所得蒸馏液的糊状体为熊果酸原浆；⑨低温蒸发：使熊果酸原浆在25～30℃低温下蒸发，慢慢蒸发出熊果酸原浆中水分，使熊果酸为固体；⑩三次粉碎：将固体熊果酸粉碎直径300目的粉状；经质量监测，得到合格的熊果酸成品。

从现有技术中公开的几种常用的从植物中提取、制备较高纯度熊果酸或同类三萜酸类化合物的方法，主要有溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、或通过水解将三萜酸苷类除去糖后再制备的方式。但是，采用山茱萸进行提取熊果酸，造成生产成本过高。山茱萸中含有大量的莫诺苷，上述方法都采用回流提取，造成山茱萸中莫诺苷大量破坏，没有得到充分利用，还容易造成环境污染风险。

发明内容

本发明针对山茱萸提取熊果酸过程中莫诺苷易破坏等问题，提供一种从山茱萸中提取莫诺苷、马钱苷和熊果酸的方法，彻底解决提取过程中莫诺苷和马钱苷破坏等问题。

本发明具体的技术方案，包括如下步骤：

(1)将山茱萸果实进行干燥并粉碎，加入60～85％乙醇水溶液进行室温提取1～3h，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，其中加入60～85％乙醇水溶液体积L与山茱萸干重比为2～5：1；

(2)滤液Ⅰ在40℃～55℃下进行真空或减压浓缩至原有体积的1/10～1/25，过滤一次得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ；

(3)向滤渣Ⅰ中加入少量的水，再接种10～15％的枯草芽孢杆菌(产中性蛋白酶)，进行30℃～35℃发酵24～36h，得发酵物，其中加入水体积L与山茱萸干重比为3～10：50；

(4)将发酵物加入乙醇进行室温提取1～3h，过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ，其中加入乙醇体积L与酶解液体积L比为3～6：1，其中乙醇为95％以上的乙醇或无水乙醇；

(5)滤液Ⅲ在40℃～55℃下进行真空或减压浓缩至原有体积的1/15～1/30，陶瓷膜过滤一次得滤液Ⅳ和滤渣Ⅳ；

(6)将滤液Ⅱ和滤液Ⅳ合并后上AB‐8大孔树脂柱进行吸附，用四倍至六倍柱体积的20～40％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ。

(7)将洗脱液Ⅰ进行40℃～55℃下进行真空或减压浓缩至干燥物A，得莫诺苷纯品。

(8)将滤渣Ⅱ和滤渣Ⅳ加入无水甲醇溶解，上硅胶柱进行吸附，用三倍至五倍柱体积的甲醇水溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅱ，最后三倍至五倍柱体积氯仿‐甲醇溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅲ，洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ在50℃～65℃下进行真空或减压浓缩至干，分别获得干燥物B、干燥物C。

(9)干燥物B加入乙醇溶液在40～45℃下保温15～30min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次得熊果酸纯品。

(10)干燥物C加入丙酮在35～40℃下保温15～30min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次，得马钱苷纯品。

所述枯草芽孢杆菌可以直接从市场购买其菌粉，其中10％是枯草芽孢杆菌重量kg与山茱萸重量kg比。

所述过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤，其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。

