CN111041062B

CN111041062B - 一种甾体化合物的制备方法

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Publication number: CN111041062B
Application number: CN201911316264.7A
Authority: CN
Inventors: 何建勇; 任凤英; 孙福锁; 李宪学
Original assignee: Shandong Saituo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Saituo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN111041062A

Abstract

本发明属于甾体化合物技术领域，具体涉及一种含酯基的甾体化合物的制备方法。本发明公开了一种含酯基的甾体化合物的制备方法，包括以下步骤：S1.将分枝杆菌进行前处理；S2.将前处理后的分枝杆菌接种到培养基中发酵，得发酵液；S3.对步骤S2得到的发酵液进行提纯，即得。

Description

一种甾体化合物的制备方法

技术领域

本发明属于甾体化合物技术领域，具体涉及一种甾体化合物的制备方法。

背景技术

甾体化合物是含有四个环戊烷多氢菲的萜类化合物，广泛存在于动植物组织和一些微生物细胞中。以甾体化合物为原料生产的甾体药物对机体起着非常重要的调节作用，其被广泛地用于疾病治疗和健康保健。目前，甾体药物的市场需求仅次于抗生素，如醛固酮拮抗剂、依普利酮已临床治疗心衰、高血压、水肿、肝腹水、呼吸衰竭等多种疾病。

长期以来，甾体化合物生产中主要原材料是天然薯蓣皂素。然而，将天然薯蓣皂素通过化学方法转化为有价值的甾体化合物有很多缺点，比如成本高，步骤复杂，产量低，土地资源及野生植物资源浪费等。近年来，甾体药物中间体的生产主要集中于对天然薯蓣皂素的替代物植物甾醇(谷甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇，菜油甾醇)的微生物转化。来自农业，食品，纤维素制造业的废弃物植物甾醇不需纯化直接可以用于生产有价值的甾体药物中间体。分枝杆菌、红球菌、米曲霉、串珠镰刀菌等可以转化植物甾醇生产4-AD，其中分枝杆菌属及红球菌属是最有效生产4-AD的微生物。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种含酯基的甾体化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.将分枝杆菌进行前处理；

S2.将前处理后的分枝杆菌接种到培养基中发酵，得发酵液；

S3.对步骤S2得到的发酵液进行提纯；

其中，所述含酯基的甾体化合物的结构式为：

作为一种优选的技术方案，所述步骤S1中，将分枝杆菌进行前处理包括以下过程：

(1)一级培养：将2-6mL的分枝杆菌接种到含有200mL第一培养液的摇瓶中，在30-35摄氏度的摇床上震荡培养40-56小时，得摇瓶种子液；

(2)二级培养：将200-1000mL摇瓶种子液接种到含有400L第二培养液的一级种子罐中，通无菌空气，100-200rpm下搅拌及在30-35摄氏度下培养36-48小时，得一级种子罐种子液；

(3)三级培养：将300-500L一级种子罐种子液加入到含有5-8m³第三培养液的二级种子罐中，通无菌空气，100-200rpm下搅拌及在30-35摄氏度下培养2-3天，即得。

作为一种优选的技术方案，所述步骤S2中培养基包括以下质量百分比的组分：植物甾醇1-10％、有机氮源2-9％、无机盐0.15-0.8％、助剂0.1-0.5％、水余下量。

作为一种优选的技术方案，所述植物甾醇包括谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇中的至少一种。

作为一种优选的技术方案，所述有机氮源选自玉米浆、黄豆饼粉、玉米淀粉、蛋白胨、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、鱼粉、麸皮中的至少一种。

