CN110684691A - 一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺 - Google Patents

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CN110684691A CN201911011080.XA CN201911011080A CN110684691A CN 110684691 A CN110684691 A CN 110684691A CN 201911011080 A CN201911011080 A CN 201911011080A CN 110684691 A CN110684691 A CN 110684691A
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潘忠成
李蒲民
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Abstract

本发明涉及一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，利用筛选到的多种应用微生物，将生产春雷霉素和多抗霉素过程产生的菌渣、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物经过酸性蛋白酶酶解、两阶段自然变温发酵、多梯度pH固态混合发酵后，得到的具有生物活性的微生物菌剂，完全去除了菌渣和春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物中的异味残留。微生物菌剂中每克活性物料中有效活菌总数超过10亿个，产品粗蛋白占总干物比例达到65‑75%，解决了春雷霉素和多抗霉素生产过程中菌渣和春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物的下游处理难度，提高了菌渣作为生产固废的经济价值，生产的混合微生物菌剂在有机肥料和饲料等多个方向的应用前途。

Description

一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，更具体的涉及一种自然菌株的定向筛选方法，以及以抗生素菌渣为原料的固态混合发酵来制备微生物菌剂的方法。
背景技术
微生物菌剂是一种低炭、纯天然、无害、无污染的生物原料，属于变废为宝的绿色产业，提高菌渣的附加值，利用科技创新的前沿技术增加生产企业的生产效益，进一步增强医药企业可持续发展。
目前国内农产品售价偏低，国内农业原料生产和供应不足，微生物菌剂在有机肥料、饲料等农业方向具有广阔的应用前途。目前国内抗生素菌渣干粉在200万吨/年以上，二次利用效率低，导致资源浪费和二次环境污染。
固态混合发酵法在温度、pH以及生物产酶种类和酶量上具有明显优势，多种微生物形成共生群落，生长过程存在协同促进作用，同时在两阶段固态发酵过程，温度和pH的变化在不同阶段，形成不同的优势菌落，能够加快对原料的酶解的作用，形成梯度生长趋势，达到自然发酵的最优状态。另外，多种微生物在在协同作用的同时，产生一定量的抑制素，可以降低有害微生物的入侵和繁殖，有利于工业化扩大培养。
利用自然筛选和定向筛选原理，可以得到适应性更强、生产性能良好的微生物菌株。进一步通过培养基的液态和固态发酵，对菌株的生产性能进行测定，可以得到各种酶活相对较高的生产菌株。芽孢杆菌和酵母菌两个菌属的菌株在温度和pH上生长条件范围较宽，且相似，另一方面两个菌属分别可以产生细菌和真菌生长的大量酶类，不同的微生物的优势组合，有利于培养基的高效利用，生长迅速，发酵代谢产物具有醇香类物质，更有利于产品品质的保证。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，其核心步骤包括菌株的定向分离和纯化、菌株的生产组合性能验证、两阶段自然混合发酵工艺。本发明涉及两种应用微生物的定向分离和试验筛选过程，其中主要的适应性筛选培养基由春雷霉素菌渣、多抗霉素菌渣、酸性蛋白酶、磷酸氢二钾、玉米皮、硫酸铵、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物、碳酸氢钠等按比例组成。本发明利用筛选到的多种应用微生物，将生产春雷霉素和多抗霉素过程产生的菌渣、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物经过酸性蛋白酶酶解、两阶段自然变温、多梯度pH固态混合发酵后，得到的具有生物活性的微生物菌剂，完全去除了菌渣和春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物中的异味残留。微生物菌剂中每克活性物料中有效活菌总数超过10亿个，产品粗蛋白占总干物比例达到65-75%。本发明解决了春雷霉素和多抗霉素生产过程中菌渣和春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物的下游处理难度，提高了菌渣作为生产固废的经济价值，生产的混合微生物菌剂在有机肥料和饲料等多个方向的应用前途，具有很大的经济价值和社会价值。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，从自然界中筛选获得所需应用性微生物，经过纯化和分离，获得纯种菌株。纯种菌株经过液体筛选配方和固态筛选配方应用性筛选后，再进行生产组合筛选，确定组合菌株后，进行固态混合两阶段发酵，获得微生物菌剂。
