CN109943511B - 一株产l-缬氨酸的黄色短杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产L‑缬氨酸的黄色短杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。所述黄色短杆菌已于2019年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019053，保藏地址为中国武汉武汉大学。本发明的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)FMME447，表现出积累高水平L‑缬氨酸的能力，并验证其缬氨酸耐受能力达100g/L。该菌发酵生产L‑缬氨酸产量达到80‑90g/L，葡萄糖得率高达25‑30％左右，具有工业实用性价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株产L-缬氨酸的黄色短杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-缬氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需的氨基酸之一，具有多种生理功能，主要用于食品、调味剂、动物饲料和化妆品的制造以及配制复合氨基酸输液、合成多肽类药物和食品抗氧化剂等，尤其是医院研究和治疗中的作用日益受到重视。L-缬氨酸在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及手术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合，肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。随着其研究的不断深入，应用范围也将进一步扩大。因此，L-缬氨酸生产具有非常广泛的应用前景。
目前，L-缬氨酸的生产方法有提取法、合成法、微生物发酵法等。由于微生物发酵法原料成本低，反应条件温和，易大规模地生产，成为生产L-缬氨酸的主要方法。L-缬氨酸的生物合成途径是从丙酮酸开始，经过几步酶促反应形成L-缬氨酸。丙酮酸在乙酰乳酸合成酶的催化下形成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在二羧酸还原异构酶的催化下形成α，β-二羟基异戊酸。该产物经二羟基脱水酶催化脱水后形成α-乙酰异戊酸，α-乙酰异戊酸在转氨酶的作用下形成L-缬氨酸。其中，L-缬氨酸生物合成途径中第一个限速酶——乙酰乳酸合成酶受L-缬氨酸的反馈抑制。如果能解除乙酰乳酸合成酶的反馈抑制，必将大大提高L-缬氨酸的积累。
迄今为止，虽然研究黄色短杆菌发酵生产L-缬氨酸的报道很多，但生产水平很低，而且存在副产物亮氨酸和异亮氨酸。其中，张伟国等人以L-缬氨酸产生菌黄色短杆菌XQ-2为出发菌株，经硫酸二乙酯和亚硝基胍逐级诱变处理及氨基酸结构类似物α-氨基丁酸、2-噻唑丙氨酸和α-氨基-β-羟基戊酸定向筛选，获得一株L-缬氨酸高产菌黄色短杆菌XQ-8，其摇瓶发酵72h后，L-缬氨酸产量达64～66g/L。另外，天津科技大学徐庆阳等人以黄色短杆菌XV0505为生产菌株，研究了发酵培养基和发酵控制条件对L-缬氨酸的产量的影响，在最优发酵条件下，通过10L罐发酵72h，L-缬氨酸产量可达53.4g/L。但这些菌株仍无法达到工业上生产L-缬氨酸的需求。因此，如何获得一株高产L-缬氨酸的黄色短杆菌成为工业上高效生产L-缬氨酸的首要问题。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明筛选到一株能在含100g/L高浓度缬氨酸的培养基中正常生长，并具有代谢能力的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)FMME447，该菌发酵L-缬氨酸产量达到80-90g/L，葡萄糖得率高达25-30％左右。
本发明的第一个目的是提供一株产L-缬氨酸的黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)，所述黄色短杆菌已于2019年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019053，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明的第二个目的是提供一种生产L-缬氨酸的方法，所述方法是以葡萄糖为底物，利用所述的黄色短杆菌进行发酵生产。
在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述的黄色短杆菌接种到含有葡萄糖的发酵培养基中进行生产。
在一种实施方式中，所述发酵培养基中还含有玉米浆10～20g/L。
在一种实施方式中，所述发酵培养基中还含有维生素和生物素B1，维生素的含量为200～400μg/L，生物素B1含量为200～400μg/L。
在一种实施方式中，所述发酵培养基pH为6.8～7.0。
在一种实施方式中，所述发酵培养基具体为(每L)：葡萄糖初始浓度40～60g，玉米浆10～20g，磷酸二氢钾0.5～1.5g，七水硫酸镁0.1～0.5g，维生素200～400μg，生物素B1200～400μg。
在一种实施方式中，所述发酵生产的中后期通气量为1.0～2.5vvm。
本发明的第三个目的是提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有所述的黄色短杆菌。
本发明还提供所述的黄色短杆菌或所述的微生物菌剂在制备药物、制备医药制品、食及及调味剂﹑农业和有机化学领域的应用。
本发明的有益效果
本发明选育到一株黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)FMME447，表现出积累高水平L-缬氨酸的能力，并验证其缬氨酸耐受能力达100g/L。该菌发酵生产L-缬氨酸产量达到80-90g/L，葡萄糖得率高达25-30％左右，具有工业实用性价值。
生物材料保藏
本发明所提供的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)FMME447，分类学命名为Brevibacterium flavum FMME447，已于2019年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019053，保藏地址为中国武汉武汉大学。
附图说明
图1：L-缬氨酸标准曲线。
图2：Brevibacterium flavum FMME447发酵培养的发酵曲线。
具体实施方式
氨基酸检测采用常规的茚三酮显色比色法检测，具体参见傅力明等人文章《氨基酸在纸层析中的分离》(公开日：1998.12.31)。
葡萄糖测定方法：使用SBA-40生物传感分析仪进行分析，具体参见李宪民等人文章《生物传感分析仪测定葡萄糖和L-乳酸的影响因素研究》(公开日：2008.9.30)。
葡萄糖得率(％)＝L-缬氨酸最高产量(g/L)/总葡萄糖添加量(g/L)×100。
实施例1：黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)FMME447的获得
筛选液体培养基：缬氨酸100g，葡萄糖5g，牛肉膏5g，酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。
筛选固体培养基：缬氨酸100g，葡萄糖5g，牛肉膏5g，酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。
选育得到一株黄色短杆菌，其可以在L-缬氨酸浓度为100g/L的筛选液体培养基和L-缬氨酸浓度为100g/L的筛选固体培养基上正常生长，将该菌株命名为Brevibacteriumflavum FMME447。
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)FMME447，分类学命名为Brevibacteriumflavum FMME447，已于2019年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019053，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
固体平板培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，酵母膏10g，蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0，121℃灭菌30min。
斜面培养基：葡萄糖5g，牛肉膏5g，酵母膏10g，蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH7.0，121℃灭菌30min。
种子培养基：葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，玉米浆20g，硫酸铵3g，生物素100μg，VB1100μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0，121℃灭菌30min。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度40g，玉米浆10g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.1g，VH 200μg，VB1 200μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0，121℃灭菌30min。
(1)种子液制备
将黄色短杆菌FMME447在固体平板上划线，31℃恒温培养箱中培养48h，用接种针挑取单菌落划线于斜面培养基进行扩培，31℃恒温培养箱中培养48h，从长好的斜面上挑取一环接入种子培养基中进行培养，31℃，往复式摇床100rpm培养14h。
