CN117070367B - 出芽短梗霉ncps2022-m及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物培养领域，具体涉及一株出芽短梗霉，还涉及其培养方法。本发明的出芽短梗霉的分类命名为出芽短梗霉NCPS2022‑M，该菌株已于2022年08月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221272。本发明所提供的出芽短梗霉，是将野生型菌株NCP2016和ARTP诱变产生的突变体92、214、219、221、233和246培养并筛选所获得的。本发明的出芽短梗霉与现有的普鲁兰糖生产菌株相比，普鲁兰多糖的产率更高，极大的提高了原料的利用率、降低了生成成本，并且产品色素含量低，满足了食品、医药、环境等应用领域对普鲁兰糖颜色的要求。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株及其培养方法和利用该菌株生产普鲁兰多糖的方法。
背景技术
普鲁兰糖是一种由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)分泌的胞外水溶性多糖，是一种线性α-D-葡聚糖，由与α-1，6键连接的麦芽三糖单元组成，而麦芽三糖单元内的葡萄糖残基通过α-1，4-糖苷键连接。普鲁兰多糖中α-1，4和α-1，6糖苷键的共存赋予了普鲁兰多糖独特的物理化学性质，并且具有用于化学修饰的反应位点，使其具有优异的成膜性能、可再生性、无毒性、稳定性、生物相容性、亲水性和降解性，并广泛应用于食品科学，制药，化妆品和生物医学等各个行业。特别是在生物医学研究领域，普鲁兰多糖由于其许多独特的性质，如基因递送，药物递送，组织工程，疫苗接种，分子伴侣，血浆膨胀剂等。然而，普鲁兰多糖昂贵的生产成本严重限制了其在各个行业的应用，随着市场对普鲁兰多糖需求的增加，研究开发具有成本效益的普鲁兰多糖生产方法将成为研发的重点。
目前，微生物生物发酵是生产普鲁兰的主要手段，同时还进行了诱变和代谢工程策略来改善普鲁兰的形成。普鲁兰多糖产量高低与所采用的微生物种类密不可分，出芽短梗霉是普鲁兰多糖发酵常用菌种之一，但现有技术的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的产量较低、糖转化率不高的问题，如已经报道的A.melanogenum A4菌株，尽管可以在300g/l麦芽糖发酵培养基中发酵生产普鲁兰糖，但是产量为122.3g/L，转化率只有0.4g/g(Chen etal.,2019)，大量的碳源未转化为普鲁兰糖，不利于降低生产成本。
因此提供一种高产普鲁兰多糖株，还需要对其培养方法进行探究，以便于使其在培养的过程中提高普鲁兰多糖的产量，促进普鲁兰多糖的工业化生产。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株，还提供了上述菌株的培养方法，以及利用该菌株生产普鲁兰多糖的方法。
本发明所提供的出芽短梗霉菌，于2022年08月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20221272，分类命名为：出芽短梗霉Aureobasidium pullulans NCPS2022-M。
本发明中的出芽短梗霉NCPS2022-M，在保藏之前曾以出芽短梗霉M233-20来命名。
上述的出芽短梗霉菌，其ITS DNA序列如序列表1所示。
上述的出芽短梗霉菌的培养方法，包括以下的步骤：
(1)活化菌种：将出芽短梗霉菌接种在种子培养基中，并在26～30℃下以200～240rpm的转速孵育20～28小时；
(2)摇瓶发酵培养：将种子培养物转移到含有60～100mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为4～6％，并在26～30℃和200～240rpm的旋转振荡器上培养150～160小时。
优选的，(1)中，在28℃下以220rpm的转速孵育24小时。
(2)中，所述的发酵培养基为：190～210g/L葡萄糖、5～9g/L豆粕水解物、4～8g/L氯化钾、2～5g/L氯化钠、0.1～0.3g/L硫酸铵、0.05～0.25g/L硫酸镁和10～20g/L食品级轻质CaCO3。
更优选的，(2)中，200g/L葡萄糖、7.01g/L豆粕水解物、6g/L氯化钾、3.44g/L氯化钠、0.18g/L硫酸铵、0.1g/L硫酸镁和16g/L食品级轻质CaCO3。
出芽短梗霉菌的培养方法，包括以下的步骤：