更为具体的，本发明所保护的一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，包括以下步骤：
1）从生产车间菌渣池和养殖场取含菌样品，使用LB培养基或PDA培养基，进行稀释涂布培养，涂布样品平板在恒温培养箱培养24-36h，挑取不同形态菌落，进行2-3代连续培养纯化，筛选到的纯化平板或斜面菌株通过菌落形态鉴定和镜检初步鉴定后，分别编号标记作为母种库。
2）从母种库中分别选取芽孢杆菌和酵母菌平板，挑取单菌落接入LB培养基或PDA培养基中，进行摇瓶培养，摇瓶培养物接种到液体筛选配方中进行适应性筛选培养，恒温培养箱培养12-24h，测定T600和OD280，数据变化明显菌号，按照数据大小次序进行标记，同时镜检进行鉴定确认，确定酵母菌属和芽孢菌属，分别作为一代酵母菌备用菌株库和一代芽孢杆菌备用菌株库。
3）对一代备用菌株库内的菌号分别进行液体筛选配方和固态筛选配方连续纯培养，培养时间在24-36h，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH的变化，对符合T600在100以上、OD280在8-10、还原糖先升后降明显并最终降至0.05%以下、pH最低降至5.5-6.5，且培养后期pH有明显回升趋势要求的酵母菌和芽孢杆菌，分别作为二代酵母菌株库和二代芽孢杆菌菌株库。
4）对二代菌株库内的菌株，按照一株酵母菌和一株芽孢杆菌的方案进行工艺组合，先使用固态筛选配方进行分别纯培养，培养时间12-24h，然后两种纯培养物混合后，进行固态培养，培养时间48-72h。混合培养阶段，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH数据变化，对符合T600在180-240、OD280在10-15、还原糖降至0.02%以下、pH最低降至5.5-6.5，且培养后期有明显的回升趋势，物料具有明显的醇香的菌株工艺组合方案，进行重复稳定性试验，确定发酵性能稳定的菌株组合，作为生产菌株库。
5）配料器中加入生产培养基配方的原料，搅拌均匀后，将物料平均分开，分别加入4）步中生产菌株库中的酵母菌和芽孢杆菌摇瓶纯培养物。
6）将搅拌均匀的培养物，分别装入可透气内膜袋中，进行兼性厌氧发酵，发酵24-36h，每12h检测其T600、OD280、还原糖、pH，待发酵物料产生明显醇香味，纯培养发酵结束。
7）发酵好的两种纯培养物，在混料器中直接混合，或按比例加入新鲜生产培养基混合，搅拌均匀后装袋，中间每12-24h翻料，根据发酵情况进行20-30%的补料1-2次，兼性厌氧混合发酵48-72h，待物料无异味，且有明显醇香味时，pH在6.0-7.0之间，混合固态发酵结束，得到活性微生物菌剂。
进一步的，步骤1）中，从生产车间菌渣池取长时间自然发酵样品，从养殖场取新鲜的鸡粪或猪粪样品。
进一步的，步骤 1）中，发酵样品进行预处理，LB培养基稀释涂布前，含菌样品进行加热预处理，样品稀释10倍后，煮沸10min处理。PDA培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后加入25ug/ml～50ug/ml氨苄青霉素。
进一步的，步骤1）中，培养温度控制在36-42℃。
进一步的，所述的液体筛选配方原料按重量配比为：春雷霉素菌渣15-25%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、碳酸氢钠0.5%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物20-30%、纯水30-50%组成。
进一步的，所述的固态筛选配方原料按重量配比：春雷霉素菌渣35-45%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、5-10%春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物、玉米皮10-25%、碳酸氢钠0.5-1%、酵母菌或芽孢杆菌摇瓶培养物5-15%，液碱调节pH至7.0-7.5之间，残液浓缩物和玉米皮控制物料理论湿度在40%左右，手握物料后可成型。
