CN115975857A

CN115975857A - 一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基及其应用

Info

Publication number: CN115975857A
Application number: CN202211275909.9A
Authority: CN
Inventors: 王钦庆; 李清心; 吴金川
Original assignee: Institute of Biological and Medical Engineering of Guangdong Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biological and Medical Engineering of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2022-10-18
Filing date: 2022-10-18
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明公开了一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基及其应用。培养基组成包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙与废弃羽毛，余量为水，pH 7～12。经固、液态培养证实了该培养基适用于细菌(芽孢杆菌)和真菌(酵母菌)降解废弃羽毛的筛选及降解废弃羽毛。该培养基具有广谱性、通用性、可直接降解完整的羽毛、减少对发酵设备的损害，且其制备及降解羽毛过程简单、成本低，利于推广应用。本发明能够推进废弃羽毛的规模化生物转化与多功能资源化应用进程，提升其经济价值，促进畜禽养殖业绿色循环高质量发展。

Description

一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基及其应用

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及了一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基及其应用。

背景技术：

废弃羽毛是畜禽养殖业的主要副产物之一，养殖业的集约化和规模化发展使我国废弃羽毛的年总产量达到数百万吨。羽毛主要含有角蛋白(～90％)与锌、铁等微量元素，是一种廉价的高蛋白质资源。羽毛降解后可形成多种氨基酸与寡肽、多肽等活性肽及多种官能团，在饲料、肥料、化妆品及医用材料等领域具有广阔的应用前景。

在资源化综合利用与绿色循环发展的理念下，目前研究者对废弃羽毛处理的重点已从传统的填埋、物理和化学处理转移到利用微生物法降解上来。研究发现，很多微生物被证实具有降解羽毛的功能，包括细菌、真菌、霉菌，其中芽孢杆菌最受关注。羽毛中的二硫键因高度交联形成致密、坚实的结构，导致微生物降解羽毛的周期较长，多数在5天以上。这也制约了废弃羽毛的多功能高值化利用。当前以采用微生物降解经膨化废弃羽毛形成的羽毛粉的研究较多，而直接高效降解废弃羽毛的微生物仍亟需挖掘和研究。

降解羽毛的培养基组成(如微量元素)对微生物生长与筛选及其降解废弃羽毛的效果具有重要影响。目前，降解羽毛的微生物之间的培养基组成均有差异，这可能与菌株特异性有关。但这也不便于降解羽毛微生物的筛选与降解羽毛，缺乏具有降解羽毛功能的广谱性培养基。相关的报道指出微生物降解废弃羽毛的绝大多数培养基含有氯化钠，部分培养基含有价格昂贵的蛋白胨与酵母粉。氯化钠虽然能维持细胞渗透压和细胞体积稳态，但它对发酵设备具有一定的腐蚀作用，限制了规模化应用。因此，选择不含有氯化钠且适用于降解羽毛的广谱性培养基可加快降解羽毛微生物的筛选，促进废弃羽毛的高效降解与多功能资源化应用，助力畜禽养殖业绿色循环发展。

发明内容：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基及其应用。本发明涉及的培养基适用于芽孢杆菌与酵母菌高效快速降解废弃羽毛，同样适用于筛选具有降解羽毛功能的微生物，对丰富降解羽毛的种质资源与加快废弃羽毛规模化转化为高附加值产品具有直接地推动作用，助力实施废弃羽毛的绿色转化。

本发明经固、液态培养证实了该培养基适用于细菌(芽孢杆菌)和真菌(酵母菌)降解废弃羽毛的筛选及降解废弃羽毛。该培养基具有广谱性、通用性、可直接降解完整的羽毛、减少对发酵设备的损害，且其制备及降解羽毛过程简单、成本低，利于推广应用。本发明具有推进废弃羽毛的规模化生物转化与多功能资源化应用进程的潜力，提升其经济价值，促进畜禽养殖业绿色循环高质量发展。

为实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基，包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙与废弃羽毛，余量为水，pH 7～12。