(1)活化菌种：将出芽短梗霉菌接种在种子培养基中，并在26～30℃下以200～240rpm的转速孵育20～28小时；
(2)发酵罐培养：在发酵罐中加入培养基，取步骤(1)中的活化的菌种，转移到发酵罐中发酵培养，离心，获得含有普鲁兰多糖的上清液；发酵罐培养所采用的培养基为：190～210g/L葡萄糖、5～9g/L豆粕水解物、4～8g/L氯化钾、2～5g/L氯化钠、0.1～0.3g/L硫酸铵、0.05～0.25g/L硫酸镁和10～20g/L食品级轻质CaCO3。
更优选的，发酵罐发酵培养基如下：200g/L葡萄糖、7.01g/L豆粕水解物、6g/L氯化钾、3.44g/L氯化钠、0.18g/L硫酸铵、0.1g/L硫酸镁和16g/L食品级轻质CaCO3。
优选的，(2)发酵培养时，取1L步骤(1)中的活化的菌种，转移到灭菌后的培养基中，在28℃、400rpm下进行发酵培养，并且保持曝气速率为20L/min，168h后取培养物。
利用出芽短梗霉菌发酵生产普鲁兰多糖的方法，其步骤是，将经过上述方法获得的培养物在10000rpm和4℃下离心10min，获得含有普鲁兰多糖的上清液，该上清液通过干燥，获得普鲁兰多糖。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明中，经过筛选所获得的突变体出芽短梗霉，其对于高浓度的葡萄糖具有优异的耐受性，可以实现在高浓度葡萄糖的条件下高产普鲁兰多糖；最终实现普鲁兰多糖的产量能达到162g/L以上；
(2)本发明的出芽短梗霉发酵所产的普鲁兰多糖，其颜色呈现出米白色，不含黑色素，克服了普通的出芽短梗霉菌所产的普鲁兰多糖产生黑色素致使的产品外观不甚理想的缺陷，从而大大提高了产品的品质，满足了普鲁兰多糖在食品、医药、环境等应用领域对普鲁兰糖颜色的要求。
附图说明
图1为本发明的出芽短梗霉菌菌株的菌落形态；左图为培养3天的菌落形态，右图为培养10天的菌落形态；
图2为本发明与其它的两株出芽短梗霉对不同浓度葡萄糖的细胞生长耐受性；
图3为本发明的出芽短梗霉菌菌株发酵所生产的普鲁兰多糖冻干粉；
图4为本发明的出芽短梗霉菌菌株在30-L生物反应器中的分批发酵结果。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
实施例1
获取高产普鲁兰多糖的菌株
(1)菌株及培养
将野生型菌株NCP2016和ARTP诱变产生的突变体92，214，219，221，233和246储存在1.5mL Eppendorf管中，温度为-80℃，甘油为20％(v/v)。将菌株在500mL摇瓶中好氧培养，该瓶含有100mL种子培养物，其中含有20g/L葡萄糖，2.5g/L酵母提取物，6.6g/L K2HPO4，1g/L NaCl，0.6g/L(NH4)2SO4和0.2g/L MgSO4，在28℃下以220rpm的转速培养约24h。然后，将培养的接种物从摇瓶转移到含有20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖和20g/L琼脂的YPD琼脂平板中并分离单个菌落。48小时后，将板中的单个菌落转移至YPD琼脂倾斜培养基中在28℃下孵育48小时。
(2)筛选普鲁兰高水平生产的菌株
ARTP工艺是使用ARTP-IIIS仪器进行的，以构建普鲁兰生产菌株的诱变库。将细胞在28℃的YPD板上培养48小时，将单个菌落转移到含有80mL筛选培养基的500mL摇瓶中，并在28℃和220rpm下培养4天。筛选培养基含有100g/L葡萄糖、10g/L大豆粉水解物、7.5g/L氯化钾、1g/L氯化钠、0.6g/L(NH4)2SO4和0.2g/L MgSO4和2g/L食品级轻质CaCO3。最后，根据下面(3)中描述的方法测试突变体产生的普鲁兰多糖的产量。
(3)适应性实验室进化
适应培养基的制备方法与YPD琼脂培养基相似，YPD琼脂培养基中的葡萄糖浓度由2％提高到50％。从葡萄糖中高产的普鲁兰多糖的ARTP诱变的突变株生长在28℃下含有50％葡萄糖的YPD琼脂培养基中3天，随后将单个菌落接种到新鲜的适应性培养基中。该菌株在适应性培养基板上培养20个以上的繁殖周期，分离单个菌落并测量普鲁兰多糖的产量。
通过(1)～(3)中的方法，筛选并获得最高产普鲁兰多糖的菌株，作为本发明的起始菌株。
表1不同突变菌株普鲁兰多糖的产量
从以上表格中的数据可以看出，不同的突变株产普鲁兰多糖有显著的差异，本发明人从突变株中突变体92、214、219、221、233和246中获得一株最高产普鲁兰多糖的菌株，并进行了高浓度葡萄糖适应性实验室进化，得到了一株能在80％(w/v)葡萄糖平板中快速生长的菌株M233-20作为本发明的起始菌株出芽短梗霉NCPS2022-M。