进一步的，所述的生产培养基配方按重量配比及配料次序：依次加入春雷霉素菌渣25-45%、多抗霉素菌渣15-35%、酸性蛋白酶0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、硫酸铵2-6%、5-10%春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物，用液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米皮10-25%、碳酸氢钠0.5-1%。配置过程通过残液浓缩物和玉米皮比例，控制物料理论湿度在40%左右，手握物料后可成型。
进一步的，步骤5）中，生产培养基搅拌均匀后，将物料平均分开，无需灭菌，分别加入酵母菌和芽孢杆菌两种摇瓶培养物各3-15%。
进一步的，步骤 6）中，在湿度为45%-75%，温度为35-45℃的发酵环境中，进行培养。
进一步的，步骤7）中，将两种纯培养物按1:1混合直接混合，或按5-25%比例和新鲜生产培养基物料混合。
进一步的，步骤7）中，生产温度为28-45℃的发酵环境中，进行固态发酵培养。
进一步的，步骤7）后，还包括步骤8）：将每批的纯培养物或混合培养物留样，内膜袋封口，保存在25℃以下，作为下批发酵培养扩大种子。使用前，检查菌丝情况正常后，重复步骤5）至7），或直接按25-30%的比例添加新鲜生产培养基，进行下批发酵培养。
进一步的，步骤8）中，每批的纯培养物5-15%或混合培养物15-25%作为留样，镜检无污染，可连续使用5-6次。
进一步的，培养基配方含有酸性蛋白酶的各步骤中，培养基在调pH前，30-50℃反应2h以上。
上述步骤中菌株的定向筛选和菌种培养工艺、菌剂制备方法可采用本领域现有的方法，本发明提供以下方法，以下方法仅是作为举例，本发明的保护范围不局限于此：
1）酵母菌的定向筛选和纯化
取0.1g样品放入EP管中，加无菌水1ml，振荡均匀，加入50-25ug/ml氨苄青霉素，静置1h左右，梯度稀释至105-107倍，用PDA抗性固体培养基进行梯度涂布平板，37±0.5℃培养12-24 h。在平板上挑取单菌落，用PDA固体培养基平板或斜面进行划线纯化培养，37±0.5℃培养12-24h。
PDA培养基：土豆200g/L，蔗糖 20g/L，抗性平板加氨苄青霉素50-25mg/L，固体培养基中加入琼脂2%，pH自然。
2）芽孢杆菌的定向筛选和纯化
取0.1g样品放入EP管中，加无菌水1ml，振荡均匀，水浴锅中煮沸2-3min，90-100℃静置5min，梯度稀释至105-107倍，用LB改良培养基进行梯度涂布平板，37±0.5℃培养12-24h。在平板上挑取单菌落，用LB改良培养基平板或斜面进行纯化培养，37±0.5℃培养12-24h。
LB改良培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基中加入琼脂2%，pH7.0。
3）酵母菌培养物菌种的制备
取出菌种保藏斜面或保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏和扩培，37±0.5℃培养12h。在平板下挑取一环，接种至50ml的无抗性PDA培养基中，在培养箱中37±0.5℃，转速180rpm，培养10-12h。液体种子采用5-10%的接种量，接种至1000ml种子培养基，在培养箱中37±0.5℃，180rpm，培养8-12h，检测其菌液浓度，OD600＞14，种子备用。
4）芽孢杆菌培养物菌种的制备
取出菌种保藏斜面或保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏和扩培，37±0.5℃厌氧培养12-24h。在平板下挑取一环菌体，接种至50ml的LB培养基中，在培养箱中37±0.5℃，180rpm，培养12-18h。二级种子采用5-10%的接种量，接种1000ml的种子培养基中，在培养箱中37±0.5℃，180rpm，培养12-18h，检测其菌液浓度，OD600＞12，种子备用。
通过本发明方法制备得到的微生物菌剂，经检验后主要技术指标为：
1）完全去除了菌渣和春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物中的异味和残留淀粉、豆饼粉，部分纤维素和游离铵，有效活菌总数超过10亿/克。
2）产品粗蛋白检测含量65-75%，酸性蛋白酶活力300-550IU，淀粉酶活力100-200IU。
3）生产的微生物菌剂各项检验指标符合农用微生物菌剂标准。
与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果在于：
1）本发明利用自然筛选和实验室定向筛选及纯化，得到一系列酵母菌属和芽孢杆菌属的应用型微生物，通过进一步的适应性筛选和应用性筛选得到了两组具有协同生长效应的组合方案。
2）本发明利用芽孢杆菌和酵母菌两种益生菌组合，在发酵过程充分利用细菌和真菌的生长环境不同，发酵过程的pH和温度呈现有规律变化，在不同时间段发挥菌种代谢协同作用，发酵过程对春雷霉素、多抗霉素残液浓缩物和菌渣蛋白、纤维素等物质消耗更彻底。
3）本发明利用酸性蛋白酶加快菌体蛋白分解，增加微生物对菌丝体的消化速率，同时增加玉米皮的比例，提高配料中的空气比率，充分发挥酵母菌和芽孢杆菌的兼性厌氧特征，春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物提供多种微量元素和无机盐，增加菌体细胞的生长和物料的转化效率。
