JP4876247B2 - ペニシリウム属に属する新規微生物 - Google Patents

Description

本発明はミカン果皮分解能を有するペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属）に属する新規微生物に関する。また、本発明はその微生物を用いる柑橘類廃棄物の減量方法に関する。さらに、本発明は、その微生物の培養液からペクチナーゼ及び／又はセルラーゼを製造する方法に関する。

日本における２００３年度のミカンの生産量は１，１４７千トンに達する（２００５年の経済産業省の報告）。生産されたミカンの一部は家庭内で消費されるが、その多くは工場に移送され、ミカン果実を利用した各種製品が製造されることになる。それら工場では、前記各種製品の製造に伴う多量の果皮、さのう、圧搾滓等のミカン廃棄物の処理が大きな問題となる。
この廃棄物の一般的な処理は焼却又は埋立による。前者の場合、重油などの燃料の消費などのコストがかかり、しかも環境の悪化を招きやすく、後者の場合、埋立用地を確保しにくい等の問題がある。従って、廃棄物処理量が少なくなれば、それだけ有利であり、廃棄物の減量が求められているところである。
また、前記ミカン以外に、例えば、オレンジ、グレープフルーツ、レモン、八朔、すだち、ざぼん、柚子、かぼすなどの柑橘類を用いて工場で果汁飲料や缶詰等の各種製品を製造することができるが、その際にも上記と同じ問題が生じる。すなわち、柑橘類を用いる各種製品の製造に際し、果皮、圧搾滓等の廃棄物の処理が大きな問題となる。また、柑橘類を一定の基準で選果する際に、基準から外れた不良品が廃棄物となり、この処理も大きな問題である。

柑橘類廃棄物には多量の皮繊維質が存在するが、これらの有効利用法については実用化された例はまだない。特にミカン皮繊維質はセルロースおよびペクチン等から構成されているが、これらの有効利用法についても実用化された例はまだなく、各分野の研究者が実用化を目指した研究を継続している現状にある。
従来からの柑橘類廃棄物の処理の研究手法として、物理化学的な手法、及び、生物学的な手法を挙げることができる。
前記物理化学的な手法の研究例としては、例えば、硫酸溶液に浸したミカン果皮を加圧・加熱して加水分解する技術があり、ミカン果皮の分解によって生じる単糖類や少糖類をアルコール発酵の原料に用いることが目標である（非特許文献１）。この技術は（１）硫酸を用いる点、（２）高圧および高熱をかける点、（３）加熱に伴うメイラード反応で繊維質の一部が変性する点、（４）反応後にアルカリで中和する必要がある点、（５）そのアルカリも劇毒物であり、取扱いに慎重を要する点、（６）事故発生時には、酸・アルカリの漏洩による環境汚染の懸念がある点等の、問題点があり、実用化までには多くの解決しなければならない課題が残されている。
また、柑橘類廃棄物を炭化させ、その炭化物からセメント用混和剤を得る技術が報告されている（特許文献１）。

一方、生物学的な手法を用いる研究は、前記物理化学的な方法を用いる研究に較べて時間がかかる点で不利であるがあるが、高圧・高熱といった危険プロセスがなく、劇物も扱わないことから、環境に対して非常に優しい技術であり、極めて好ましい手法である。しかし、具体的に報告された研究例は数が少なく、例えば、柑橘類廃棄物を発酵処理し、有機肥料化する技術が知られている（特許文献２、特許文献３）。前者の技術は自然界に存在する微生物を利用するので、環境に対して非常に優しい技術であるといえるが、肥料を得るために極めて長い時間を必要とし、しかも、複雑な処理操作を必要とする不都合さがある。その点、後者の技術は、ミカン用酵母という特定の微生物を用いることにより、廃棄ミカンやミカンジュース製造残渣から有機質肥料を製造することができたのであるが、この技術は、廃棄ミカンやミカンジュース製造残渣を用いるに止まり、ミカン果皮を含めた柑橘類廃棄物を処理する技術ではない。
例えば柑橘類の果皮、特にミカン果皮には各種セルロースと各種ペクチンが共存しており、ミカン果皮の分解は従来の技術を単に用いれば解決されるというような単純ものではなく、今までに実用的な技術に関する報告はない。

