JP7319405B2 - 天然型ｎ－アセチルグルコサミンの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明はＮ－アセチルグルコサミンの生産方法に関し、特に、微生物から天然型Ｎ－アセチルグルコサミンを生産する、Ｎ－アセチルグルコサミンの生産方法に関する。
Ｎ－アセチルグルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，ＮＡＧ）は、人体において重要な生理的機能を持つアミノ糖（Ａｍｉｎｏｓｕｇａｒ）の一種であり、人体の細胞の重要な構成要素であるグリコサミノグリカン（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏ－ｇｌｙｃａｎ，ＧＡＧ）、糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、プロテオグリカン（Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）の合成に関与している。
ＮＡＧの生産工程については、現在、主にグルコースやキチンを原料として使用しているが、そのうちキチンが一般的にＮＡＧの製造に使用されている。キチンからＮＡＧを製造する場合、主に３つの方法がある。
第一の方法は化学的方法で、強酸でキチンを高温下で加水分解してグルコサミンを生成した後、酸無水物と前記グルコサミンを作用させ、さらに前述の作用させた反応物をアセチル基と結合させてＮ－アセチルグルコサミンを生産する方法である。しかしながら、化学的方法で製造されたＮＡＧは、化学薬剤残留の問題がある可能性がある。
第二の方法は酵素法であり、キチンエンドヌクレアーゼ、キチンエキソヌクレアーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ等の酵素を通じ、キチンを加水分解してＮＡＧを生産する方法である。酵素法で生産されるＮＡＧは天然型ＮＡＧであり、天然型ＮＡＧは安全性と純度が高く、化学物質の残留がないという利点があるが、酵素法によるＮＡＧの生産は生産コストがより高い。
第三の方法は生体内変換法であり、これは微生物を利用してキチンを分解してＮＡＧとするもので、この方法で生産されるＮＡＧも天然型ＮＡＧであり、生産コストも比較的低い。
しかしながら、生体内変換法を使用してＮＡＧを生産するとき、このプロセスの収率は微生物の生長条件と発酵状況の影響を受ける。例えば、発酵環境で微生物に適量の窒素源を与えることで、微生物が生長し、キチンをＮＡＧに分解することができる。現在、一般的に微生物に使用される窒素源はトリプトンと酵母エキスであるが、ＮＡＧ生産工程において、微生物の収率をさらに高めるために、より良い窒素源の処方を提供することが課題となっている。
本発明の目的は、上述の問題を解決するために、Ｎ－アセチルグルコサミン生産方法を提供することにある。
本発明のＮ－アセチルグルコサミン生産方法は、（ａ）Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株を提供する工程と、（ｂ）Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株を、キチン、リン酸水素二アンモニウム及び酵母エキスを含む液体培地に接種し、当該液体培地中における当該リン酸水素二アンモニウムの濃度が１.９ｍｇ／ｍＬ、当該液体培地中における当該酵母エキスの濃度が１．５ｍｇ／ｍＬとする工程と、（ｃ）３０℃の環境下でＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株を発酵させ、キチンをＮ－アセチルグルコサミンとして分解させる工程と、を含む。
上述の方法の（ｂ）工程において、当該キチンの当該液体培地中における重量百分率濃度は６％である。
上述の方法において、当該液体培地中のキチンはα－キチンである。
上述の方法において、当該α－キチンはエビの殻由来である。
上述の方法において、当該α－キチンはカニの殻由来である。
上述の方法において、当該Ｎ－アセチルグルコサミンの生産方法は、よりよい窒素源の処方を使用することで、天然型Ｎ－アセチルグルコサミンの収率をさらに向上することができる。
本発明の目的、特徴、効果について充分に理解できるように、以下で具体的な実施例に添付の図面を組み合わせ、本発明について詳細に説明する。
〔実施例１〕
実施例１のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
本実施例１において使用する菌株は、Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓである。上述のＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株は、台湾Ｉ３２８０４１号特許を参考とし、中華民国食品工業発展研究所生物資源保存中心（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）より取得したもので、菌種番号はＢＣＲＣ９１０２５６である。
実施例１のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
本実施例１において使用する菌株は、Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓである。上述のＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株は、台湾Ｉ３２８０４１号特許を参考とし、中華民国食品工業発展研究所生物資源保存中心（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）より取得したもので、菌種番号はＢＣＲＣ９１０２５６である。