作为一种优选的技术方案，所述有机氮源为玉米浆和黄豆饼粉；所述玉米浆和黄豆饼粉的质量比为1：(0.8-1)。

作为一种优选的技术方案，所述无机盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁中的至少一种。

作为一种优选的技术方案，所述助剂选自聚氧乙烯氧丙烯甘油、聚氧乙烯聚氧丙烯聚醚、聚甲基硅氧烷中的至少一种。

本发明的第二方面提供了所述制备方法得到的含酯基的甾体化合物。

本发明的第三方面提供了所述的含酯基的甾体化合物在制备甾体药物的应用。

有益效果：本发明通过微生物发酵法制备得到含酯基的甾体化合物，所述含酯基的甾体化合物具有甾体药物的基本骨架，应用其作为甾体药物化学合成的原料具有潜在的应用价值；而且本申请通过纯化得到高纯度的含酯基的甾体化合物，所用纯化溶剂等经回收后，可循环使用，减少废弃物排放，对环境污染小，符合循环经济发展方向。所生产的含酯基的甾体化合物可以作为重要的医药中间体，社会需求量巨大，经济效益十分明显。

具体实施方式

为了下面的详细描述的目的，应当理解，本发明可采用各种替代的变化和步骤顺序，除非明确规定相反。此外，除了在任何操作实例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本发明所要获得的期望性能而变化的近似值。至少并不是试图将等同原则的适用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。

尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含由其各自测试测量中发现的标准偏差必然产生的某些误差。

当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。例如，从“1至10”的指定范围应视为包括最小值1与最大值10之间的任何及所有的子范围。范围1至10的示例性子范围包括但不限于1至6.1、3.5至7.8、5.5至10等。

为了解决上述问题，本发明提供了一种含酯基的甾体化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.将分枝杆菌进行前处理；

S2.将前处理后的分枝杆菌接种到培养基中发酵，得发酵液；

S3.对步骤S2得到的发酵液进行提纯。

所述含酯基的甾体化合物的结构式为：

本申请人意外发现，将分枝杆菌进行前处理后加入到一定组分的培养基中，能够得到所述含酯基的甾体化合物。猜测生成的可能原因是：将分枝杆菌接种到培养基后，微生物对植物甾醇产生复杂的反应，包括侧链的羟基化、羧基化、通过β-氧化失去丙酸、乙酸等导致侧链的降解，酯化，C3位羟基氧化成酮基，C5、C6位双键的氢化等最终得到所述含酯基的甾体化合物，具体机理有待进一步研究。

步骤S1

所述步骤S1中，将分枝杆菌进行前处理包括以下过程：

(1)一级培养：将2-6mL的分枝杆菌接种到含有200mL培养液的摇瓶中，在30-35摄氏度的摇床上震荡培养40-56小时，得摇瓶种子液；

(2)二级培养：将200-1000mL摇瓶种子液接种到含有400L培养液的一级种子罐中，通无菌空气，100-200rpm下搅拌及在30-35摄氏度下培养36-48小时，得一级种子罐种子液；

(3)三级培养：将300-500L一级种子罐种子液加入到含有5-8m³培养液的二级种子罐中，通无菌空气，100-200rpm下搅拌及在30-35摄氏度下培养2-3天，即得。

作为一种优选的实施方式，所述步骤S1中，将分枝杆菌进行前处理包括以下过程：

(1)一级培养：将4mL的分枝杆菌接种到含有200mL第一培养液的摇瓶中，在32摄氏度的摇床上震荡培养48小时，得摇瓶种子液；

(2)二级培养：将10mL摇瓶种子液接种到含有400L第二培养液的一级种子罐中，通无菌空气，150rpm下搅拌及在32摄氏度下培养40小时，得一级种子罐种子液；

(3)三级培养：将400L一级种子罐种子液加入到含有5-8m³第三培养液的二级种子罐中，通无菌空气，150rpm下搅拌及在32摄氏度下培养2-3天，即得。

本申请中，所述分枝杆菌属于含分枝菌酸类，是一类细长略弯曲的，有时有分枝或出现丝状体，主要特点是细胞壁含有大量脂质。

本发明所述分枝杆菌为分枝杆菌ST-3-8(MycobacteriumfortuitumST-3-8)，为偶发分枝杆菌，所述菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2019年11月22日，保藏编号为：CGMCCNo.18995。

其中，按质量百分比计，步骤(1)的第一培养液的组分包括：蛋白胨1.0％，酵母粉0.2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.1％，甘油0.2％，吐温-80 0.05％，泡敌0.01％，余量为水。