实施例2
2.1响应面法获得优化培养基
利用摇瓶发酵生产普鲁兰多糖，关于发酵所采用的培养基，本发明人主要考察了豆粕水解物、氯化钠、硫酸铵对普鲁兰多糖的产量影响，对发酵培养基中的三种原料采用响应面法进行了优化，具体的方案和数据如下：
(1)活化菌株
将实施例1中最高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉Aureobasidium pullulansNCPS2022-M接种在种子培养物中，并在28℃和220rpm下孵育约24小时；
种子培养物中含有：20g/L葡萄糖，2.5g/L酵母提取物，6.6g/L K2HPO4，1g/L NaCl，0.6g/L(NH4)2SO4和0.2g/L MgSO4；
(2)将(1)中所获得的活化菌种转移到含有80mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种物为5％，并在28℃和220rpm的旋转振荡器上培养156小时。
发酵培养基中，200g/L葡萄糖、6g/L氯化钾、16g/L食品级轻质CaCO3；其它三种原料的取值如表2所示。
表2响应面法优化最佳的发酵培养基配方生产普鲁兰糖
2.2最优化培养基发酵生产普鲁兰多糖
在响应面优化的基础上，获得了最优选的摇瓶发酵培养基：200g/L葡萄糖、7.01g/L豆粕水解物、6g/L氯化钾、3.44g/L氯化钠、0.18g/L硫酸铵和0.1g/L硫酸镁、16g/L食品级轻质CaCO3。
豆粕水解物，是指将豆粕在121℃下用0.25M HCl酸水解30min来制备豆粕水解液。
在最优化的培养基下，利用筛选的最高产出芽短梗霉发酵产普鲁兰多糖，结果如表3所示：
表3优化的培养基产普鲁兰多糖的量
从以上表格中的数据可以看出，在最优化的培养基下出芽短梗霉所产的普鲁兰多糖达到了162.1g/L，其产量远远高于目前现有的出芽短梗霉产普鲁兰多糖的量(多篇文献报道的采用普通出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖其产量为60～70g/L，最高的仅仅只有120～130g/L，本发明的产量高于现有技术中产量约20％以上)，可见，本发明的菌株具有高产普鲁兰多糖的性能。
并且本发明的菌株还能耐受高浓度的葡萄糖，从附图2中可以看出，本发明的出芽短梗霉与其它的两株出芽短梗霉对不同浓度葡萄糖的细胞生长耐受性比较，其耐受高浓度葡萄糖性能优异。这也是普通的出芽短梗霉所不具备的性能。
从附图3中可以看出，本发明的菌株在培养过程中所产的普鲁兰多糖，其颜色呈现出米白色，不含有黑色素，克服了普通的出芽短梗霉所产的普鲁兰多糖具有黑色素的缺陷。通过色度计检测实施例2中2.2的普鲁兰多糖样品，结果如下：色度计显示L＝97.42，a＝-0.03,b＝1.52。色度计的厂家：上海仪电物理光学仪器有限公司。
实施例3
为了验证本发明的菌株产普鲁兰多糖的稳定性，本发明人进行了如下的平行实验：
3.1与实施例2(优化方案)的不同在于，发酵培养基为：
195g/L葡萄糖、6.8g/L豆粕水解物、5.8g/L氯化钾、3.6g/L氯化钠、0.2g/L硫酸铵和0.12g/L硫酸镁、15g/L食品级轻质CaCO3；其余与实施例2.1相同。普鲁兰多糖最终的产量为：160.1g/L。
3.2发酵培养基为：
205g/L葡萄糖、6.9g/L豆粕水解物、5.9g/L氯化钾、3.5g/L氯化钠、0.19g/L硫酸铵和0.09g/L硫酸镁、16g/L食品级轻质CaCO3；其余与实施例2.1相同。普鲁兰多糖最终的产量为：161.1g/L。
3.3发酵培养基为：
195g/L葡萄糖、7.0g/L豆粕水解物、5.5g/L氯化钾、3.6g/L氯化钠、0.2g/L硫酸铵和0.11g/L硫酸镁、16g/L食品级轻质CaCO3；其余与实施例2.1相同。普鲁兰多糖最终的产量为：160.3g/L。
从以上的数据可以看出，将发酵培养基的优化配比进行略微的调整，普鲁兰多糖的产量依然很高，这说明，本发明的菌株及培养基产普鲁兰多糖具有稳定性。
实施例4
发酵罐发酵生产普鲁兰多糖
按实施例2中(1)的方法制备种子培养物，生物反应器配备了一个30L的容器作为发酵罐，其工作容积为20L，将该发酵罐用于普鲁兰多糖的生产。
将1L种子培养物转移到含有200g/L果糖的19L优化的普鲁兰生产培养基中，并在115℃下灭菌30min，发酵在28℃和400rpm下进行，曝气速率为20L/min。每12h收获50mL培养物，并在10000rpm和4℃下离心10min，并测定所获得的上清液中的普鲁兰多糖产量，残留果糖和还原糖。发酵培养基同实施例2中的最优化方案，测得普鲁兰多糖的产量为162g/L。