优选，按质量分数计，包括磷酸氢二钾0.01～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.1％、硫酸镁0.002～0.01％、氯化钙0.005～0.05％、废弃羽毛1％，余量为水，pH 7～10。

优选，所述的广谱性培养基还可以是平板培养基，是在上述广谱性培养基中另添加质量分数1.5％琼脂糖，经高温灭菌处理后平倒在培养皿中，冷却，即为平板培养基。

本发明的第二个目的是提供适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基的制备方法，是按照广谱性培养基的组分及含量混合均匀，在115～121℃条件下高温灭菌处理15～30分钟，即得广谱性培养基。

本发明的第三个目的是提供上述广谱性培养基用于降解羽毛微生物的筛选或微生物降解废弃羽毛中的应用。

所述的微生物是细菌或真菌。

优选，是上述广谱性培养基在用于芽孢杆菌或酵母菌降解废弃羽毛中的应用。

优选，所述的芽孢杆菌包括蜡样芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。

优选，所述的酵母菌包括异常威克汉姆酵母。

本发明的第三个目的是提供一种降解羽毛微生物的筛选方法或废弃羽毛降解方法，是将微生物接种到上述广谱性培养基中进行培养。

优选，所述的降解羽毛微生物的筛选方法是将培养环境样品的菌液或稀释液、或者少量的已知菌液划线或者涂布于平板培养基，置于恒温培养箱中培养1～2天；其中，细菌置于30～40℃培养1～2天，真菌置于25～30℃培养2天左右，观察菌落生长情况。

优选，所述的降解羽毛微生物的筛选方法或废弃羽毛降解方法还可以是将经过LB培养基或马铃薯葡萄糖培养基培养处于对数生长期的微生物种子液按照体积比2～8％的接种量接种至广谱性培养基中，在150～250rpm与30～40℃条件下培养1～4天，检测降解液中生物量(OD₆₀₀)、可溶性蛋白含量(BCA法)与羽毛降解率(差重法)，对羽毛进行降解或筛选降解羽毛微生物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明便于筛选出具有降解废弃羽毛功能的微生物。

2、该广谱性培养基可直接用于降解羽毛，羽毛无需粉碎和膨化处理，制备简单，成本低，利于推广应用。

3、该广谱性培养基适用于细菌和真菌，具有通用性，无需特异性配制。

4、该广谱性培养基不含氯化钠，可减少对发酵设备的损害，促进废弃羽毛的规模化生物转化与高值化利用。

Bacillus subtilis HC2，其于2022年5月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏号GDMCCNo：62466。

附图说明:

图1是蜡样芽孢杆菌在广谱性培养基中生长与降解废弃羽毛的情况；

图2是枯草芽孢杆菌在广谱性培养基中生长与降解废弃羽毛的情况；

图3是异常威克汉姆酵母菌在广谱性培养基中生长与降解废弃羽毛的情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例进一步解释本发明，但不对本发明构成任何限定。以下实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

实施例1蜡样芽孢杆菌利用广谱性培养基生长与降解废弃羽毛

一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基，其制备方法为按质量分数计，将0.05％磷酸氢二钾、0.03％磷酸二氢钾、0.004％硫酸镁、0.01％氯化钙，余量为水，与1％废弃鸡羽毛混合均匀，pH调至8.5；经121℃高温灭菌20分钟，得到液态培养基。在上述配方基础上添加1.5％琼脂再进行灭菌，即为平板培养基。平板培养与液态培养的对照组均只含有水与废弃鸡羽毛，其它条件与实验组相同。