按质量百分比计，步骤(2)的第二培养液的组分包括：蛋白胨1.0％，酵母粉0.2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.1％，甘油0.2％，吐温-80 0.05％，泡敌0.01％，余量为水。所述无菌空气的流量为0.4-0.6v/v/min。

按质量百分比计，步骤(3)的第三培养液的组分包括：植物甾醇3-5％，玉米浆2-4％，黄豆饼粉1-4％，磷酸盐0.1-0.3％，泡敌0.05-0.2％，硫酸镁0.1-0.2％，余量为水。所述无菌空气的流量为0.4-0.6v/v/min。

所述分枝杆菌经过三级培养，繁殖成大量的微生物群体，有利于后续反应的进行。

步骤S2

作为一种优选的实施方式，所述步骤S2中培养基包括以下质量百分比的组分：植物甾醇1-10％、有机氮源2-9％、无机盐0.15-0.8％、助剂0.1-0.5％、水余下量。

所述植物甾醇，是从玉米、大豆中经过物理提纯而得，具有营养价值高、生理活性强等特点。植物甾醇可通过降低胆固醇减少心血管病的风险。其广泛应用在食品、医药、化妆品、动物生长剂及纸张加工、印刷、纺织等领域，特别是在欧洲作为食品添加剂非常普遍，广泛用于食品中以降低人体胆固醇。

作为一种优选的实施方式，所述植物甾醇包括谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇中的至少一种；优选的，所述植物甾醇为谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇的混合物。

本申请，所述植物甾醇购买于浙江大为生物制品有限公司，成分为谷甾醇47.5wt％、豆甾醇17.7wt％、菜油甾醇26.4wt％、菜籽甾醇3.6wt％。

所述有机氮源选自玉米浆、黄豆饼粉、玉米淀粉、蛋白胨、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、鱼粉、麸皮中的至少一种。

作为一种优选的实施方式，所述有机氮源为玉米浆和黄豆饼粉；所述玉米浆和黄豆饼粉的质量比为1：(0.8-1)。

所述无机盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁中的至少一种。

作为一种优选的实施方式，所述无机盐为磷酸二氢钾和硫酸镁；所述磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为(2-10)：1。

本申请人发现，磷酸盐浓度过低时不能满足菌体自身生长的需求；过高时，菌体自身生长过于旺盛，转化受到抑制，不利于产物的积累。

所述助剂选自聚氧乙烯氧丙烯甘油、聚氧乙烯聚氧丙烯聚醚、聚甲基硅氧烷中的至少一种。

本申请中，所述聚氧乙烯氧丙烯甘油可以购买也可以自制，购买厂家包括但不限于鼎邦化工南通有限公司。

本申请人发现，在制备含酯基的甾体化合物的过程中，由于培养基中含有玉米浆、黄豆饼粉，在通气的条件下，很容易形成泡沫。泡沫会对制备过程带来很多不利因素，例如发酵液从排气管路或轴封逃出增加染菌机会、菌体呼吸受到阻碍、导致代谢异常等。本申请通过加入助剂，能够降低液膜的表面粘度或者机械强度，从而导致破裂。本申请人发现，所述助剂为聚氧乙烯氧丙烯甘油时，能够提高含酯基的甾体化合物的收率，猜测是因为：在培养基中加入助剂时，聚氧乙烯氧丙烯甘油的疏水基团向内形成非极性中心区，而亲水基团则向外共同形成球状体，植物甾醇被包覆在非极性中心区，同时，聚氧乙烯氧丙烯甘油与体系中的其他物质相互作用能够促进植物甾醇等更好的进入细胞与甾体转化酶接触进而进行转化反应。

作为一种优选的实施方式，所述分枝杆菌的接种量为9-11％。

本申请中，所述分枝杆菌的接种量按照接种前后的菌液体积比计算。例如：把1ml分枝杆菌接种到100ml培养基中，接种量就是1％。

本申请人发现，当分枝杆菌的接种量过小时，菌体初始浓度过低，导致发酵周期增长，在相同的发酵时间内产率较低；而当接种量过大时，会导致菌体过快生长，发酵液中的营养消耗过快和溶氧不足，菌体容易衰老和自溶，也会影响产物的生成。