まず、Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓのコロニーを４００ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃の環境で１６時間発酵培養を行った後、発酵液中から１０ｍｌの接種用菌液（濃度約１.７x１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を５つ取得した。同時に、５つの５００ｍｌ三角フラスコを用意し、各三角フラスコに１００ｍｌの液体ＢＨ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｂｕｓｈｎｅｌｌ－Ｈａａｓ ｂｒｏｔｈ）を入れ、当該ＢＨ培地が重量百分率濃度６％のα－キチン（これは本実施例１において提供するキチンのタイプの例示であり、その他の実施例において、使用者は必要に応じてその他タイプのキチンを使用できる）を含有する。前述の５つの１０ｍｌ接種用菌液をそれぞれ前述の５つの液体ＢＨ培地中に接種し、上述のＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株を接種した５つのＢＨ培地をそれぞれ統制群と実験群１から実験群４とした。統制群の培地には別途窒素源を添加せず、実験群１の培地には最終濃度１.５ｍｇ／ｍｌの酵母エキス（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）を添加、実験群２の培地には最終濃度３ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを添加、実験群３の培地には最終濃度４.５ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを添加、実験群４の培地には最終濃度６ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを添加した。
上述の統制群と実験群の標本を３０℃の環境で９６時間発酵培養し、そのうちのＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株に当該キチンをＮ－アセチルグルコサミンに分解させる。上述の統制群と実験群の標本を９６時間培養した後、統制群と実験群の標本を遠心分離し（遠心分離の回転速度は１００００ｒｐｍ、遠心分離時間は１０分間）、遠心分離が完了した統制群と実験群の標本中の上清液を取り、屈折計（ＡＴＡＧＯ）で統制群と実験群標本の上清液の屈折度（Ｂｒｉｘ％）を測定（即ち、上清液中に溶解したＮ－アセチルグルコサミンの総濃度百分率）し、Ｎ－アセチルグルコサミンの濃度に換算する。
実験結果を下表１に示す。結果によると、培地中に酵母エキスを添加することでＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株が生産するＮＡＧの収率を向上でき、かつＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株の収率向上程度は酵母エキスの添加濃度の増加に伴い上昇することが分かる。上述の実験結果から、微生物に適量の窒素源を与えることで、微生物がキチンをＮＡＧに分解する効率を高められることが実証された。
〔実施例２〕
実施例２のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
本実施例２のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法の流れは、実施例１とほぼ同じであり、本実施例２の統制群の培地成分も実施例１と同じであるが、唯一の違いは本実施例２の実験群１から実験群４で添加される窒素源の種類が実施例１と異なる点にある。本実施例２における実験群１から実験群４の窒素源の種類及び濃度を下表２に示す。
実施例２のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
本実施例２のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法の流れは、実施例１とほぼ同じであり、本実施例２の統制群の培地成分も実施例１と同じであるが、唯一の違いは本実施例２の実験群１から実験群４で添加される窒素源の種類が実施例１と異なる点にある。本実施例２における実験群１から実験群４の窒素源の種類及び濃度を下表２に示す。
実験結果を下表３に示す。結果によると、培地中にトリプトンと酵母エキスを添加することでＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株が生産するＮＡＧの収率を向上でき、かつＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株の収率向上程度はトリプトンと酵母エキスの添加濃度の増加に伴い上昇することが分かる。かつ、本実施例２の実験結果と実施例１の実験結果を比較すると、培地中の一部の酵母エキスをトリプトンで置換することで、Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株の収率向上程度がより高まることが分かる。上述の実験結果は、異なる種類の窒素源による微生物のＮＡＧ生産効率の向上程度が異なることを証明している。特に、トリプトンを窒素源として加えたときの効果は単に酵母エキスを窒素源としたときの効果よりも高い。
〔実施例３〕
実施例３のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
本実施例３のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法の流れは、実施例２とほぼ同じであり、本実施例３の統制群の培地成分も実施例２と同じであるが、唯一の違いは本実施例３の実験群１から実験群４で添加される窒素源の種類が実施例２と異なる点にある。本実施例３における実験群１から実験群４の窒素源の種類及び濃度を下表４に示す。