将蜡样芽孢杆菌BC5转至液态LB培养基，在150rpm与37℃条件下培养16h左右，制得BC5种子液。

使用接种环挑取BC5菌液，在平板培养基上划线，在37℃静置培养40h，观察菌落生长情况。

进一步，将BC5种子液以体积比5％的接种量转接至液态培养基，在160rpm与37℃条件下培养24h，检测BC5菌对鸡羽毛的降解效果。

结果发现，蜡样芽孢杆菌在本发明的平板培养基中培养40h时生长良好，菌落布满平板，相比对照组(仅有少量菌落形成)差异显著(图1A)，表明该平板培养基促进了蜡样芽孢杆菌以废弃鸡羽毛为底物进行生长。如图1B所示，蜡样芽孢杆菌在本发明的液态培养基中培养24h时大多数羽纤维已被降解为细小纤维或溶于培养基中，只有少数羽轴存在，羽毛已从完全不溶于水的状态转化为绝大数可溶的红褐色状态；而对照组中仍可见明显的完整鸡羽毛。进一步，对两种培养基中鸡羽毛的降解情况进行检测，发现本发明的液态培养基中生物量OD₆₀₀(1.45)、可溶性蛋白含量(0.96g/L)及羽毛降解效率(40％左右)均显著高于对照组(图1C，每组柱形图中从左至右分别为OD₆₀₀、可溶性蛋白含量和降解率)。这些差异表明该液态培养基能够满足蜡样芽孢杆菌生长及实现对废弃羽毛的降解。

因此，本发明的培养基适用于蜡样芽孢杆菌降解废弃鸡羽毛。

实施例2枯草芽孢杆菌利用广谱性培养基生长与降解废弃羽毛

一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基，其制备方法为按质量分数计，将0.1％磷酸氢二钾、0.01％磷酸二氢钾、0.002％硫酸镁、0.005％氯化钙，余量为水，与1％废弃鸡毛混合均匀，pH调至7.0；经121℃高温灭菌20分钟，得到液态培养基。在上述配方基础上添加1.5％琼脂再进行灭菌，即为平板培养基。平板培养与液态培养的对照组均只含有水与废弃鸡毛，其它条件与实验组相同。

将枯草芽孢杆菌HC2转至液态LB培养基，在160rpm与37℃条件下培养16h左右，制得HC2种子液。

使用接种环挑取HC2菌液，在平板培养基上划线，在37℃静置培养40h，观察菌落生长情况。

进一步，将HC2种子液以体积比5％的接种量转接至液态培养基，在250rpm与37℃条件下培养24～88h，检测HC2菌对鸡毛的降解效果。

结果发现，枯草芽孢杆菌在本发明的平板培养基中生长良好，培养40h时在划线处布满菌落，而对照组虽有菌生长但明显少于对照组(图2A)，表明该平板培养基能促进枯草芽孢杆菌以废弃鸡毛为底物生长。从图2B中发现，枯草芽孢杆菌在本发明的液态培养基中培养24h时仍存在少量羽毛，但多数羽纤维已明显被降解；此时对照组中仅少数鸡羽毛被降解，大部分仍完整存在。当继续培养至88h时，实验组(P-88h)的鸡毛在外观上已基本降解完全，仅有3根羽轴存在，而对照组仍存在明显的完整鸡毛。进一步检测，发现实验组中羽毛降解的相关参数在相同时间时显著高于对照组，且在88h时实验组中的OD₆₀₀为7.6、可溶性蛋白含量达到5.44g/L左右、羽毛降解率在58％左右(图2C)。结果表明该液态培养基能够满足枯草芽孢杆菌生长及实现对废弃鸡羽毛的降解。

因此，本发明的培养基适用于枯草芽孢杆菌降解废弃鸡羽毛。

实施例3异常威克汉姆酵母菌利用广谱性培养基生长与降解废弃羽毛

一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基，其制备方法为按质量分数计，将0.01％磷酸氢二钾、0.1％磷酸二氢钾、0.01％硫酸镁、0.05％氯化钙，余量为水，与1％废弃鸡羽毛混合均匀，pH调至10；经121℃高温灭菌20分钟，得到液态培养基。液态培养的对照组只含有水与废弃鸡毛，其它条件与实验组相同。