表4发酵罐发酵产普鲁兰多糖的结果
以上的发酵罐放大培养实验证明，本发明的菌株产普鲁兰多糖具有优异的稳定性。其产量基本上稳定在162g/L左右。
同时，从附图4中可以看出，发酵罐生产的普鲁兰的分子量仅为2.890×105Da，低于摇瓶。细胞在发酵过程中从0到24h快速生长，普鲁兰的分子量也增加，随着细胞的生长，DO从95.5％急剧下降到22.8％。随着发酵的进行，普鲁兰多糖的分子量由于普鲁兰多糖降解酶而逐渐降低，导致DO水平不断升高，这可能增加了从普鲁兰生物合成到细胞生长的碳通量，导致生物量增加，普鲁兰合成减少。在发酵的后期阶段控制溶解氧可能能够维持生物质，以进一步增加普鲁兰的产量和普鲁兰多糖的分子量。培养基中的轻质碳酸钙通过中和细胞生长和普鲁兰多糖生物合成过程中分泌的酸性代谢物来控制普鲁兰的最佳生产环境是非常重要的。当细胞快速生长时，pH值降低，因为生物量达到峰值，pH值逐渐增加到初始值。当普鲁兰多糖快速合成时，pH值从6.57迅速下降到4.64，并在一定范围内波动。从天然蜂蜜中分离出的耐渗透性A.melanogenum TN3-1从140.0g/L葡萄糖中产生110.29g/L普鲁兰，产率为0.79g/g葡萄糖，生产效率为0.84g/L/h(Xue et al.,2019Food Chemistry,286,123-128.)。这些结果表明，本发明的菌株是一种优秀的普鲁兰多糖生产者，具有潜在的普鲁兰多糖工业生产前景。
Claims (8)
1.一种出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans）NCPS2022-M，于2022年08月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M 20221272。
2.出芽短梗霉菌的培养方法，包括以下的步骤：
（1）活化菌种：将权利要求1中所述及的出芽短梗霉菌接种在种子培养基中，并在26~30℃下以200~240rpm的转速孵育20~28小时；
（2）摇瓶发酵培养：将种子培养物转移到含有60~100mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为4~6%，并在26~30℃和200~240rpm的旋转振荡器上培养150~160小时。
3.如权利要求2所述的出芽短梗霉菌的培养方法，（1）中，在28℃下以220rpm的转速孵育24小时。
4.如权利要求2所述的出芽短梗霉菌的培养方法，（2）中，所述的发酵培养基为：190～210g/L葡萄糖、5～9g/L豆粕水解物、4～8g/L氯化钾、2～5g/L氯化钠、0.1～0.3g/L硫酸铵、0.05～0.25g/L硫酸镁和10～20g/L食品级轻质CaCO3，余量为水。
5.如权利要求2所述的出芽短梗霉菌的培养方法，（2）中，所述的发酵培养基为： 200g/L葡萄糖、7.01g/L豆粕水解物、6g/L氯化钾、3.44g/L氯化钠、0.18g/L硫酸铵、0.1g/L硫酸镁和16g/L食品级轻质CaCO3，余量为水。
6.含有普鲁兰多糖的上清液的制备方法，包括以下的步骤：
（1）活化菌种：将权利要求1中所述及的出芽短梗霉菌接种在种子培养基中，并在26~30℃下以200~240rpm的转速孵育20~28小时；
（2）发酵罐培养：在发酵罐中加入培养基，取步骤（1）中的活化的菌种，转移到发酵罐中发酵培养，离心，获得含有普鲁兰多糖的上清液；发酵罐培养所采用的培养基为：190～210g/L葡萄糖、5～9g/L豆粕水解物、4～8g/L氯化钾、2～5g/L氯化钠、0.1～0.3g/L硫酸铵、0.05～0.25g/L硫酸镁和10～20g/L食品级轻质CaCO3，余量为水。
7.如权利要求6所述制备方法，（2）发酵培养时，取1L步骤（1）中的活化的菌种，转移到灭菌后的培养基中，在28℃、400 rpm下进行发酵培养，并且保持曝气速率为20 L/min，144h后取培养物。
8.利用出芽短梗霉菌发酵生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，将经过权利要求7所述方法获得的培养物在10000 rpm和4℃下离心10 min，获得含有普鲁兰多糖的上清液，该上清液通过干燥，获得普鲁兰多糖。
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