なお、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属）に属する微生物は抗生物質ペニシリンやカビチーズでも知られる有名な糸状菌であり、その糸状菌に関する研究の歴史も古いし、数十種にも及ぶ種（ｓｐｅｃｉｅｓ）がこれまでに見つかっている。これらの中にはセルラーゼあるいはペクチナーゼといった酵素を生産するものも知られている。しかし、セルラーゼおよびペクチナーゼの両方を生産しており、両酵素を同時に生産するペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属）に属する微生物はこれまで報告されていなかった。つまり、従来の菌株で柑橘類果皮からの酵素生産・廃棄物減量を行う場合、セルラーゼ生産菌とペクチナーゼ生産菌の両者を準備することが好ましいのであるが、両微生物の生育に適した培養条件を検討する必要があり、その適する培養条件が見つからないときには、それら微生物の培養自体を諦めざるを得ない場合がある等の困難な点がある。

特開平１０−２８７５４５号公報 特開２００２−９６０４８号公報 特開２００５−２３９４８９号公報 Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５４，１２９−１４１．

したがって、本発明の課題は、柑橘類果皮、さのう、圧搾滓等の柑橘類廃棄物を効率良く分解することを可能とし、その廃棄物を減量する新規な方法を提供するものである。また、その微生物の培養液からペクチナーゼ及び／又はセルラーゼを製造する方法を提供するものである。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、セルラーゼ活性およびペクチナーゼ活性を同時に併せ持ち、前記柑橘類廃棄物を構成するミカン果皮を栄養源として増殖でき、ミカン果皮を分解することができる新規な微生物を、部分的に腐熟したミカンの腐熟ミカン果皮表面から見出した。しかも、その微生物の培養液からペクチナーゼ及び／又はセルラーゼを製造することができるという知見を得た。それらの知見に基づき更に研究を重ね、遂に本発明を完成した。

すなわち、本発明により提供される微生物は、分子生物学的手法、すなわちリポソームDNA(以下、ｒＤＮＡと記載することがある)の塩基配列を常法により解析した結果、および形態観察や生理学的性状等からペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属）に属する新規な微生物であり、セルラーゼ活性およびペクチナーゼ活性を同時に併せ持つことが判明した。そこでこの新規微生物をＯＰ１と命名し、平成１７年１１月１１日に独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部に寄託した。寄託番号はＮＢＲＣ１０１３００である。
また、前記新規微生物を培養し、ついで培養した微生物を用いて柑橘類廃棄物を処理すると、柑橘類廃棄物を分解し、廃棄物の減量化に有効であることが判明した。さらに、その微生物の培養液からペクチナーゼ及び／又はセルラーゼを製造することができる。

本発明の新規微生物は、有機物を含む培地であって、ペニシリウム属に属する微生物を培養することができる培地であれば、どのような培地を用いて培養することもできる。具体的には、イーストナイトロジェン培地（ＹＮＢ培地）、柑橘類破砕物含有ＹＮＢ培地、麦芽エキス培地などを例示できる。また、本発明の新規微生物は、前記柑橘類廃棄物を栄養源として増殖することができるので、その廃棄物も培地ということができる。
この新規微生物を培養する条件は、用いる培地の種類や量などにより変動するので、一概に規定することができないが。例えば、２０〜３５
℃にて好気的な条件下、数日〜４週間程度とすることができる。

本発明の新規微生物を用いて前記柑橘類廃棄物を減量処理する方法は、柑橘類廃棄物を減量処理することができる方法であれば特に制限されない。例えば、柑橘類廃棄物をそのまま集めて減量処理してもよいし、加湿処理などの前処理を施した後に減量処理してもよい。
柑橘類廃棄物に本発明の新規微生物を適用する方法も特に制限されない。前記微生物の培養槽内に廃棄物を投入し、所定温度で攪拌処理する方法、あるいは廃棄物を収容した容器に前記微生物を適用し、所定温度、所定湿度に管理する方法などが挙げられるが、それらの方法に限定されない。ここで、所定温度は柑橘類廃棄物の内容や量、希望する減量の程度などにより変動するのであり、一概に規定することができないが、例えば、前記培養槽や容器の温度を２０〜３５℃とすることができる。また、所定湿度も同様であって、一概に規定することができないが、例えば、前記容器内の湿度を３０〜７０％とすることができる。

