CN114369554B - 一种谷氨酸棒状杆菌及其应用 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Abstract
本发明涉及一种谷氨酸棒状杆菌及其应用，属于生物技术领域。所述谷氨酸棒状杆菌的保藏号为CCTCCM20211507。所述谷氨酸棒状杆菌可用于制备有机硒。所述有机硒的制备方法包括将所述的谷氨酸棒状杆菌接种至发酵培养基中与底物和无机硒进行发酵培养，分离，提纯，得到有机硒。所述制备方法操作简单，成本低，安全，绿色，环保，产率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体涉及一种谷氨酸棒状杆菌及其应用。
背景技术
L-硒甲基硒代半胱氨酸分子式CH3SeCH2CH(NH2)COOH，外观为白色晶体粉末，具蒜样气味。溶于水，微溶于甲醇、乙醇，在丙酮、乙醚中不溶。有引湿性，易氧化。天然的L-硒甲基硒代半胱氨酸主要来源于富硒的大蒜、洋葱等植物,具有更高的安全性和抗癌生物活性。L-硒甲基硒代半胱氨酸具有毒性小、补硒效果好、抗癌生物活性强等优点。
1960年,首次报道采用离子交换色谱法和纸色谱法从美国黄芪的叶和茎中首次分离得到天然的硒甲基硒代半胱氨酸。1987年,首次公告了氯丙氨酸二硒化钠法合成硒-甲基硒代半胱氨酸的发明专利。2001年,Spallholz发明了叔丁氧酰基保护丝氨酸法合成硒-甲基硒代半胱氨酸。2002年,Majeed发明了甲硒醇钠取代氯丙氨酸法合成硒-甲基硒代半胱氨酸。2002年,美国FDA首次认可把L-硒-甲基硒代半胱氨酸作为硒元素的膳食补充剂使用。2009年卫生部批准L-硒甲基硒代半胱氨酸为新型营养强化剂(食品添加剂新品种2009年第11号公告,2012年第4号公告明确扩大了使用范围),可广泛应用于食品和医疗保健品等方面。按照中华人民共和国国家标准《GBl4880营养强化剂》的规定,我国到目前为止已批准的硒源类的营养强化剂的主要品种有:亚硒酸钠、硒酸钠、富硒酵母、硒化卡拉胶、硒蛋白、富硒食用菌粉等6个品种。
关于L-硒-甲基硒代半胱氨酸的合成，目前主要有酶法拆分法和直接合成法。其中，有专利将2,3-二卤丙腈与甲硒醇盐反应得2-卤-3-甲硒基丙腈，然后用酸水解得2-卤-3-甲硒基丙酸，再与氨水反应得DL-硒-甲基硒代半胱氨酸。还有专利通过甲硒醇或甲硒醇盐水溶液与α-氨基丙烯酸衍生物发生加成反应生成β-甲硒基-α-氨基丙酸衍生物，然后将β-甲硒基-α-氨基丙酸衍生物中的酯化物经碱水解、酸化，再加热酸水解脱去N-酰基得到β-甲硒基-α-氨基丙酸盐，最后碱中和得到DL-硒-甲基硒代半胱氨酸。另有专利先制得二甲基二硒醚和甲硒醇盐，再通过甲硒醇盐与卤代乙醛反应生成甲硒基乙醛，然后制备甲硒基甲内酰脲，最后制得DL-硒-甲基硒代半胱氨酸。以上方法均需要进一步经过消旋和酶法拆分步骤获得D和L-硒-甲基硒代半胱氨酸，步骤繁琐，生产成本高。
因此，仍亟需一种操作简单，产率高，成本低，安全环保的L-硒甲基硒代半胱氨酸的制备方法。
发明内容
发明概述
为解决上述问题，第一方面，本申请提供谷氨酸棒状杆菌，所述谷氨酸棒状杆菌的保藏号为CCTCCM20211507。保藏号为CCTCCM20211507的谷氨酸棒状杆菌命名为CorynebacteriumglutamicumOMK-81(谷氨酸棒状杆菌OMK-81)，已经于2021年11月29日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学)进行了生物保藏。
第二方面，本申请提供一种有机硒的制备方法，其包括：将第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌接种至发酵培养基中与底物和无机硒进行发酵培养，分离，提纯，得到有机硒。所述制备方法操作简单，成本低，安全，绿色，环保，产率高。
第三方面，本申请提供一种第二方面所述制备方法制备所得的有机硒。
第四方面，本申请提供一种第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌在制备有机硒或L-硒甲基硒代半胱氨酸中的应用。
发明详述
为解决上述问题，本申请提供以下技术方案。
第一方面，提供一种谷氨酸棒状杆菌。
一种谷氨酸棒状杆菌，其保藏号为CCTCCM20211507所述谷氨酸棒状杆菌可用于制备有机硒(例如L-硒甲基硒代半胱氨酸)。
保藏号为CCTCCM20211507的谷氨酸棒状杆菌命名为CorynebacteriumglutamicumOMK-81(谷氨酸棒状杆菌OMK-81)，该谷氨酸棒状杆菌已经于2021年11月29日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学)进行了生物保藏，分类命名为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。菌株来源：发明人成功筛选出一株可以生物转化L-丝氨酸和甲硒醇(钠)生成L-硒甲基硒代半胱氨酸的菌株Corynebacteriumglutamicum，然后采用单一或混合化学诱变试剂对该菌株进行多轮化学诱变，同时采用合理的菌株筛选方式，最终筛选到一株高效转化L-丝氨酸和甲硒醇或甲硒醇钠生成L-硒甲基硒代半胱氨酸的突变株CorynebacteriumglutamicumOMK-81。