所述发酵条件为：30-33摄氏度，搅拌转速为50-150r/min，时间7-10天，相对溶氧浓度为20-40％。

相对溶氧浓度的定义：

将发酵培养基高温灭菌后，当温度降至正常培养温度，通气和搅拌都正常进行，但尚未接种时溶氧电极测得的溶氧浓度值为100％。

接种后，发酵过程中测得的溶氧浓度值除以接种前的溶氧浓度值得到的比值为相对溶氧浓度，用％表示。

步骤S3

步骤S3中，提纯过程包括：

1)将发酵液进行板框压滤，取滤饼；

2)向步骤1)中的滤饼中加入3-5倍滤饼重量的第一醇类溶剂，在45-55摄氏度下，搅拌40-90min，然后板框压滤，取滤液；

3)将步骤2)中的滤液进行减压浓缩，温度为40-50摄氏度，浓缩到原体积15-25％时，向釜中加入原体积5-15％的水，继续减压浓缩至无醇类溶剂；

4)将步骤3)处理后的物料通过板框压滤，干燥，得粗品；

5)向粗品中加入2-5倍粗品体积的醚类溶剂，加热到38-45摄氏度，搅拌60-90min，然后降温至0-5摄氏度进行结晶；

6)将步骤5)得到的物料进行离心，取离心后的母液；

7)将离心后的母液进行真空浓缩，得固体物料A；

8)向固体物料A中加入2-5倍固体物料A体积的第二醇类溶剂，搅拌50-80min，离心，得到的固体物料即为所述含酯基的甾体化合物。

作为一种优选的实施方式，为了进一步提高含酯基的甾体化合物的纯度，可重复步骤8)。

作为一种优选的实施方式，所述第一醇类溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、丁二醇、戊醇、戊二醇、戊三醇、己醇、己二醇、己三醇中的至少一种。

优选的，所述第一醇类溶剂为甲醇；

所述第二醇类溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、丁二醇、戊醇、戊二醇、戊三醇、己醇、己二醇、己三醇中的至少一种与水的混合物。

优选的，第二醇类溶剂为体积比为70％的甲醇水溶液。

作为一种优选的实施方式，所述醚类溶剂选自甲基叔丁醚、二乙二醇甲基叔丁基醚、异丙基醚、正丙醚、二丙二醇二甲醚、二丙二醇甲基醚中的至少一种。

优选的，所述醚类溶剂为甲基叔丁醚。

本申请人对制备出的发酵液进行多次压滤、减压浓缩、以及结晶、离心等纯化步骤，有效去除发酵液中的菌体、4-雄烯二酮以及多种中间体，得到高纯度的含酯基的甾体化合物。所用醇类溶剂、醚类溶剂等经回收后，可循环使用，减少废弃物排放，对环境污染小，符合循环经济发展方向。所生产的含酯基的甾体化合物作为重要的甾体药物中间体，社会需求量巨大，经济效益十分明显。

所述甾体药物包括但不限于BA。

所述BA的化学名为：21-羟基-20-甲基-孕甾-4-烯-3-酮，为甾体药物中间体，CAS：60966-36-1。所述的含酯基的甾体化合物的酯基经氢化锂铝还原变成醇羟基后就成为BA。

由于含酯基的甾体化合物具有甾体药物的基本骨架，应用其作为甾体药物化学合成的原料具有潜在的应用价值。

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售得到的。

实施例

实施例1-10中，所述含酯基的甾体化合物的结构式为

实施例1

一种含酯基的甾体化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.将分枝杆菌ST-3-8进行前处理；

S2.将前处理后的分枝杆菌接种到培养基中发酵，得发酵液；

S3.对步骤S2得到的发酵液进行提纯，即得。

所述步骤S1中，将分枝杆菌进行前处理包括以下过程：

(1)一级培养：将4mL分枝杆菌ST-3-8(Mycobacterium fortuitumST-3-8)的菌种接种到含有200mL第一培养液的摇瓶中，在32摄氏度的摇床上震荡培养48小时，得摇瓶种子液；