本発明の新規微生物の培養液からペクチナーゼ及び／又はセルラーゼを製造する方法は、常法を適用すればよいのであって、特に制限されない。例えば、微生物の培養液をろ過処理して固形分を取り除き、クロマトグラフィー法により、ペクチナーゼ及び／又はセルラーゼを単離し、粗酵素、あるいは精製した酵素を調製することができる。ここで、ペクチナーゼ及び／又はセルラーゼとは、ペクチナーゼ又はセルラーゼ単独、あるいはペクチナーゼ及びセルラーゼの混合物をいう。
さらに、本発明では、新規微生物そのものを粗ペクチナーゼ及び／又はセルラーゼとしてもよい。

かくして製造したペクチナーゼ及び／又はセルラーゼは、例えば繊維質材料処理剤、飼料用添加剤、柑橘類廃棄物処理剤などとして有用であるが、これらになんら限定されない。

本発明により、新規微生物が提供される。この微生物は、ミカン果皮などの柑橘類廃棄物を分解し、減量することができる。従って、従来から行われている焼却や埋立による廃棄物処理量を減量させることが可能である。
さらには、この微生物の培養物からペクチナーゼ及び／又はセルラーゼを製造することができる。特に、セルラーゼおよびペクチナーゼの両酵素は繊維質の分解に有効である。

以下、本発明を実施例に基づき、具体的に説明する。なお、本発明はこれら実施例に基づく説明によって何ら制限されるものではない。

微生物の選別・培養
（培地の調製）
本発明のＹＮＢ培地はＮ−源としての（ＮＨ４）２ＳＯ４の他、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、微量の金属、ごく微量のビタミンを含む。
ミカン果皮をジューサーにて破砕し、大きさが約２ｍｍのミカン果皮破砕物を得た。その破砕物１ｇを前記ＹＮＢ培地３０ｍＬに配合し、加熱滅菌し（ＭＰ−ＹＮＢ培地）、本発明の微生物培地を調製した。
（微生物の選別）
箱に詰め込んだミカンの中から、ミカン同士の接触表面が一部茶色に変色して軟らかくなり、カビが肉眼上は確認できない腐熟ミカン果皮サンプル（５ｍｍ×５ｍｍ）を前記滅菌したＭＰ−ＹＮＢ培地１０ｍLに懸濁し、その懸濁液１００μLを３０ｍLの前記滅菌したＭＰ−ＹＮＢ培地に接種し、１５０ｒｐｍ、２０℃で培養した。
上記培養液５０μLを、１．５％の寒天で固形化したＭＰ−ＹＮＢ培地上に接種し、３０℃で、数個のコロニーが精製するまでインキュベートした。
（微生物の培養）
寒天培地表面の一つのコロニーを加熱滅菌した生理的食塩水に懸濁し、そのうちの１００μLを上記ＭＰ−ＹＮＢ培地に接種し、１５０ｒｐｍ、３０℃で培養した。この培養物を下記試験例の試料とした。

〔試験例１〕
（ミカン果皮分解能の測定）
果皮分解能はミカン果皮破砕物の乾燥重量の変化から調べた。すなわち、０．２〜４週間の培養液を、ろ紙にて（ミリポアー、孔の口径は１０μｍ）ろ過し、果皮破砕物を集め、１０５℃で４８時間、オーブンで乾燥後、重量を測定した。
測定結果を図１に示す。図１において、横軸は培養時間（単位は週）であり、縦軸はろ過残渣果皮量である。
２週間の培養で、ミカン果皮は約５６％減量し、４週間の培養で約７５％減量した。

〔試験例２〕
（セルロース分解能の測定）
ＯＰ１の一つのコロニーを、５ｍｍの大きさのろ紙１００ｍｇを含むＹＮＢ培地３０ｍＬに接種し、１５０ｒｐｍ、３０℃で培養した。
ろ紙の乾燥重量を測定し、セルロース分解能を調べた（Ｇｈｏｓｅの方法によった）。
測定結果を図２に示す。図２において、横軸は培養時間（単位は週）であり、縦軸は残存ろ紙量である。
〔試験例３〕
（ペクチン分解能の測定）
ＯＰ１の一つのコロニーを、１００ｍｇのペクチンを含むＹＮＢ培地３０ｍＬに接種し、１５０ｒｐｍ、３０℃で培養した。
ペクチンの乾燥重量を測定し、ペクチン分解能を調べた（ドレーウッド アンソロン法によった）。
測定結果を図３に示す。
図３において、横軸は培養時間（単位は日）であり、縦軸は残存ペクチン量である。
図２、図３から、ＯＰ１はセルロース分解能とペクチン分解能とを有すること、及び、２週間及び４週間の培養日数で、セルロースの６３％、７７％が分解され、僅か４日の培養日数で９３％のペクチンが分解したことが判明した。