第二方面，提供一种有机硒的制备方法。
一种有机硒的制备方法，其包括：将第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌接种至发酵培养基中与底物和无机硒进行发酵培养，分离，提纯，得到有机硒。在一些实施例中，一种生产有机硒的制备方法，其包括：将第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌经扩大培养，得种子液，将种子液接种至发酵培养基中与底物和无机硒进行发酵培养，分离，提纯，得到有机硒。在一些实施例中，一种生产有机硒的制备方法，其包括：将第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌经活化，扩大培养，得种子液，将种子液接种至发酵培养基中与底物和无机硒进行发酵培养，分离，提纯，得到有机硒。
所述底物包括选自L-丝氨酸。
所述无机硒包括选自甲硒醇或其盐。在一些实施例中，所述无机硒包括选自甲硒醇或甲硒醇钠。
所述有机硒包括选自L-硒甲基硒代半胱氨酸。
所述活化包括：将第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养至菌株饱满。
所述扩大培养包括：将第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌或活化后的第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌于种子培养基中进行扩大培养。在一些实施例中，所述扩大培养包括：将第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌或活化后的第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌以0.005％vol-30％vol(例如0.005％vol、0.01％vol、0.05％vol、0.1％vol、0.5％vol、1.0％vol、2.0％vol、5.0％vol、10％vol、15％vol、20％vol、25％vol或30％vol)的接种量接种于种子培养基中进行扩大培养。
所述发酵培养包括将种子液以0.005％vol-30％vol(例如0.005％vol、0.01％vol、0.05％vol、0.1％vol、0.5％vol、1.0％vol、2.0％vol、5.0％vol、10％vol、15％vol、20％vol、25％vol或30％vol)的接种量接种于发酵培养基中进行培养。
所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基包括：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠和水。在一些实施例中，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基包括：1g/L-5g/L的牛肉膏、5g/L-15g/L的蛋白胨、15g/L-25g/L的琼脂和1g/L-10g/L的氯化钠，余量为水。在一些实施例中，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基包括：2g/L-4g/L的牛肉膏、8g/L-12g/L的蛋白胨、15g/L-25g/L的琼脂和3g/L-7g/L的氯化钠，余量为水。在一些实施例中，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基包括：3g/L的牛肉膏、10g/L的蛋白胨、15g/L-25g/L的琼脂和5g/L的氯化钠，余量为水。
所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的pH为7.4-7.6。
所述种子培养基包括葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化钠和水。在一些实施例中，所述种子培养基包括10g/L-30g/L的葡萄糖、10g/L-20g/L的酵母粉、5g/L-15g/L的蛋白胨、1g/L-5g/L的磷酸二氢钾、1g/L-5g/L的氯化钠，余量水。在一些实施例中，所述种子培养基包括15g/L-25g/L的葡萄糖、12g/L-17g/L的酵母粉、8g/L-12g/L的蛋白胨、1g/L-3g/L的磷酸二氢钾、1g/L-4g/L的氯化钠，余量水。在一些实施例中，所述种子培养基包括20g/L的葡萄糖、15g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、2g/L的磷酸二氢钾、2.5g/L的氯化钠，余量水。