4）通过固态混合发酵制备微生物菌剂，解决了春雷霉素和多抗霉素生产过程中菌渣和残液浓缩物的下游处理难度，提高了春雷霉素和多抗霉素菌渣作为生产固废的经济价值，生产的混合微生物菌剂具有多个方向的应用前途，具有很大的经济价值和社会价值。
具体实施方式
本发明实质性特点可以从以下实例中体现，但这些实例仅作为说明，而不限制该发明的实施方式。
实施例1
1）分别从生产车间菌渣地池取长时间自然发酵样品，从养殖场取新鲜的鸡粪或猪粪样品。样品必须进行预处理，LB培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后，在EP管中煮沸10min处理，PDA培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后加入25ug/ml氨苄青霉素，PDA培养基为氨苄青霉素抗性平板。样品进行预处理后，使用LB培养基或PDA抗性培养基涂布平板，培养箱37±0.5℃培养24h。
从涂布平板中挑取单菌落，使用LB培养基或PDA抗性培养基，进行连续2次划线分纯培养，37±0.5℃培养24h。筛选到的纯化平板或斜面菌株通过菌落形态鉴定和镜检初步鉴定后，分别编号标记作为母种库。
2）从分离到的酵母菌和芽孢杆菌纯化平板上刮取一环，分别接种到LB或PDA摇瓶培养基中，37±0.5℃培养12h。按5%接种量，接种到液态纯培养配方中进行适应性试验筛选，36±0.5℃培养24h。发酵完毕检测T600、OD280、还原糖、pH。对数据变化明显菌号，按照数据大小次序进行重点标记，同时镜检进行鉴定确认，确定酵母菌属和芽孢菌属，分别作为一代酵母菌备用菌株库和一代芽孢杆菌备用菌株库。
液态纯培养配方的原料按重量配比为：春雷霉素菌渣15-25%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、碳酸氢钠0.5%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物20-30%、纯水30-50%。
3）对一代菌株库内的菌株，使用固态纯培养配方进行分别培养，培养时间固态纯培养温度在36℃，初始pH在7.5-8.0之间，培养24h，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH等数据变化，T600在100以上，OD280在8-10，还原糖先升后降明显，最终降至0.05%以下，pH最低降至5.5-6.5，培养后期有明显的回升趋势，对符合要求的酵母菌和芽孢杆菌，分别作为二代酵母菌株库和二代芽孢杆菌菌株库。
固态纯培养配方及试验步骤如下，原料按重量配比为：春雷霉素菌渣35%、多抗霉素菌渣15%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、5%春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物，用偏碱或液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米皮10-25%、碳酸氢钠0.5%，湿度控制在30-40%，搅拌均匀后灭菌处理，加入酵母菌或芽孢杆菌摇瓶纯培养物5-15%，进行固态纯培养。
4）对二代菌株库内的菌株，按照一株酵母菌和一株芽孢杆菌的方案进行工艺组合，先使用固态筛选配方进行分别纯培养，培养时间12h，然后两种纯培养物混合后，进行固态培养，初始温度在36℃，pH在7.5-8.0之间，培养时间48h。混合培养阶段，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH等数据变化，T600在180-240，OD280在10-15，还原糖降至0.02%以下，pH最低降至5.5-6.5，培养后期有明显的回升趋势，物料具有明显的醇香，对符合以上要求的菌株工艺组合方案，进行3次重复稳定性试验，确定发酵性能稳定的菌株组合，作为生产菌株库。
混合固态培养配方原料按重量配比为：春雷霉素菌渣25-45%、多抗霉素菌渣15-35%、酸性蛋白酶0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、玉米皮10-25%、硫酸铵2-6%、碳酸氢钠0.5-1%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物5-10%、芽孢杆菌培养物20-25%、酵母菌培养物20-25%组成。
5）配料杯中依次加入春雷霉素菌渣25%、多抗霉素菌渣35%、酸性蛋白酶0.05%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%，用液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米皮25%、碳酸氢钠0.5-1%，搅拌均匀后，将物料平均分开，然后分别加入生产菌株库中的芽孢杆菌和酵母菌摇瓶培养物各3-15%。
