CN103159816B - 一种从植物甾醇发酵液中提取4-雄烯二酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从植物甾醇发酵液中提取4-雄烯二酮的方法，特别是从发酵液中分离出的菌丝体及渣料，经丙酮浸提得到4-雄烯二酮粗品（Ⅰ）和未反应的植物甾醇，4-雄烯二酮粗品（Ⅰ）经50%的丙酮水溶液溶解结晶得到粗品（Ⅱ），粗品（Ⅱ）用1：10的乙醇重结晶得到纯4-雄烯二酮，未反应的植物甾醇用1:10（W/V）乙醇重结晶得到回收植物甾醇。本发明的方法提取效果好，产品纯度高，操作简单，应用溶媒种类少，减少了环境污染，成本低，工艺路线短，未转化的植物甾醇可回收再利用，适合于工业化生产。

Description

一种从植物甾醇发酵液中提取4-雄烯二酮的方法
技术领域
本发明涉及一种从植物甾醇发酵液中提取4-雄烯二酮（4-AD）的方法，属生物发酵提取技术领域。
背景技术
4-雄烯二酮（4-AD）是合成多种激素类原料药的中间体，其生产方法由植物甾醇经特殊细菌发酵生物转化而成，在发酵过程中同时还生成少量雄二烯二酮（ADD），因此，4-雄烯二酮（4-AD）、雄二烯二酮（ADD）和没有反应完的植物甾醇同时存在于发酵液中，其在溶剂中的溶解性差异不明显，分离提纯困难，现有提取工艺复杂，经4次以上且用多种溶媒提取，产品含量低，多种溶媒对环境污染严重。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有工艺中溶媒应用种类多、提纯步骤长的不足，设计一种提取步骤短、产品收率高、含量高、未反应的起始原料植物甾醇可回收再利用的提取方法。
    本发明提供一种从植物甾醇发酵液中提取4-雄烯二酮（4-AD）的方法，该方法包括下列步骤：
（1）收集发酵液中的菌丝体及渣料：
通过板框压滤机或碟片式离心机收集发酵液中的菌丝体及渣料；
（2）提取4-雄烯二酮粗品Ⅰ：
  将步骤（1）的菌丝体及渣料用1:0.5~4（W/V）丙酮在常温条件下浸提3~5次，每次1~3h，合并丙酮浸提液，于0~4℃环境静置5h，离心收集滤液和未反应的植物甾醇，滤液在45℃、-0.095MPa条件下减压蒸发回收丙酮，当有大量结晶出现时停止浓缩，冷却至4℃养晶3h，离心收集晶体，即得粗品Ⅰ；
（3）制备4-雄烯二酮纯品：
  用1:15~25（W/V）50%丙酮水溶液溶解粗品，加热回流，过滤，滤液冷却至4℃搅拌结晶3h，离心收集粗品Ⅱ；用1:10（W/V）乙醇加热回流溶解，加入0.1%（W/V）活性碳搅拌脱色30min，过滤，滤液冷却至4℃搅拌结晶3h，离心，用少量冰乙醇洗涤晶体，于45℃、-0.095MPa真空干燥5~8h得纯品4-雄烯二酮。
  另外，本发明的方法步骤（2）于0~4℃环境静置5h，过滤或离心收集的未反应的植物甾醇，用1:10（W/V）乙醇加热回流溶解，过滤，滤液冷却至0~4℃环境静置2h，离心，45℃、-0.095MPa真空干燥8h，得到回收的植物甾醇，可再次用于起始发酵原料发酵生产4-雄烯二酮。
  本发明具有下列特点：
①根据雄烯二酮（4-AD）不溶于水的性质，本发明采用生物发酵行业常用的板框压滤机或碟片式离心机分离收集发酵液中的菌丝体及渣料，适合工业化生产；
②根据雄烯二酮（4-AD）易溶于丙酮的性质，用丙酮浸提菌丝体及渣料，能较完全地提取出雄烯二酮（4-AD），浸提收率高；
③利用雄烯二酮（4-AD）和原料植物甾醇在不同温度下在丙酮中溶解度的差别，分离出植物甾醇，再经乙醇重结晶，得回收植物甾醇；
④采用50%丙酮水溶剂（极性比丙酮高）和乙醇溶解处理粗品结晶，使得不同极性的杂质得到有效分离，制得纯品结晶；
⑤本发明提取雄烯二酮（4-AD）的方法采用了丙酮和乙醇两种溶剂，减少了溶剂种类，生产操作方便，减少了环境污染。
本发明的技术水平数据一览表：
本发明的方法工艺路线短，所用溶剂种类少，产品纯度高，主要原料可回收再利用，降低原料及溶剂成本，适合工业化生产。
  收率=合格产品折纯重量÷（发酵液中雄烯二酮（4-AD）含量×体积）×100%
分  析  结  果
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
   峰号  保留时间   面积    高度   面积/高度   面积百分含量   分离度   拖尾因子   理论塔板
────────────────────────────────────────
    1       2.878      17819.3    932.8     19.102        0.1479         6.541      1.281        2234.1
    2       4.495      8082.7     430.3     18.786        0.0671         6.541      1.080        5087.4
    3       5.399      11955.1    417.0     28.669        0.0992         3.041      1.124        3938.3
    4       6.341      9930.8     516.6     19.224        0.0824          2.990      1.224       7783.5
    5       6.820   11985386.1  471710.7  25.408     99.4802        1.553      1.124        6776.6
    6       7.949      14835.3    537.6     27.596        0.1231         3.230      1.002       7400.0
────────────────────────────────────────
合计:           12048009.3    474545.0                100.0000                                      
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
附图说明：4-雄烯二酮成品HPLC图。
具体实施方式：
（1）100L发酵液经板框压滤机压滤，得湿滤饼约25kg，含4-雄烯二酮（4-AD）为10%；用丙酮浸提三次，第一次用丙酮37.5L，浸提2h，第二次用丙酮25L，浸提1.5h，第三次用丙酮20L，浸提1.5h，合并三次浸提液约82.5L，于4℃静置5h，离心收集滤液和未反应的植物甾醇约2.5kg，滤液减压蒸发回收丙酮，冷却至4℃养晶3h，离心得4-雄烯二酮粗品（Ⅰ）约3.38kg；4-雄烯二酮粗品（Ⅰ）用50%的丙酮水溶液47.3L溶解粗品，加热回流，过滤，滤液冷却至4℃搅拌结晶3h，离心得4-雄烯二酮粗品（Ⅱ）约2.51kg；4-雄烯二酮粗品（Ⅱ）用20L乙醇加热回流溶解，加入140g活性碳搅拌脱色30min，过滤，滤液冷却至4℃搅拌结晶3h，离心，用少量冰乙醇洗涤晶体，真空干燥8h，得纯品4-雄烯二酮约1.92kg。
（2）将上述未反应的植物甾醇2.5kg，用25L乙醇加热回流溶解，过滤，滤液冷却至0℃静置2h，离心，45℃、-0.095MPa真空干燥8h，得到回收植物甾醇约1.6kg，可再次作为起始原料用于发酵生产4-雄烯二酮。