所述种子培养基的pH为6.0-8.0。在一些实施例中，所述种子培养基的pH为7.0。
所述发酵培养基包括葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸锰和水。在一些实施例中，所述发酵培养基包括20g/L-40g/L的葡萄糖、5g/L-15g/L的酵母粉、0.5g/L-2g/L的蛋白胨、0.1g/L-0.5g/L的硫酸镁、0.5g/L-1.5g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L-1.0g/L的氯化钠、1.0g/L-10.0g/L的硫酸铵、1.0g/L-5.0g/L的磷酸氢二钾和0.00005g/L-0.0002g/L的硫酸锰，余量水。在一些实施例中，所述发酵培养基包括25g/L-35g/L的葡萄糖、8g/L-12g/L的酵母粉、0.8g/L-1.5g/L的蛋白胨、0.1g/L-0.3g/L的硫酸镁、1.0g/L-1.5g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L-1.0g/L的氯化钠、3.0g/L-8.0g/L的硫酸铵、1.0g/L-3.0g/L的磷酸氢二钾和0.00008g/L-0.00015g/L的硫酸锰，余量水。在一些实施例中，所述发酵培养基包括30g/L的葡萄糖、10g/L的酵母粉、1g/L的蛋白胨、0.2g/L的硫酸镁、1.2g/L的磷酸二氢钾、0.8g/L的氯化钠、5.0g/L的硫酸铵、2.4g/L的磷酸氢二钾和0.0001g/L的硫酸锰，余量水。
所述活化的温度为20℃-40℃。在一些实施例中，所述活化的温度为20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃。在一些实施例中，所述活化的温度为37℃。
所述活化的时间为12小时-60小时。在一些实施例中，所述活化的时间为12小时、15小时、20小时、24小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、55小时或60小时。在一些实施例中，所述活化的时间为24小时。
所述扩大培养的温度为20℃-40℃。在一些实施例中，所述扩大培养的温度为20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃。在一些实施例中，所述扩大培养的温度为37℃。
所述扩大培养的通气比为1:0.1-1:0.3。在一些实施例中，所述扩大培养的通气比为1:0.1、1:0.2或1:0.3。
所述扩大培养的转速为100rpm-900rpm。在一些实施例中，所述扩大培养的转速为100rpm、150、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm、750rpm、800rpm、850rpm或900rpm。在一些实施例中，所述扩大培养的转速为200rpm。
所述扩大培养的时间为5小时-200小时。在一些实施例，所述扩大培养的时间为5小时、10小时、12小时、15小时、20小时、25小时、30小时、50小时、100小时、150小时或200小时。在一些实施例，所述扩大培养的时间为12小时。
所述发酵培养的发酵体系pH为6.0-8.0。在一些实施例中，所述发酵培养的发酵体系pH为6.0、6.5、6.8、7.0、7.5或8.0。在一些实施例中，所述发酵培养的发酵体系pH为6.8-7.0。
所述发酵体系pH通过添加氢氧化钠来进行调节。在一些实施例中，所述发酵体系pH通过添加5wt％-40wt％(例如10wt％、15wt％、20wt％、25wt％、30wt％或35wt％)的氢氧化钠水溶液来进行调节。
所述发酵培养的时间为10小时-50小时。在一些实施例中，所述发酵培养的时间为12小时-30小时。在一些实施例中，所述发酵培养的时间为在加入底物和无机硒前先发酵5小时-16小时(例如5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时或16小时)，然后继续发酵1小时-30小时(例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时或者30小时)。在一些实施例中，所述发酵培养的时间为在加入底物和无机硒前先发酵5小时-16小时，然后继续发酵5小时-30小时。在一些实施例中，所述发酵培养的时间为在加入底物和无机硒前先发酵12小时-16小时，然后继续发酵10小时-24小时。在一些实施例中，所述发酵培养的时间为在加入底物和无机硒前先发酵12小时-16小时，然后继续发酵10小时-20小时。在一些实施例中，所述发酵培养的时间为在加入底物和无机硒前先发酵12小时-16小时，然后继续发酵10小时-15小时。
所述发酵培养转速为100rpm-900rpm。在一些实施例中，所述发酵培养转速为100rpm、150、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm、750rpm、800rpm、850rpm或900rpm。在一些实施例中，所述发酵培养转速为400rpm。