6）将搅拌均匀的纯培养物，装入可透气内膜袋中，在湿度为45%-75%，温度为35-45℃的发酵环境中，自然发酵12h，中间每隔8h进行翻料，进行兼性厌氧发酵，待发酵物料产生明显醇香味，检测其T600、OD280、还原糖，第一阶段发酵结束。
7）将已经发酵好的两种纯培养物，直接混合，搅拌均匀后装袋，28-45℃自然变温，中间每12h翻料过程中，根据发酵情况进行20%的补料2次，兼性厌氧混合发酵48h，物料无异味，且有明显醇香味，pH在6.0-7.0之间，微生物量含量大于10亿/克，第二阶段发酵结束，既获得活性微生物菌剂。活性菌剂酸性蛋白酶活力300-400IU，淀粉酶活力100-200IU。烘干样品粗蛋白检测含量大于65-70%。
8）将每批的纯培养物或混合培养物留样10-25%，内膜袋封口，25℃以下放置，作为下批发酵培养扩大种子，保存在25℃以下，使用时检查菌丝情况正常后，依上5）至7）步进行下批混合发酵。活性菌剂镜检无污染，可连续使用5-6次。
实施例2
1）分别从生产车间菌渣地池取长时间自然发酵样品，从养殖场取新鲜的鸡粪或猪粪样品。样品必须进行预处理，LB培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后，在EP管中煮沸10min处理，PDA培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后加入50ug/ml氨苄青霉素，PDA培养基为氨苄青霉素抗性平板。样品进行预处理后，使用LB培养基或PDA抗性培养基涂布平板，培养箱37±0.5℃培养12h。
从涂布平板中挑取单菌落，使用LB培养基或PDA抗性培养基，进行连续3次划线分纯培养，37±0.5℃培养24h。筛选到的纯化平板或斜面菌株通过菌落形态鉴定和镜检初步鉴定后，分别编号标记，作为母种库。
2）从分离到的酵母菌和芽孢杆菌纯化平板上刮取一环，分别接种到LB或PDA摇瓶培养基中，37±0.5℃培养10h。按10%接种量，接种到液态纯培养配方中进行适应性试验筛选，36±0.5℃培养24h。发酵完毕检测T600、OD280、还原糖、pH。对数据变化明显菌号，按照数据大小次序进行重点标记，同时镜检进行鉴定确认，确定酵母菌属和芽孢菌属，分别作为一代酵母菌备用菌株库和一代芽孢杆菌备用菌株库。
液态纯培养配方的原料按重量配比为：春雷霉素菌渣15-25%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、碳酸氢钠0.5%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物20-30%、纯水30-50%。
3）对一代菌株库内的菌株，使用固态纯培养配方进行分别培养，培养时间固态纯培养温度在40℃，初始pH在7.5-8.0之间，培养36h，每12h测定相关数据变化，最高T600在100以上，OD280在8-10，还原糖先升后降明显，最终降至0.05%以下，pH最低降至5.5-6.5，培养后期有明显的回升趋势，对符合要求的酵母菌和芽孢杆菌，分别作为二代酵母菌株库和二代芽孢杆菌菌株库。
固态纯培养配方及试验步骤如下，原料按重量配比为：春雷霉素菌渣35%、多抗霉素菌渣15%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、5%春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物，用偏碱或液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米皮10-25%、碳酸氢钠0.5%，湿度控制在30-40%，搅拌均匀后灭菌处理，加入酵母菌或芽孢杆菌摇瓶纯培养物5-15%，进行固态纯培养。
4）对二代菌株库内的菌株，按照一株酵母菌和一株芽孢杆菌的方案进行工艺组合，先使用固态筛选配方进行分别纯培养，培养时间24h，然后两种纯培养物混合后，进行固态培养，初始温度在40℃，pH在7.5-8.0之间，培养时间72h。混合培养阶段，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH等数据变化，T600在180-240，OD280在10-15，还原糖降至0.02%以下，pH最低降至5.5-6.5，培养后期有明显的回升趋势，物料具有明显的醇香，对符合以上要求的菌株工艺组合方案，进行4次重复稳定性试验，确定发酵性能稳定的菌株组合，作为生产菌株库。
混合固态培养配方原料按重量配比为：春雷霉素菌渣25-45%、多抗霉素菌渣15-35%、酸性蛋白酶0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、玉米皮10-25%、硫酸铵2-6%、碳酸氢钠0.5-1%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物5-10%、芽孢杆菌培养物20-25%、酵母菌培养物20-25%组成。