実施例３のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
本実施例３のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法の流れは、実施例２とほぼ同じであり、本実施例３の統制群の培地成分も実施例２と同じであるが、唯一の違いは本実施例３の実験群１から実験群４で添加される窒素源の種類が実施例２と異なる点にある。本実施例３における実験群１から実験群４の窒素源の種類及び濃度を下表４に示す。
実験結果を下表５に示す。結果によると、培地中に無機窒素源と酵母エキスを添加することでＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株が生産するＮＡＧの収率を向上でき、かつ本実施例３の実験結果（実験群１、１.９ｍｇ／ｍｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４と１.５ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを含有）と、実施例２の実験結果（実験群３、３.０ｍｇ／ｍｌのトリプトンと１.５ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを含有）と比較すると、培地中のトリプトンをリン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）で置換することで、Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株の収率向上程度がより高いことが分かる。このほか、本実施例３の実験結果から、４種類の無機炭素源の中で、リン酸水素二アンモニウムは比較的良い無機窒素源の由来であることも分かる。
〔実施例４〕
実施例４のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
まず、１６０グラムのα－キチン粉末を準備し、上述のキチン粉末を２リットルのＢＨ培地に入れて均一に混合する。当該ＢＨ培地中にさらに最終濃度１.９ｍｇ／ｍｌのリン酸水素二アンモニウムと１.５ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを添加する。上述のキチン粉末とＢＨ培地の培地混合物を５リットルの発酵槽に入れ、汎用の高圧滅菌器で滅菌を行う。
実施例４のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
まず、１６０グラムのα－キチン粉末を準備し、上述のキチン粉末を２リットルのＢＨ培地に入れて均一に混合する。当該ＢＨ培地中にさらに最終濃度１.９ｍｇ／ｍｌのリン酸水素二アンモニウムと１.５ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを添加する。上述のキチン粉末とＢＨ培地の培地混合物を５リットルの発酵槽に入れ、汎用の高圧滅菌器で滅菌を行う。
その後、実施例１の接種用菌液の作製方法で接種用菌液を作製する。１００ｍｌのＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ接種用菌液を上述の培地混合物に接種し、回転速度２００ｒｐｍ、温度３０℃、通気量２Ｌ／ｍｉｎの条件で発酵を行い、発酵時間は１６５時間で、５時間ごとに発酵液中から発酵液標本を取り、実施例１の方法で、発酵液標本から上清液を取得して、上清液の屈折度を測定した。各時間点で測定された上清液のＮＡＧ濃度のうち最高値は６５ｍｇ／ｍｌに達することができ、ＮＡＧ収率に換算すると８１.３％（ＮＡＧ収率＝ＮＡＧ生産量／キチン添加量x１００％）に達することができる。
〔実施例５〕
実施例５のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
まず、実施例１の方法で５つの１０ｍｌの接種用菌液を作製する。同時に５つの５００ｍｌの三角フラスコ及び５つの実験群液体培地を準備する。上述の５つの実験群液体培地はＢＨ培地を基礎培地とし、異なる由来のα－キチンを加えた（培地中の重量百分率濃度６％）、リン酸水素二アンモニウム（培地中の最終濃度１.９ｍｇ／ｍｌ）、酵母エキス（培地中の最終濃度１.５ｍｇ／ｍｌ）。上述の５つの実験群液体培地をそれぞれ実験群１から実験群５とする。
実施例５のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法
まず、実施例１の方法で５つの１０ｍｌの接種用菌液を作製する。同時に５つの５００ｍｌの三角フラスコ及び５つの実験群液体培地を準備する。上述の５つの実験群液体培地はＢＨ培地を基礎培地とし、異なる由来のα－キチンを加えた（培地中の重量百分率濃度６％）、リン酸水素二アンモニウム（培地中の最終濃度１.９ｍｇ／ｍｌ）、酵母エキス（培地中の最終濃度１.５ｍｇ／ｍｌ）。上述の５つの実験群液体培地をそれぞれ実験群１から実験群５とする。
その後、実施例１の方法で５つの１０ｍｌの接種用菌液を作製する。同時に、５つの５００ｍｌの三角フラスコと５つの統制群液体培地を準備する。上述の５つの統制群液体培地はＢＨ培地を基礎培地とし、異なる由来のα－キチン（培地中の重量百分率濃度６％）を加えるが、窒素源は加えない。上述の５つの実験群液体培地をそれぞれ統制群１から統制群５とする。
そのうち、実験群１と統制群１に同じα－キチン由来を使用し、実験群２と統制群２に同じα－キチン由来を使用、実験群３と統制群３に同じα－キチン由来を使用、実験群４と統制群４に同じα－キチン由来を使用、実験群５と統制群５に同じα－キチン由来を使用している。下表６において、実験群１と統制群１をグループ１、実験群２と統制群２をグループ２、実験群３と統制群３をグループ３、実験群４と統制群４をグループ４、実験群５と統制群５をグループ５と呼ぶ。