所述发酵培养的通气比为1:0.1-1:0.8。在一些实施例中，所述发酵培养的通气比为1:0.4。在一些实施例中，所述发酵培养的通气比为1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7或1:0.8。
以所述发酵培养基的总体积计算，所述底物的加入量为0.01g/L-300g/L(例如5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、200g/L、250g/L或300g/L)。在一些实施例中，以所述发酵培养基的总体积计算，所述底物的加入量为100g/L-200g/L。在一些实施例中，以所述发酵培养基的总体积计算，所述底物的加入量为150g/L。
以所述发酵培养基的总体积计算，所述无机硒的加入量为0.01g/L-300g/L(例如5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、200g/L、250g/L或300g/L)。在一些实施例中，以所述发酵培养基的总体积计算，所述无机硒的加入量为100g/L-250g/L。在一些实施例中，以所述发酵培养基的总体积计算，所述无机硒的加入量为180g/L。
所述底物或无机硒的加入方式为一次加入、分批加入或分批流加。
所述底物或无机硒可以在所述谷氨酸棒状杆菌的潜伏期、指数增生期或者平台期加入发酵培养基。在一些实施例中，所述底物或无机硒在所述谷氨酸棒状杆菌的平台期加入发酵培养基。
第三方面，提供一种根据第二方面所述的制备方法制备所得的有机硒。
一种根据第二方面所述的制备方法制备所得的有机硒。
在一些实施例中，所述有机硒为L-硒甲基硒代半胱氨酸。
第四方面，提供一种第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌在制备有机硒或L-硒甲基硒代半胱氨酸中的应用。
一种第一方面所述的谷氨酸棒状杆菌在制备有机硒或L-硒甲基硒代半胱氨酸中的应用。
有益效果
相比现有技术，上述技术方案的一个实施例至少具有包括以下有益技术效果中的一种：
(1)本发明所提供的谷氨酸棒状杆菌可用于制备有机硒(例如L-硒甲基硒代半胱氨酸)。
(2)本发明所提供的谷氨酸棒状杆菌在制备有机硒(例如L-硒甲基硒代半胱氨酸)时，所得产物产率高，速度快，制备时间短，具有优异的技术效果。
(3)本发明采用谷氨酸棒状杆菌(尤其是采用Corynebacterium glutamicum OMK-81)制备有机硒，其操作简单，成本低，安全，绿色，环保，产率高。
附图说明
图1为实施例1采用野生型谷氨酸棒状杆菌制备L-硒甲基硒代半胱氨酸的发酵时间与产物量的关系图。
图2为实施例1采用谷氨酸棒状杆菌OMK-81(Corynebacterium glutamicum OMK-81)制备L-硒甲基硒代半胱氨酸的发酵时间与产物量的关系图。
图3为发酵产物中L-硒甲基硒代半胱氨酸的氢谱图。
术语定义：
在本文的上文中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数字，每一个数字的数值有可能会出现±10％以下的差异或者本领域人员认为的合理的差异，如±1％、±2％、±3％、±4％或±5％的差异。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
术语“wt％”是指质量百分比。
术语“％vol”表示体积百分比。
术语“通气比”是指单位体积发酵液中单位时间(通常为每分钟)内通入的气体体积。例如“1:0.4的通气比”即1L的发酵液每分钟通气0.4L的气体。
扩大培养中的术语“接种量”是指含谷氨酸棒状杆菌的培养基的体积占接种后种子培养基和含谷氨酸棒状杆菌的培养基的总体积的体积百分比。
发酵培养中的术语“接种量”是指含种子液接种于发酵培养基后，种子液的体积占种子液和发酵培养基总体积的体积百分比。
术语“OD600”是指检测的600nm波长处的光密度。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本文的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本文的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例以对本文作进一步的详细说明。
本文所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本申请所描述的方法制备而得。
术语“rpm”表示转速“转每分钟”；“℃”表示温度单位“摄氏度”；“L”表示体积单位“升”；“mL”表示体积单位“毫升”；“pH”表示酸碱度；“g”表示质量单位“克”；“Mpa”表示压强单位“兆帕”。
除另有说明外，以下实施例所采用的培养基的配方如下所示：