5）配料杯中依次加入春雷霉素菌渣45%、多抗霉素菌渣15%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸铵4%，用液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米皮10-15%、碳酸氢钠0.5-1%，搅拌均匀后，将物料平均分开，然后分别加入生产菌株库中的芽孢杆菌和酵母菌摇瓶培养物各3-15%。
6）将搅拌均匀的纯培养物，装入可透气内膜袋中，在湿度为45%-75%，温度为35-45℃的发酵环境中，自然发酵24h，中间每隔10h进行翻料，进行兼性厌氧发酵，待发酵物料产生明显醇香味，检测其T600、OD280、还原糖，第一阶段发酵结束。
7）将已经发酵好的两种纯培养物，直接混合，搅拌均匀后装袋，28-45℃自然变温，中间每24h翻料过程中，根据发酵情况进行30%的补料1次，兼性厌氧混合发酵60h，物料无异味，且有明显醇香味，pH在6.0-7.0之间，微生物量含量大于10亿/克，第二阶段发酵结束，既获得活性微生物菌剂。活性菌剂酸性蛋白酶活力400-550IU，淀粉酶活力100-200IU。烘干样品粗蛋白检测含量70-75%。
8）将每批的纯培养物或混合培养物留样10-25%，内膜袋封口，25℃以下放置，作为下批发酵培养扩大种子，保存在25℃以下，使用时检查菌丝情况正常后，依上5）至7）步进行下批混合发酵。活性菌剂镜检无污染，可连续使用5-6次。
实施例3
1）分别从生产车间菌渣地池取长时间自然发酵样品，从养殖场取新鲜的鸡粪或猪粪样品。样品必须进行预处理，LB培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后，在EP管中煮沸10min处理，PDA培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后加入40氨苄青霉素，PDA培养基为氨苄青霉素抗性平板。样品进行预处理后，使用LB培养基或PDA抗性培养基涂布平板，培养箱37±0.5℃培养20h。
从涂布平板中挑取单菌落，使用LB培养基或PDA抗性培养基，进行连续2-3次划线分纯培养，37±0.5℃培养24h。筛选到的纯化平板或斜面菌株通过菌落形态鉴定和镜检初步鉴定后，分别编号标记作为母种库。
2）从分离到的酵母菌和芽孢杆菌纯化平板上刮取一环，分别接种到LB或PDA摇瓶培养基中，37±0.5℃培养12h。按10%接种量，接种到液态纯培养配方中进行适应性试验筛选，36±0.5℃培养24h。发酵完毕检测T600、OD280、还原糖、pH。对数据变化明显菌号，按照数据大小次序进行重点标记，同时镜检进行鉴定确认，确定酵母菌属和芽孢菌属，分别作为一代酵母菌备用菌株库和一代芽孢杆菌备用菌株库。
液态纯培养配方的原料按重量配比为：春雷霉素菌渣15-25%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、碳酸氢钠0.5%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物20-30%、纯水30-50%。
3）对一代菌株库内的菌株，使用固态纯培养配方进行分别培养，培养时间固态纯培养温度在36℃，初始pH在7.5-8.0之间，培养24h，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH等数据变化，T600在100以上，OD280在8-10，还原糖先升后降明显，最终降至0.05%以下，pH最低降至5.5-6.5，培养后期有明显的回升趋势，对符合要求的酵母菌和芽孢杆菌，分别作为二代酵母菌株库和二代芽孢杆菌菌株库。
固态纯培养配方及试验步骤如下，原料按重量配比为：春雷霉素菌渣35%、多抗霉素菌渣15%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、5%春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物，用偏碱或液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米皮10-25%、碳酸氢钠0.5%，湿度控制在30-40%，搅拌均匀后灭菌处理，加入酵母菌或芽孢杆菌摇瓶纯培养物5-15%，进行固态纯培养。
4）对二代菌株库内的菌株，按照一株酵母菌和一株芽孢杆菌的方案进行工艺组合，先使用固态筛选配方进行分别纯培养，培养时间12h，然后两种纯培养物混合后，进行固态培养，初始温度在36℃，pH在7.5-8.0之间，培养时间60h。混合培养阶段，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH等数据变化，T600在180-240，OD280在10-15，还原糖降至0.02%以下，pH最低降至5.5-6.5，培养后期有明显的回升趋势，物料具有明显的醇香，对符合以上要求的菌株工艺组合方案，进行3-5次重复稳定性试验，确定发酵性能稳定的菌株组合，作为生产菌株库。