グループ１からグループ５のα－キチン由来は下表６に示すとおりである。
続いて、前述の５つの１０ｍｌの接種用菌液を実験群１から実験群５の液体ＢＨ培地にそれぞれ接種した。実験群１から実験群５の標本は３０℃の環境で２００ｒｐｍの回転速度により７２時間振とう培養し、そのうちのＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株に当該キチンをＮ－アセチルグルコサミンに分解させた。上述の実験群の標本は７２時間の発酵培養後、実施例１の方法により、実験群１から実験群５の標本から上清液を取得して、上清液のＮＡＧ屈折度を測定した。
同時に、前述の５つの１０ｍｌの接種用菌液を統制群１から統制群５の液体ＬＢ培地にそれぞれ接種し、上述の実験群１から実験群５の発酵操作の流れと同じように発酵操作を行い、統制群１から統制群５の上清液のＮＡＧ屈折度を測定した。
実験結果を図１に示す。図１の黒いストリップはグループ中の実験群を表し、白いストリップはグループ中の統制群を表す。グループ１からグループ５において、実験群はいずれも最終濃度１.９ｍｇ／ｍｌのリン酸水素二アンモニウムと、最終濃度１.５ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを窒素源として添加しており、各実験群は対応する対照群（同じα－キチン由来を使用しているが、上述の窒素源を添加していないもの）と比較したとき、各実験群のＮＡＧ収率がいずれも向上されていた。上述の実験結果から分かるように、どのα－キチン由来を原料として使用しても、培地中に上述の窒素源の処方を添加すれば、微生物を利用してＮ－アセチルグルコサミンを生産する生産方法のＮＡＧ収率を向上させることができる。かつ、上述の実験結果から分かるように、異なる由来のエビの殻またはカニの殻等の廃棄バイオマス材料をキチンとして使用しても、培地中に上述の窒素源の処方が含有されていれば、Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株はいずれもＮＡＧを効果的に生産することができ、多様なキチン由来の選択が可能で、ＮＡＧの生産コスト削減にさらに役立つ。
上述のように、上述のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法によれば、当該生産方法はより優れた窒素源の処方、即ち１.９ｍｇ／ｍｌのリン酸水素二アンモニウムと１.５ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを提供することで、単純にＢＨ培地を使用した従来のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法と比較して、上述のより優れた窒素源の処方を添加したＮ－アセチルグルコサミンの生産方法は天然型Ｎ－アセチルグルコサミンの収率をさらに向上することができる。
本発明は上述で最良の実施例を開示したが、当業者であれば理解できるように、この実施例は単に本発明を説明するために用いたのみであり、本発明の範囲を限定すると理解されるべきではない。注意すべきは、この実施例と同等効果を有する変化および置換はすべて、本発明の範疇内に含まれることである。このため、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲の定義に準じる。
Claims (8)
- Ｎ－アセチルグルコサミンの生産方法であって、
（ａ）Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株を提供する工程と、
（ｂ）Ｃｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株を、キチン、リン酸水素二アンモニウム及び酵母エキスを含む液体培地に接種し、当該液体培地中における当該リン酸水素二アンモニウムの濃度が１.９ ｍｇ／ｍＬ、当該液体培地中における当該酵母エキスの濃度が１．５ｍｇ／ｍＬとする工程と、
（ｃ）３０℃の環境下でＣｈｉｔｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔａｉｎａｎｅｎｓｉｓ菌株を発酵させ、当該キチンをＮ－アセチルグルコサミンとして分解させる工程と、
を含む、ことを特徴とする、Ｎ－アセチルグルコサミンの生産方法。 - 前記（ｂ）工程において、前記キチンの前記液体培地中における重量百分率濃度が６％である、ことを特徴とする、請求項１に記載のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法。
- 前記液体培地中のキチンがα－キチンである、ことを特徴とする、請求項２に記載のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法。
- 前記α－キチンがエビの殻由来である、ことを特徴とする、請求項３に記載のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法。
- 前記α－キチンがカニの殻由来である、ことを特徴とする、請求項３に記載のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法。
- 前記（ｂ）工程において、前記液体培地中のキチンがα－キチンである、ことを特徴とする、請求項１に記載のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法。
- 前記α－キチンがエビの殻由来である、ことを特徴とする、請求項６に記載のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法。
- 前記α－キチンがカニの殻由来である、ことを特徴とする、請求項６に記載のＮ－アセチルグルコサミンの生産方法。
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