表1：牛肉膏蛋白胨琼脂平板(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)
表2：种子培养基
| 组分 | 浓度(g/L) |
| 葡萄糖 | 20 |
| 酵母粉 | 15 |
| 蛋白胨 | 10 |
| 磷酸二氢钾 | 2.0 |
| 氯化钠 | 2.5 |
| 水 | 余量 |
| pH | 7.0 |
表3：发酵培养基
| 组分 | 浓度(g/L) |
| 葡萄糖 | 30 |
| 酵母粉 | 10 |
| 蛋白胨 | 1.0 |
| 硫酸镁 | 0.2 |
| 磷酸二氢钾 | 1.2 |
| 氯化钠 | 0.8 |
| 硫酸铵 | 5.0 |
| 磷酸氢二钾 | 2.4 |
| 硫酸锰 | 0.0001 |
| 水 | 余量 |
| pH | 自然，不调节 |
实施例1：L-硒甲基硒代半胱氨酸的制备
(1)平板活化
分别取一管-80℃冰箱冷藏甘油的野生型谷氨酸棒状杆菌菌种和突变株CorynebacteriumglutamicumOMK-81菌种(Corynebacteriumglutamicum OMK-81的保藏号：CCTCCM20211507)分别在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上菌种划线，平板置于37℃培养箱至克隆子饱满。
(2)种子培养
分别从活化平板上挑取野生型谷氨酸棒状杆菌或Corynebacterium glutamicumOMK-81的单克隆子接种于种子摇瓶，分别于37℃、200rpm摇床中培养12h；得种子液，镜检无杂菌后，准备转移至种子摇瓶。
(3)发酵培养
以10％的接种量将摇瓶中的种子液接种至发酵罐(摇瓶)，于37℃培养，pH使用30％氢氧化钠溶液自动控制在6.8-7.0，培养12h-16h，用分光光度计测定OD600，当OD600不再增加，进入生物转化阶段。添加底物L-丝氨酸150g/L和甲硒醇钠180g/L。每4h检测L-硒甲基硒代半胱氨酸产物量，待底物反应完全或不再继续反应时，结束发酵，分离，纯化，得到L-硒甲基硒代半胱氨酸。发酵时间与产物量的关系见图1(野生型谷氨酸棒状杆菌)和图2(突变株Corynebacteriumglutamicum OMK-81)。取所得L-硒甲基硒代半胱氨酸检测其质谱和氢谱，质谱：[M+H+]＝182.9754；氢谱：如图3所示。
结果分析：
(1)本发明所提供的野生型谷氨酸棒状杆菌具有良好的制备L-硒甲基硒代半胱氨酸的活性，所述野生型谷氨酸棒状杆菌在底物和无机硒加入反应体系后，采用实施例1所述发酵条件继续发酵14小时内便可具有3.6g/L的L-硒甲基硒代半胱氨酸产量。
(2)本发明所提供的Corynebacterium glutamicum OMK-81具有良好的制备L-硒甲基硒代半胱氨酸的活性，所述Corynebacterium glutamicum OMK-81在底物和无机硒加入反应体系后，采用实施例1所述发酵条件继续发酵14小时内便可具有200g/L的L-硒甲基硒代半胱氨酸产量。
实施例2：L-硒甲基硒代半胱氨酸的制备
(1)平板活化
取一管-80℃冰箱冷藏甘油的Corynebacteriumglutamicum OMK-81菌种，分别在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上菌种划线，37℃培养24h，得活化的CorynebacteriumglutamicumOMK-81菌。
(2)种子培养
挑取实施例2步骤(1)活化后所得活化的Corynebacteriumglutamicum OMK-81菌的菌丝接种于装有1.8L种子培养基的3L生物反应器中，在通风比为1:0.3的条件下搅拌转速300rpm，37℃培养16h，得到种子液。
(3)发酵培养
将10.2L发酵培养基装入20L生物反应器中，121℃灭菌30min，然后将培养好的1.8L种子液接种于20L生物反应器中进行发酵，发酵温度37℃，搅拌转速400rpm，通气比1：0.4。待发酵培养20h后，微生物OD600不再增加，开始添加底物L-丝氨酸150g/L和甲硒醇钠180g/L，继续发酵24h，分离，纯化，得到L-硒甲基硒代半胱氨酸。发酵结束用HPLC法测定发酵液中L-硒甲基硒代半胱氨酸的浓度为200g/L。
实施例3：L--硒甲基硒代半胱氨酸的制备
(1)平板活化
取一管-80℃冰箱冷藏甘油的Corynebacteriumglutamicum OMK-81菌种，分别在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上菌种划线，37℃培养24h，得活化的CorynebacteriumglutamicumOMK-81菌。
(2)种子培养
挑取实施例2步骤(1)活化后所得活化的Corynebacteriumglutamicum OMK-81菌的菌丝接种于装有1.8L种子培养基的3L生物反应器中，在通风比为1:0.1的条件下搅拌转速400rpm，37℃培养13h，得到种子液。
(3)发酵培养