(2)发酵培养
将步骤(1)中制备得到的黄色短杆菌FMME447种子液按照10％接种量接种到发酵培养基中，温度31℃，前期(0～72h)通气量为2vvm，中后期(72～90h)通气量为2.5vvm，初始搅拌转速350rpm，然后搅拌和转速关联溶氧控制在10～30％，用氨水控制pH在6.8，当葡萄糖浓度低于15g/L时，补加葡萄糖，使葡萄糖浓度维持在20～40g/L，发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为84.3g/L。
实施例3：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于发酵培养基不同。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度50g，玉米浆15g，磷酸二氢钾1.0g，七水硫酸镁0.3g，VH 200μg，VB1 200μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0，121℃灭菌30min。
发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为85.7g/L。
实施例4：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于发酵培养基不同。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度60g，玉米浆20g，磷酸二氢钾0.8g，七水硫酸镁0.5g，VH 200μg，VB1 200μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0，121℃灭菌30min。
发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为87.3g/L。
表1不同玉米浆浓度下黄色短杆菌FMME447生产L-缬氨酸的产量
实施例5：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于发酵培养基不同。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度45g，玉米浆浓度15g，磷酸二氢钾0.8g，七水硫酸镁0.2g，生物素VH为200μg，VB1 300μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2。
发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为85.7g/L。
实施例6：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于发酵培养基不同。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度40g，玉米浆浓度15g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.1g，生物素VH为300μg，VB1 200μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2。
发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为87.3g/L。
实施例7：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于发酵培养基不同。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度40g，玉米浆浓度15g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.1g，生物素VH为400μg，VB1 200μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0～7.2。
发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为87.3g/L。
表2不同生物素浓度下黄色短杆菌FMME447生产L-缬氨酸的产量
实施例8：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于发酵pH为6.4和发酵培养基不同。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度40g，玉米浆浓度15g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.1g，VH 300μg，VB1 200μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0，121℃灭菌30min。
发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为84.4g/L。
实施例9：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于发酵pH为6.8和发酵培养基不同。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度40g，玉米浆浓度15g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.1g，VH 300μg，VB1 200μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0，121℃灭菌30min。
发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为87.3g/L。
实施例10：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于发酵pH为7.2和发酵培养基不同。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度40g，玉米浆浓度15g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.1g，VH 300μg，VB1 200μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0，121℃灭菌30min。
发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为88.2g/L。
实施例11：黄色短杆菌FMME447发酵生产L-缬氨酸
与实施例2的发酵过程相同，不同之处仅在于发酵pH为7.6和发酵培养基不同。
发酵培养基：初始葡萄糖浓度40g，玉米浆浓度15g，磷酸二氢钾0.5g，七水硫酸镁0.1g，VH 300μg，VB1 200μg，用蒸馏水定容1L，用氢氧化钠溶液调pH7.0，121℃灭菌30min。
发酵结束后收集发酵液离心，收集上清液用高效液相色谱法测定发酵液中L-缬氨酸的含量为84.3g/L。
表3不同发酵pH下黄色短杆菌FMME447生产L-缬氨酸的产量
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (12)
1.一株产L-缬氨酸的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，其特征在于，所述黄色短杆菌已于2019年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019053，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.一种生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以葡萄糖为底物，利用权利要求1所述的黄色短杆菌进行发酵生产。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵生产是将权利要求1所述的黄色短杆菌接种到含有葡萄糖的发酵培养基中进行生产。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中还含有玉米浆10～20g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中还含有维生素和生物素B1，维生素的含量为200～400μg/L，生物素B1含量为200～400μg/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基pH为6.8～7.0。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基每升中的组分为：葡萄糖初始浓度40～60g，玉米浆10～20g，磷酸二氢钾0.5～1.5g，七水硫酸镁0.1～0.5g，维生素200～400μg，生物素B1 200～400μg。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵生产的中后期通气量为1.0～2.5vvm。
9.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述的黄色短杆菌。
10.权利要求1所述的黄色短杆菌或权利要求9所述的微生物菌剂在制备医药制品、食品﹑农业或有机化学领域的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述应用为在制备药物中的应用。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述应用为在制备调味剂中的应用。
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