本発明の新規な微生物ＯＰ１はフィラメント状の糸状菌である。また、セルラーゼ活性およびペクチナーゼ活性を同時に併せ持つ。下記表1記載の系統樹上の近縁種にはこのように二つの活性を同時に持つ微生物は知られていない。

（微生物の同定）
本発明の微生物のｒＤＮＡ塩基配列を次のような操作により解析し、上記の結果を加味し、本発明の微生物は新規微生物であることが判明した。
すなわち、本発明の微生物（ＯＰ１）の培養物１ｍＬからの細胞ペレットをｔｒｉｓＥＤＴＡ緩衝液（１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００）２００μLに懸濁し、３分間沸騰後、氷冷した。引き続き、それぞれの懸濁液をクロロホルム/イソアミル（２４／１）混合溶媒２００μLと混合し、１５０ｒｐｍ、３０℃で、１０分間遠心分離して、水相から粗ＤＮＡを得た。
このＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として用い、２８ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域のＤＮＡ、及びＩＴＳ領域のＤＮＡをＰＣＲ法にて増幅した。
すなわち、２８ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域のＤＮＡは、塩基配列が配列番号４のフォワードプライマーＮＬ１を利用し、塩基配列が配列番号５のリバースプライマーＮＬ４を利用して増幅した。ＩＴＳ領域のＤＮＡは、塩基配列が配列番号６のフォワードプライマーＩＴ１を利用し、塩基配列が配列番号７のリバースプライマーＩＴ４を利用して増幅した。
ＰＣＲ条件は、９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分で３０サイクルとした。

ＰＣＲ法にて増幅した前記Ｄ１／Ｄ２領域のＤＮＡに基づき、里見の方法（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４７，８３２−８３６）を用いて塩基配列を決定し、配列表に配列番号１として示した。同様に、前記ＩＴＳ領域のＤＮＡの塩基配列を決定し、配列表に配列番号２、３として示した。なお、配列番号２はＩＴＳ１領域のＤＮＡの塩基配列であり、配列番号３はＩＴＳ１領域のＤＮＡの塩基配列である。
この方法で得た塩基配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用い(Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ．ａｌ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０)、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ，ＤＤＢＪからから得た既知の微生物のｒＤＮＡ塩基配列と比較して、既知の微生物とのＤＮＡ相同性の一致の程度を比較した。
近隣結合法として知られているＣｌｕｓｔａｌ W プログラム（Ｓａｉｔｏｕ＆Ｎｅｉ，１９８７；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４，４０６−４２５、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９４；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０）を用いて，Ｄ１／Ｄ２領域のＤＮＡに基づく系統樹を作成した。その系統樹を表1に示す。

その結果、ＯＰ１はＰ．Ａｃｕｌｅａｔｕｍ、及びＰ．ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍに近いが、それらとは明確に異なることが判明し、結局、ＯＰ１は新規な微生物であることが判明した。なお、ＩＴＳ１領域のＤＮＡの塩基配列、及びＩＴＳ１領域のＤＮＡの塩基配列の、ＯＰ１と、Ｐ．Ａｃｕｌｅａｔｕｍ、及びＰ．ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍとの違いは次の表２〜４のとおりであった。

表中、ＭＯ１はＰ．Ａｃｕｌｅａｔｕｍを示し、ＭＯ２はＰ．ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍを示す。−は欠損部を示す。また、塩基数の数字は塩基配列の番号を示す。（以下、同じ）。

本発明の新規微生物の培養日数とミカン果皮破砕物との関係を示すグラフである。 本発明の新規微生物を培養日数とセルロース分解能との関係を示すグラフである。 本発明の新規微生物を培養日数とペクチン分解能との関係を示すグラフである。

Claims (3)

1. セルラーゼ活性およびペクチナーゼ活性を同時に併せ持ち、寄託番号はＮＢＲＣ１０１３００である、ミカン果皮分解能を有するペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属）に属する微生物。
2. 請求項１記載の微生物を用いて柑橘類廃棄物を分解することを特徴とする柑橘類廃棄物の減量方法。
3. 請求項１記載の微生物の培養物からペクチナーゼ及び／又はセルラーゼを得ることを特徴とするペクチナーゼ及び／又はセルラーゼの製造方法。

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