(2)二级培养：将500mL摇瓶种子液接种到含有400L第二培养液的一级种子罐中，通无菌空气(流量为0.5v/v/min)，150rpm下搅拌及在32摄氏度下培养40小时，得一级种子罐种子液；

(3)三级培养：将400L一级种子罐种子液加入到含有6m³第三培养液的二级种子罐中，通无菌空气(流量为0.5v/v/min)，150rpm下搅拌及在32摄氏度下培养2天，即得。

按质量百分比计，步骤(2)的第二培养液的组分包括：蛋白胨1.0％，酵母粉0.2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.1％，甘油0.2％，吐温-80 0.05％，泡敌0.01％，余量为水。

按质量百分比计，步骤(3)的第三培养液的组分包括：植物甾醇4％，玉米浆3％，黄豆饼粉3％，磷酸二氢钾0.2％，泡敌0.1％，硫酸镁0.15％，余量为水。

所述步骤S2中培养基包括以下质量百分比的组分：植物甾醇5％、有机氮源4％、无机盐0.45％、助剂0.25％、水余下量。

所述植物甾醇购买于浙江大为生物制品有限公司，成分为谷甾醇47.5wt％、豆甾醇17.7wt％、菜油甾醇26.4wt％、菜籽甾醇3.6wt％。

所述有机氮源为玉米浆和黄豆饼粉；所述玉米浆和黄豆饼粉的质量比为1：0.9。

所述无机盐为磷酸二氢钾和硫酸镁；所述磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为6：1。

所述助剂为聚氧乙烯氧丙烯甘油，购买于鼎邦化工南通有限公司。

所述分枝杆菌的接种量为10％。

所述发酵条件为：30-33摄氏度，搅拌转速为100r/min，时间8天，相对溶氧浓度为30％。

步骤S3中，提纯过程包括：

1)将发酵液进行板框压滤，取滤饼；

2)向步骤1)中的滤饼中加入4倍滤饼重量的甲醇，在40摄氏度下，搅拌60min，然后板框压滤，取滤液；

3)将步骤2)中的滤液进行减压浓缩，温度为45摄氏度，浓缩到原体积20％时，向釜中加入原体积10％的水，继续减压浓缩至无醇类溶剂；

4)将步骤3)处理后的物料通过板框压滤，干燥，得粗品；

5)向粗品中加入3倍粗品体积的甲基叔丁醚，加热到40摄氏度，搅拌75min，然后降温至0-5摄氏度进行结晶；

6)将步骤5)得到的物料进行离心，取离心后的母液；

7)将离心后的母液进行真空浓缩，得固体物料A；

8)向固体物料A中加入4倍固体物料A体积的体积比为70％的甲醇水溶液，搅拌70min，离心，得到的固体物料即为所述含酯基的甾体化合物。

实施例2

一种含酯基的甾体化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.将分枝杆菌ST-3-8进行前处理；

S2.将前处理后的分枝杆菌接种到培养基中发酵，得发酵液；

S3.对步骤S2得到的发酵液进行提纯，即得。

所述步骤S1中，将分枝杆菌进行前处理包括以下过程：

(1)一级培养：将2mL分枝杆菌ST-3-8(Mycobacterium fortuitumST-3-8)的菌种接到含有200mL第一培养液的摇瓶中，在32摄氏度的摇床上震荡培养40小时，得摇瓶种子液；

(2)二级培养：将200mL摇瓶种子液接种到含有400L第二培养液的一级种子罐中，通无菌空气(流量为0.5v/v/min)，150rpm下搅拌及在32摄氏度下培养36小时，得一级种子罐种子液；

(3)三级培养：将300L一级种子罐种子液加入到含有5m³第三培养液的二级种子罐中，通无菌空气(流量为0.5v/v/min)，150rpm下搅拌及在32摄氏度下培养2天，即得。