Claims (2)

1.一种从植物甾醇发酵液中提取4-雄烯二酮的方法，其特征在于：该方法包括下列步骤：
（1）收集发酵液中的菌丝体及渣料：
通过板框压滤机或碟片式离心机收集发酵液中的菌丝体及渣料；
（2）提取4-雄烯二酮粗品（Ⅰ）：
  将步骤（1）的菌丝体及渣料用1:0.5~4（W/V）丙酮在常温条件下浸提3~5次，每次1~3h，合并丙酮浸提液，于0~4℃静置5h，离心收集滤液和未反应的植物甾醇，滤液在45℃、-0.095MPa条件下减压蒸发回收丙酮，当有大量结晶出现时停止浓缩，冷却至4℃养晶3h，离心收集晶体，即得粗品（Ⅰ）；
（3）制备4-雄烯二酮纯品：
  用1:15~25（W/V）50%的丙酮水溶液溶解粗品（Ⅰ），加热回流，过滤，滤液冷却至4℃搅拌结晶3h，离心收集粗品（Ⅱ）；粗品（Ⅱ）用1:10（W/V）乙醇加热回流溶解，加入0.1~1.0%（W/V）活性碳搅拌脱色30min，过滤，滤液冷却至4℃搅拌结晶3h，离心，用少量冰乙醇洗涤晶体，于45℃、-0.095MPa真空干燥5~8h得纯品4-雄烯二酮。
2.根据权利要求1所述的一种从植物甾醇发酵液中提取4-雄烯二酮的方法，其特征在于：其中步骤（2）于0~4℃环境静置5h，离心收集的未反应的植物甾醇，用1:10（W/V）乙醇加热回流溶解，过滤，滤液冷却至0~4℃环境静置2h，离心，45℃、-0.095MPa真空干燥8h，得到植物甾醇，可再次用于起始发酵原料生产4-雄烯二酮。
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