将10.2L发酵培养基装入20L生物反应器中，121℃灭菌30min，然后将培养好的1.8L种子液接种于20L生物反应器中进行发酵，发酵温度30℃，搅拌转速500rpm，通气比1：0.4。待发酵培养12h后，微生物OD600不再增加，开始添加底物L-丝氨酸130g/L和甲硒醇钠156g/L，继续发酵16h。继续发酵16h(此时产物L-硒甲基硒代半胱氨酸浓度不再增加)，分离，纯化，得到L-硒甲基硒代半胱氨酸。发酵结束用HPLC法测定发酵液中L-硒甲基硒代半胱氨酸浓度为175g/L。
本申请的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本申请内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本申请技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本申请内。
Claims (43)
1.一种谷氨酸棒状杆菌，其保藏号为CCTCC NO：M20211507，拉丁名称为Corynebacteriumglutamicum。
2.一种L-硒甲基硒代半胱氨酸的制备方法，其包括：将权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌接种至发酵培养基中与底物和无机硒进行发酵培养，分离，提纯，得到L-硒甲基硒代半胱氨酸；所述底物为L-丝氨酸，所述无机硒为甲硒醇钠；以所述发酵培养基的总体积计算，所述底物的加入量为130g/L-300g/L，所述无机硒的加入量为156g/L-300g/L；
或者
将权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌经扩大培养，得种子液，将种子液接种至发酵培养基中与底物和无机硒进行发酵培养，分离，提纯，得到L-硒甲基硒代半胱氨酸；所述底物为L-丝氨酸，所述无机硒为甲硒醇钠；以所述发酵培养基的总体积计算，所述底物的加入量为130g/L-300g/L，所述无机硒的加入量为156g/L-300g/L；
或者
将权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌经活化，扩大培养，得种子液，将种子液接种至发酵培养基中与底物和无机硒进行发酵培养，分离，提纯，得到L-硒甲基硒代半胱氨酸；所述底物为L-丝氨酸，所述无机硒为甲硒醇钠；以所述发酵培养基的总体积计算，所述底物的加入量为130g/L-300g/L，所述无机硒的加入量为156g/L-300g/L。
3.根据权利要求2所述的制备方法，所述活化包括：将权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养至菌株饱满。
4.根据权利要求2所述的制备方法，所述扩大培养包括：将权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌或活化后的权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌于种子培养基中进行扩大培养。
5.根据权利要求2所述的制备方法，所述扩大培养包括：将权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌或活化后的权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌以0.005%vol-30%vol的接种量接种于种子培养基中进行扩大培养。
6.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养包括将种子液以0.005%vol-30%vol的接种量接种于发酵培养基中进行培养。
7.根据权利要求3所述的制备方法，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基包括：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠和水。
8.根据权利要求3所述的制备方法，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基包括：1g/L-5g/L的牛肉膏、5g/L-15g/L的蛋白胨、15g/L-25 g/L的琼脂和1g/L-10 g/L的氯化钠，余量为水。
9.根据权利要求3所述的制备方法，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基包括：3g/L的牛肉膏、10g/L的蛋白胨、15g/L-25 g/L的琼脂和5g/L的氯化钠，余量为水。
10.根据权利要求3所述的制备方法，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的pH为7.4-7.6。
11.根据权利要求4或5所述的制备方法，所述种子培养基包括葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化钠和水。