混合固态培养配方原料按重量配比为：春雷霉素菌渣25-45%、多抗霉素菌渣15-35%、酸性蛋白酶0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、玉米皮10-25%、硫酸铵2-6%、碳酸氢钠0.5-1%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物5-10%、芽孢杆菌培养物20-25%、酵母菌培养物20-25%组成。
5）配料杯中依次加入春雷霉素菌渣25%、多抗霉素菌渣35%、酸性蛋白酶0.05%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%，用液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米皮25%、碳酸氢钠0.5-1%，搅拌均匀后，将物料平均分开，然后分别加入生产菌株库中的芽孢杆菌和酵母菌摇瓶培养物各3-15%。
6）将搅拌均匀的纯培养物，装入可透气内膜袋中，在湿度为45%-75%，温度为35-45℃的发酵环境中，自然发酵12h，中间每隔8h进行翻料，进行兼性厌氧发酵，待发酵物料产生明显醇香味，检测其T600、OD280、还原糖，第一阶段发酵结束。
7）将已经发酵好的两种纯培养物，直接混合，搅拌均匀后装袋，28-45℃自然变温，中间每12h翻料过程中，根据发酵情况进行20%的补料2次，兼性厌氧混合发酵48h，物料无异味，且有明显醇香味，pH在6.0-7.0之间，微生物量含量大于10亿/克，第二阶段发酵结束，既获得活性微生物菌剂。活性菌剂酸性蛋白酶活力300-400IU，淀粉酶活力100-200IU。烘干样品粗蛋白检测含量大于65-70%。
8）将每批的纯培养物或混合培养物留样10-25%，内膜袋封口，25℃以下放置，作为下批发酵培养扩大种子，保存在25℃以下，使用时检查菌丝情况正常后，依上5）至7）步进行下批混合发酵。活性菌剂镜检无污染，可连续使用5-6次。
实施例4
1）分别从生产车间菌渣地池取长时间自然发酵样品，从养殖场取新鲜的鸡粪或猪粪样品。样品必须进行预处理，LB培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后，在EP管中煮沸10min处理，PDA培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后加入30ug/ml氨苄青霉素，PDA培养基为氨苄青霉素抗性平板。样品进行预处理后，使用LB培养基或PDA抗性培养基涂布平板，培养箱37±0.5℃培养12h。
从涂布平板中挑取单菌落，使用LB培养基或PDA抗性培养基，进行连续2-3次划线分纯培养，37±0.5℃培养12h。筛选到的纯化平板或斜面菌株通过菌落形态鉴定和镜检初步鉴定后，分别编号标记作为母种库。
2）从分离到的酵母菌和芽孢杆菌纯化平板上刮取一环，分别接种到LB或PDA摇瓶培养基中，37±0.5℃培养10h。按5%接种量，接种到液态纯培养配方中进行适应性试验筛选，36±0.5℃培养24h。发酵完毕检测T600、OD280、还原糖、pH。对数据变化明显菌号，按照数据大小次序进行重点标记，同时镜检进行鉴定确认，确定酵母菌属和芽孢菌属，分别作为一代酵母菌备用菌株库和一代芽孢杆菌备用菌株库。
液态纯培养配方的原料按重量配比为：春雷霉素菌渣15-25%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、碳酸氢钠0.5%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物20-30%、纯水30-50%。
3）对一代菌株库内的菌株，使用固态纯培养配方进行分别培养，培养时间固态纯培养温度在40℃，初始pH在7.5-8.0之间，培养24h，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH等数据变化，T600在100以上，OD280在8-10，还原糖先升后降明显，最终降至0.05%以下，pH最低降至5.5-6.5，培养后期有明显的回升趋势，对符合要求的酵母菌和芽孢杆菌，分别作为二代酵母菌株库和二代芽孢杆菌菌株库。
固态纯培养配方及试验步骤如下，原料按重量配比为：春雷霉素菌渣35%、多抗霉素菌渣15%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、5%春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物，用偏碱或液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米皮10-25%、碳酸氢钠0.5%，湿度控制在30-40%，搅拌均匀后灭菌处理，加入酵母菌或芽孢杆菌摇瓶纯培养物5-15%，进行固态纯培养。