在一个具体实施方案中，步骤(8)中所述无水甲醇的使用量，按体积/滤渣Ⅰ重量比为2～4L:1kg。

在一个具体实施方案中，步骤(8)所述甲醇水溶液是指含有70～90％甲醇的pH5.5～6.5的盐酸水溶液。

在一个具体实施方案中，步骤(8)中所述氯仿‐甲醇溶液是指氯仿与甲醇的体积比为2:1～2。

在一个实施方案中，步骤(9)中所述乙醇溶液是指80～85％乙醇水溶液，所用体积与所得干燥物B的重量比为1L～3L：1kg。

在一个具体实施方案中，步骤(10)中所述丙酮的体积与干燥物C重量比为2～5L:1kg。

技术效果

1、本发明获得三种山茱萸提取产品，有效降低其生产成本，充分利用了山茱萸三种主要功能性成份。

2、通过先醇提莫诺苷和马钱苷后发酵方式，有效地防止莫诺苷和马钱苷水解，又提高了莫诺苷和马钱苷提取率。

3、通过微生物发酵山茱萸果，既有利于山茱萸果中熊果酸的释放，又有利于熊果苷转化，提高了熊果酸产率和降低其生产成本。

具体实施方式

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1

取山茱萸果实进行干燥并粉碎100kg，加入75％乙醇水溶液350L进行室温提取2h，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ；滤液Ⅰ在50℃下进行真空或减压浓缩至10L，过滤一次得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ；向滤渣Ⅰ中加入15L水，再接种12％的枯草芽孢杆菌，进行30℃发酵36h，得发酵物；将发酵物加入95％乙醇400L进行室温提取2h，过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ；滤液Ⅲ在50℃下进行真空或减压浓缩至15L，陶瓷膜过滤一次得滤液Ⅳ和滤渣Ⅳ；将滤液Ⅱ和滤液Ⅳ合并后上AB‐8大孔树脂柱进行吸附，用四倍至六倍柱体积的30％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ。将洗脱液Ⅰ进行50℃下进行真空或减压浓缩至干燥物A，得2.43kg莫诺苷纯品。将滤渣Ⅱ和滤渣Ⅳ加入无水甲醇溶解，上硅胶柱进行吸附，用五倍柱体积的甲醇水溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅱ，最后五倍柱体积氯仿‐甲醇溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅲ，洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ在55℃下进行真空或减压浓缩至干，分别获得干燥物B、干燥物C。干燥物B加入乙醇溶液在40℃下保温30min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次得943g熊果酸纯品。干燥物C加入丙酮在40℃下保温15min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次，得1.73kg马钱苷纯品。经HPLC法检测，熊果酸样品的含量为98.74％，马钱苷样品的含量为99.01％，莫诺苷样品的含量为98.88％。

实施例2

取山茱萸果实进行干燥并粉碎200kg，加入80％乙醇水溶液700L进行室温提取2h，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ；滤液Ⅰ在50℃下进行真空或减压浓缩至20L，过滤一次得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ；向滤渣Ⅰ中加入30L水，再接种12％的枯草芽孢杆菌，进行30℃发酵36h，得发酵物；将发酵物加入95％乙醇800L进行室温提取2h，过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ；滤液Ⅲ在50℃下进行真空或减压浓缩至15L，陶瓷膜过滤一次得滤液Ⅳ和滤渣Ⅳ；将滤液Ⅱ和滤液Ⅳ合并后上AB‐8大孔树脂柱进行吸附，用六倍柱体积的30％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ。将洗脱液Ⅰ进行55℃下进行真空或减压浓缩至干燥物A，得5.06kg莫诺苷纯品。将滤渣Ⅱ和滤渣Ⅳ加入无水甲醇溶解，上硅胶柱进行吸附，用五倍柱体积的甲醇水溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅱ，最后五倍柱体积氯仿‐甲醇溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅲ，洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ在55℃下进行真空或减压浓缩至干，分别获得干燥物B、干燥物C。干燥物B加入乙醇溶液在40℃下保温30min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次得1.91kg熊果酸纯品。干燥物C加入丙酮在35℃下保温30min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次，得3.61kg马钱苷纯品。经HPLC法检测，熊果酸样品的含量为98.72％，马钱苷样品的含量为99.03％，莫诺苷样品的含量为98.92％。

对照实施例1

取山茱萸果实进行干燥并粉碎100kg，加入75％乙醇水溶液350L进行室温提取2h，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ；滤液Ⅰ在50℃下进行真空或减压浓缩至10L，过滤一次得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ；向滤渣Ⅰ中95％乙醇400L进行室温提取2h，过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ；滤液Ⅲ在50℃下进行真空或减压浓缩至15L，陶瓷膜过滤一次得滤液Ⅳ和滤渣Ⅳ；将滤液Ⅱ和滤液Ⅳ合并后上AB‐8大孔树脂柱进行吸附，用四倍至六倍柱体积的30％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ。将洗脱液Ⅰ进行50℃下进行真空或减压浓缩至干燥物A，得2.28kg莫诺苷纯品。将滤渣Ⅱ和滤渣Ⅳ加入无水甲醇溶解，上硅胶柱进行吸附，用五倍柱体积的甲醇水溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅱ，最后五倍柱体积氯仿‐甲醇溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅲ，洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ在55℃下进行真空或减压浓缩至干，分别获得干燥物B、干燥物C。干燥物B加入乙醇溶液在40℃下保温30min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次得705g熊果酸纯品。干燥物C加入丙酮在40℃下保温15min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次，得1.58kg马钱苷纯品。经HPLC法检测，熊果酸样品的含量为98.48％，马钱苷样品的含量为98.71％，莫诺苷样品的含量为98.62％。