其中，按质量百分比计，步骤(1)的第一培养液的具体组分同实施例1。

按质量百分比计，步骤(2)的第二培养液的具体组分同实施例1。

按质量百分比计，步骤(3)的第三培养液的具体组分同实施例1。

所述步骤S2中培养基包括以下质量百分比的组分：植物甾醇1％、有机氮源2％、无机盐0.15％、助剂0.1％、水余下量。

所述有机氮源为玉米浆和黄豆饼粉；所述玉米浆和黄豆饼粉的质量比为1：0.8。

所述无机盐为磷酸二氢钾和硫酸镁；所述磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为2：1。

所述助剂选自聚氧乙烯氧丙烯甘油，购买于鼎邦化工南通有限公司。

所述分枝杆菌的接种量为9％。

步骤S3中，提纯过程包括：

1)将发酵液进行板框压滤，取滤饼；

2)向步骤1)中的滤饼中加入3倍滤饼重量的甲醇，在40摄氏度下，搅拌40min，然后板框压滤，取滤液；

4)将步骤3)处理后的物料通过板框压滤，干燥，得粗品；

5)向粗品中加入2倍粗品体积的甲基叔丁醚，加热到40摄氏度，搅拌75min，然后降温至0-5摄氏度进行结晶；

6)将步骤5)得到的物料进行离心，取离心后的母液；

7)将离心后的母液进行真空浓缩，得固体物料A；

8)向固体物料A中加入2倍固体物料A体积的体积比为70％的甲醇水溶液，搅拌70min，离心，得到的固体物料即为所述含酯基的甾体化合物。

实施例3

一种含酯基的甾体化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1.将分枝杆菌ST-3-8进行前处理；

S2.将前处理后的分枝杆菌接种到培养基中发酵，得发酵液；

S3.对步骤S2得到的发酵液进行提纯，即得。

所述步骤S1中，将分枝杆菌进行前处理包括以下过程：

(1)一级培养：将6mL分枝杆菌ST-3-8(Mycobacterium fortuitum ST-3-8)的菌种接到含有200mL第一培养液的摇瓶中，在32摄氏度的摇床上震荡培养56小时，得摇瓶种子液；

(2)二级培养：将1000mL摇瓶种子液接种到含有400L第二培养液的一级种子罐中，通无菌空气(流量为0.5v/v/min)，150rpm下搅拌及在32摄氏度下培养48小时，得一级种子罐种子液；

(3)三级培养：将500L一级种子罐种子液加入到含有8m³第三培养液的二级种子罐中，通无菌空气(流量为0.5v/v/min)，150rpm下搅拌及在32摄氏度下培养2天，即得。

所述步骤S2中培养基包括以下质量百分比的组分：植物甾醇10％、有机氮源9％、无机盐0.8％、助剂0.5％、水余下量。

所述有机氮源为玉米浆和黄豆饼粉；所述玉米浆和黄豆饼粉的质量比为1：1。

所述无机盐为磷酸二氢钾和硫酸镁；所述磷酸二氢钾和硫酸镁的质量比为10：1。

所述分枝杆菌的接种量为11％。

步骤S3中，提纯过程包括：

1)将发酵液进行板框压滤，取滤饼；

2)向步骤1)中的滤饼中加入5倍滤饼重量的甲醇，在40摄氏度下，搅拌90min，然后板框压滤，取滤液；

4)将步骤3)处理后的物料通过板框压滤，干燥，得粗品；

5)向粗品中加入5倍粗品体积的甲基叔丁醚，加热到40摄氏度，搅拌90min，然后降温至0-5摄氏度进行结晶；

6)将步骤5)得到的物料进行离心，取离心后的母液；

7)将离心后的母液进行真空浓缩，得固体物料A；

8)向固体物料A中加入5倍固体物料A体积的体积比为70％的甲醇水溶液，搅拌70min，离心，得到的固体物料即为所述含酯基的甾体化合物。

实施例4

一种含酯基的甾体化合物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S2中培养基包括以下质量百分比的组分：植物甾醇5％、有机氮源4％、无机盐0.45％、助剂0.05％、水余下量。

实施例5

一种含酯基的甾体化合物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S2中培养基包括以下质量百分比的组分：植物甾醇5％、有机氮源4％、无机盐0.45％、助剂1.5％、水余下量。