将异常威克汉姆酵母菌N1转至马铃薯葡萄糖培养基，在180rpm与30℃条件下培养36h左右，制得N1种子液。

将N1种子液以体积比5％的接种量转接至液态培养基，在180rpm与30℃条件下培养24～50h，检测N1菌对鸡毛的降解效果。

结果发现，如图3A所示，异常威克汉姆酵母菌N1在本发明的液态培养基中培养24h时鸡羽毛纤维已明显被降解，对照组中的大部分鸡羽毛仍完整存在，无明显降解。当继续培养至50h时，实验组(P-50h)中的鸡羽毛较24时获得进一步降解，而对照组(对照-50h)与24h时相比则无显著变化(图3B)。经检测发现，在相同时间时实验组的生物量、可溶性蛋白含量及降解率均显著高于对照组；在50h时，实验组、对照组的生物量与24h时的对应组相比无显著差异，而实验组(P-50h)的可溶性蛋白含量(3.8g/L)、羽毛降解率(～54％)则显著高于对照组(对照-50h)(图3C)。这些结果也表明本发明的培养基能够满足异常威克汉姆酵母菌生长并实现对废弃鸡羽毛的降解。

因此，本发明的培养基适用于异常威克汉姆酵母菌降解废弃鸡羽毛。

综上实施例1、2、3所述，本发明的培养基具有广谱性，适用于细菌(芽孢杆菌)和酵母菌降解废弃羽毛。该广谱性培养基的配方与制备简单，直接用于羽毛降解的应用效果显著；且不含氯化钠，可避免其对发酵罐的损害，利于规模化推广。本发明的广谱性培养基可加快废弃羽毛降解微生物的筛选进程、丰富降解羽毛的种质资源库，同时能高效降解废弃羽毛，推动废弃羽毛的产业化综合利用，实现变废为宝。

以上所述的实施例仅为本发明的示范性例证，本发明的保护范围不限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到配方的简单变化或组合变化、技术方案的简单变化或等效替换均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基，其特征在于，包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙与废弃羽毛，余量为水，pH 7～12。

2.根据权利要求1所述的广谱性培养基，其特征在于，按质量分数计，包括磷酸氢二钾0.01～0.1％、磷酸二氢钾0.01～0.1％、硫酸镁0.002～0.01％、氯化钙0.005～0.05％、废弃羽毛1％，余量为水，pH 7～10。

3.根据权利要求1所述的广谱性培养基，其特征在于，所述的广谱性培养基是平板培养基，是在广谱性培养基中另添加质量分数1.5％琼脂糖，经高温灭菌处理后平倒在培养皿中，冷却，即为平板培养基。

4.一种权利要求1、2或3所述的适用于废弃羽毛降解的广谱性培养基的制备方法，其特征在于，是按照广谱性培养基的组分及含量混合均匀，在115～121℃条件下高温灭菌处理15～30分钟，即得广谱性培养基。

5.权利要求1、2或3所述的广谱性培养基用于降解羽毛微生物的筛选或微生物降解废弃羽毛中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的微生物是细菌或真菌。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是广谱性培养基在用于芽孢杆菌或酵母菌降解废弃羽毛中的应用；所述的芽孢杆菌包括蜡样芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；所述的酵母菌包括异常威克汉姆酵母。

8.一种降解羽毛微生物的筛选方法或废弃羽毛降解方法，其特征在于，是将微生物接种到权利要求1、2或3所述的广谱性培养基中进行培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的降解羽毛微生物的筛选方法是将培养环境样品的菌液或稀释液、或者少量的已知菌液划线或者涂布于平板培养基，置于恒温培养箱中培养1～2天；其中，细菌置于30～40℃培养1～2天，真菌置于25～30℃培养2天左右，观察菌落生长情况。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的降解羽毛微生物的筛选方法或废弃羽毛降解方法是将经过LB培养基或马铃薯葡萄糖培养基培养处于对数生长期的微生物种子液按照体积比2～8％的接种量接种至广谱性培养基中，在150～250rpm与30～40℃条件下培养1～4天，检测降解液中生物量、可溶性蛋白含量与羽毛降解率，对羽毛进行降解或筛选降解羽毛微生物。