对照实施例2

取山茱萸果实进行干燥并粉碎100kg，加入15L水，再接种12％的枯草芽孢杆菌，进行30℃发酵36h，得发酵物；加入75％乙醇水溶液350L进行室温提取2h，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ；滤液Ⅰ在50℃下进行真空或减压浓缩至10L，过滤一次得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ；再向滤渣Ⅰ中加入95％乙醇400L进行室温提取2h，过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ；滤液Ⅲ在50℃下进行真空或减压浓缩至15L，陶瓷膜过滤一次得滤液Ⅳ和滤渣Ⅳ；将滤液Ⅱ和滤液Ⅳ合并后上AB‐8大孔树脂柱进行吸附，用四倍至六倍柱体积的30％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ。将洗脱液Ⅰ进行50℃下进行真空或减压浓缩至干燥物A，得1.78kg莫诺苷纯品。将滤渣Ⅱ和滤渣Ⅳ加入无水甲醇溶解，上硅胶柱进行吸附，用五倍柱体积的甲醇水溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅱ，最后五倍柱体积氯仿‐甲醇溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅲ，洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ在55℃下进行真空或减压浓缩至干，分别获得干燥物B、干燥物C。干燥物B加入乙醇溶液在40℃下保温30min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次得852g熊果酸纯品。干燥物C加入丙酮在40℃下保温15min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次，得1.32kg马钱苷纯品。经HPLC法检测，熊果酸样品的含量为98.51％，马钱苷样品的含量为98.55％，莫诺苷样品的含量为98.41％。

Claims (7)

1.一种从山茱萸中提取莫诺苷、马钱苷和熊果酸的方法，包括如下步骤：

(1)将山茱萸果实进行干燥并粉碎，加入60～85％乙醇水溶液进行室温提取1～3h，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，其中加入60～85％乙醇水溶液体积L与山茱萸干重比为2～5：1；

(2)滤液Ⅰ在40℃～55℃下进行真空或减压浓缩至原有体积的1/10～1/25，过滤一次得滤液Ⅱ和滤渣Ⅱ；

(3)向滤渣Ⅰ中加入少量的水，再接种10～15％的枯草芽孢杆菌，进行30℃～35℃发酵24～36h，得发酵物，其中加入水体积L与山茱萸干重比为3～10：50；

(4)将发酵物加入乙醇进行室温提取1～3h，过滤得滤液Ⅲ和滤渣Ⅲ，其中加入乙醇体积L与酶解液体积L比为3～6：1，其中乙醇为95％以上的乙醇或无水乙醇；

(5)滤液Ⅲ在40℃～55℃下进行真空或减压浓缩至原有体积的1/15～1/30，陶瓷膜过滤一次得滤液Ⅳ和滤渣Ⅳ；

(6)将滤液Ⅱ和滤液Ⅳ合并后上AB‐8大孔树脂柱进行吸附，用四倍至六倍柱体积的20～40％乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ；

(7)将洗脱液Ⅰ进行40℃～55℃下进行真空或减压浓缩至干燥物A，得莫诺苷纯品；

(8)将滤渣Ⅱ和滤渣Ⅳ加入无水甲醇溶解，上硅胶柱进行吸附，用三倍至五倍柱体积的甲醇水溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅱ，最后三倍至五倍柱体积氯仿‐甲醇溶液进行柱洗脱，得到洗脱液Ⅲ，洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ在50℃～65℃下进行真空或减压浓缩至干，分别获得干燥物B、干燥物C；

(9)干燥物B加入乙醇溶液在40～45℃下保温15～30min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次得熊果酸纯品；

(10)干燥物C加入丙酮在35～40℃下保温15～30min，趁热陶瓷膜过滤1次，滤液放置冰箱中过夜，结晶重结晶一次，得马钱苷纯品。

2.权利要求1方法，其中所述过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤，其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。

3.权利要求1方法，其中步骤(8)中所述无水甲醇的使用量，按体积/滤渣Ⅰ重量比为2～4L:1kg。

4.权利要求1方法，其中步骤(8)所述甲醇水溶液是指含有70～90％甲醇的pH5.5～6.5的盐酸水溶液。

5.权利要求1方法，其中步骤(8)中所述氯仿‐甲醇溶液是指氯仿与甲醇的体积比为2:1～2。

6.权利要求1方法，其中步骤(9)中所述乙醇溶液是指80～85％乙醇水溶液，所用体积与所得干燥物B的重量比为1L～3L：1kg。

7.权利要求1方法，其中步骤(10)中所述丙酮的体积与干燥物C重量比为2～5L:1kg。