12. 根据权利要求4或5所述的制备方法，所述种子培养基包括10g/L-30 g/L的葡萄糖、10g/L-20 g/L的酵母粉、5 g/L -15 g/L的蛋白胨、1g/L-5 g/L的磷酸二氢钾、1g/L-5g/L的氯化钠，余量水。
13.根据权利要求4或5所述的制备方法，所述种子培养基包括20 g/L的葡萄糖、15 g/L的酵母粉、10 g/L的蛋白胨、2 g/L的磷酸二氢钾、2.5 g/L的氯化钠，余量水。
14.根据权利要求4或5所述的制备方法，所述种子培养基的pH为6.0-8.0。
15.根据权利要求4或5所述的制备方法，所述种子培养基的pH为7.0。
16.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养基包括葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸锰和水。
17.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养基包括20 g/L -40 g/L的葡萄糖、5g/L -15 g/L的酵母粉、0.5 g/L -2g/L的蛋白胨、0.1 g/L-0.5 g/L的硫酸镁、0.5 g/L -1.5 g/L的磷酸二氢钾、0.5 g/L -1.0 g/L的氯化钠、1.0 g/L -10.0 g/L的硫酸铵、1.0 g/L -5.0g/L的磷酸氢二钾和0.00005 g/L -0.0002 g/L的硫酸锰，余量水。
18.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养基包括30 g/L的葡萄糖、10 g/L的酵母粉、1 g/L的蛋白胨、0.2 g/L的硫酸镁、1.2 g/L的磷酸二氢钾、0.8 g/L的氯化钠、5.0g/L的硫酸铵、2.4 g/L的磷酸氢二钾和0.0001 g/L的硫酸锰，余量水。
19.根据权利要求2所述的制备方法，所述活化的温度为20℃-40℃。
20.根据权利要求2所述的制备方法，所述活化的温度为37℃。
21.根据权利要求2所述的制备方法，所述活化的时间为12小时-60小时。
22.根据权利要求2所述的制备方法，所述活化的时间为24小时。
23.根据权利要求2所述的制备方法，所述扩大培养的温度为20℃-40℃。
24.根据权利要求2所述的制备方法，所述扩大培养的温度为37℃。
25.根据权利要求2所述的制备方法，所述扩大培养的通气比为1:0.1-1:0.3。
26.根据权利要求2所述的制备方法，所述扩大培养的转速为100 rpm -900 rpm。
27.根据权利要求2所述的制备方法，所述扩大培养的转速为200 rpm。
28.根据权利要求2所述的制备方法，所述扩大培养的时间为5小时-200小时。
29.根据权利要求2所述的制备方法，所述扩大培养的时间为10-15小时。
30.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养的发酵体系pH为6.0-8.0。
31.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养的发酵体系pH为6.8-7.0。
32.根据权利要求30所述的制备方法，所述发酵体系pH通过添加氢氧化钠来进行调节。
33.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养的时间为10小时-50小时。
34.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养的时间为12小时-30小时。
35.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养转速为100 rpm -900 rpm。
36.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养转速为400 rpm。
37.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养的通气比为1:0.1-1:0.8。
38.根据权利要求2所述的制备方法，所述发酵培养的通气比为1:0.4。
39.根据权利要求2所述的制备方法，以所述发酵培养基的总体积计算，所述底物的加入量为150g/L。
40.根据权利要求2所述的制备方法，以所述发酵培养基的总体积计算，所述无机硒的加入量为180g/L。
41.根据权利要求2所述的制备方法，所述底物或无机硒的加入方式为一次加入、分批加入。
42.根据权利要求2所述的制备方法，所述底物或无机硒的加入方式为分批流加。
43.一种权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌在制备L-硒甲基硒代半胱氨酸中的应用。
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