实施例6

一种含酯基的甾体化合物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S2中，助剂替换为吐温-80。

实施例7

一种含酯基的甾体化合物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S3中，提纯过程不包括步骤8)，即固体物料A为最终产品。

实施例8

一种含酯基的甾体化合物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S3中，8)中的体积比为70％的甲醇水溶液替换为甲醇。

实施例9

一种含酯基的甾体化合物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述步骤S3中，8)中的体积比为70％的甲醇水溶液替换为30％的甲醇水溶液。

性能测试

对实施例1-9所得到的物质进行MS、核磁检测，证明得到的为含酯基的甾体化合物，以实施例1得到的数据为例，相关数据为：

HR-TOF-MS m/s：359.264(C₂₃H₃₅O₃，[M+H])；

1H-NMR(400Hz):有三个-CH₃信号：0.59(3H,s)，0.98(3H,s)，1.20(3H,d,J＝6.8HZ)；一个-OCH₃信号：3.67(3H,s)；一个烯氢质子信号：5.84(1H,s)。

13C-NMR(100Hz)：显示23个碳信号，其中包含一个羰基信号：198.3；一个酯羰基信号：176.9；一组双键信号：124.1，170.4，一个-OCH₃信号：51.3，具体见表1。通过MS、核磁检测表明生成了所述含酯基的甾体化合物。

表1碳氢信号归属(¹H-NMR(400Hz)，¹³C-NMR(100Hz))

实施例1-10所得的含酯基的甾体化合物的质量(每升培养基所得的质量)及纯度(HPLC测试，面积归一法)见表2。

表2

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种含酯基的甾体化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将分枝杆菌进行前处理；

S2.将前处理后的分枝杆菌接种到培养基中发酵，得发酵液；

S3.对步骤S2得到的发酵液进行提纯，即得；

其中，所述含酯基的甾体化合物的结构式为：

所述分枝杆菌为分枝杆菌ST-3-8，为偶发分枝杆菌，保藏编号为：CGMCC No.18995；

所述步骤S2中培养基包括以下质量百分比的组分：植物甾醇1-10％、有机氮源2-9％、无机盐0.15-0.8％、助剂0.1-0.5％、水余下量；所述植物甾醇为谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇的混合物；所述助剂为聚氧乙烯氧丙烯甘油；

步骤S3中，提纯过程包括：

1)将发酵液进行板框压滤，取滤饼；

4)将步骤3)处理后的物料通过板框压滤，干燥，得粗品；

6)将步骤5)得到的物料进行离心，取离心后的母液；

7)将离心后的母液进行真空浓缩，得固体物料A；

8)向固体物料A中加入2-5倍固体物料A体积的第二醇类溶剂，搅拌50-80min，离心，得到的固体物料即为所述含酯基的甾体化合物；

所述第一醇类溶剂为甲醇；第二醇类溶剂为体积比为70％的甲醇水溶液。

2.如权利要求1所述的含酯基的甾体化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，将分枝杆菌进行前处理包括以下过程：

(2)二级培养：将200-1000mL摇瓶种子液接种到含有400L第二培养液的一级种子罐中，通入无菌空气，100-200rpm下搅拌及在30-35摄氏度下培养36-48小时，得一级种子罐种子液；

(3)三级培养：将300-500L一级种子罐种子液加入到含有5-8m³第三培养液的二级种子罐中，通入无菌空气，100-200rpm下搅拌及在30-35摄氏度下培养2-3天，即得。

3.如权利要求1所述的含酯基的甾体化合物的制备方法，其特征在于，所述有机氮源选自玉米浆、黄豆饼粉、玉米淀粉、蛋白胨、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、鱼粉、麸皮中的至少一种。

4.如权利要求3所述的含酯基的甾体化合物的制备方法，其特征在于，所述有机氮源为玉米浆和黄豆饼粉；所述玉米浆和黄豆饼粉的质量比为1：(0.8-1)。

5.如权利要求1所述的含酯基的甾体化合物的制备方法，其特征在于，所述无机盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁中的至少一种。