4）对二代菌株库内的菌株，按照一株酵母菌和一株芽孢杆菌的方案进行工艺组合，先使用固态筛选配方进行分别纯培养，培养时间12h，然后两种纯培养物混合后，进行固态培养，初始温度在40℃，pH在7.5-8.0之间，培养时间72h。混合培养阶段，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH等数据变化，T600在180-240，OD280在10-15，还原糖降至0.02%以下，pH最低降至5.5-6.5，培养后期有明显的回升趋势，物料具有明显的醇香，对符合以上要求的菌株工艺组合方案，进行5次重复稳定性试验，确定发酵性能稳定的菌株组合，作为生产菌株库。
混合固态培养配方原料按重量配比为：春雷霉素菌渣25-45%、多抗霉素菌渣15-35%、酸性蛋白酶0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、玉米皮10-25%、硫酸铵2-6%、碳酸氢钠0.5-1%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物5-10%、芽孢杆菌培养物20-25%、酵母菌培养物20-25%等组成。
5）配料杯中依次加入春雷霉素菌渣25-45%、多抗霉素菌渣15-35%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸铵4%，用液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米皮10-15%、碳酸氢钠0.5-1%，搅拌均匀后，备用。
6）将上一批次发酵好的两种纯培养物或混合培养物，按10-25%比例和配料杯中生产培养基物料直接混合，搅拌均匀后装袋，28-45℃自然变温，中间每24h翻料过程中，根据发酵情况进行20%的补料2次，兼性厌氧混合发酵72h，物料无异味，且有明显醇香味。
7）混合培养物再次按照25-30%比例和新生产培养基混合，进行直接装袋，封口后厌氧发酵72h，有明显的醇香味后，发酵结束，既获得活性微生物菌剂，产品指标稳定。活性菌剂酸性蛋白酶活力300-550IU，淀粉酶活力100-200IU。烘干样品粗蛋白检测含量65-75%。
8）将混合培养物留样10-25%，内膜袋封口，25℃以下放置，作为下批发酵培养扩大种子，保存在25℃以下，使用时检查菌丝情况正常后，依上5）至7）步进行下批混合发酵。活性微生物菌剂，镜检无污染，可连续使用5-6次。
以上具体实施例描述了本发明的基本原理和主要特征。本行业的技术人员应该了解，本发明的保护范围不受上述实施例的限制，任何不经过创造性劳动想到的变化或者替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种基于微生物的定向筛选的微生物菌剂的制备工艺，其特征在于，从自然界中筛选获得所需应用性微生物，经过纯化和分离，获得纯种菌株，纯种菌株经过液体筛选配方和固态筛选配方应用性筛选后，再进行生产组合筛选，确定组合菌株后，进行固态混合两阶段发酵，获得微生物菌剂。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1）从生产车间菌渣池和养殖场取含菌样品，使用LB培养基或PDA培养基，进行稀释涂布培养，涂布样品平板在恒温培养箱培养24-36h，挑取不同形态菌落，进行2-3代连续培养纯化，筛选到的纯化平板或斜面菌株通过菌落形态鉴定和镜检初步鉴定后，分别编号标记作为母种库；
2）从母种库中分别选取芽孢杆菌和酵母菌平板，挑取单菌落接入LB培养基或PDA培养基中，进行摇瓶培养，摇瓶培养物接种到液体筛选配方中进行适应性筛选培养，恒温培养箱培养12-24h，测定T600和OD280，数据变化明显菌号，按照数据大小次序进行标记，同时镜检进行鉴定确认，确定酵母菌属和芽孢菌属，分别作为一代酵母菌备用菌株库和一代芽孢杆菌备用菌株库；
3）对一代备用菌株库内的菌号分别进行液体筛选配方和固态筛选配方连续纯培养，培养时间在24-36h，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH的变化，对符合T600在100以上、OD280在8-10、还原糖先升后降明显并最终降至0.05%以下、pH最低降至5.5-6.5，且培养后期pH有明显回升趋势要求的酵母菌和芽孢杆菌，分别作为二代酵母菌株库和二代芽孢杆菌菌株库；
4）对二代菌株库内的菌株，按照一株酵母菌和一株芽孢杆菌的方案进行工艺组合，先使用固态筛选配方进行分别纯培养，培养时间12-24h，然后两种纯培养物混合后，进行固态培养，培养时间48-72h；
混合培养阶段，每12h测定T600和OD280、还原糖、pH数据变化，对符合T600在180-240、OD280在10-15、还原糖降至0.02%以下、pH最低降至5.5-6.5，且培养后期pH有明显回升趋势、物料具有明显的醇香的菌株工艺组合方案，进行重复稳定性试验，确定发酵性能稳定的菌株组合，作为生产菌株库；
5）配料器中加入生产培养基配方的原料，搅拌均匀后，将物料平均分开，分别加入4）步中生产菌株库中的酵母菌和芽孢杆菌摇瓶纯培养物；
6）将搅拌均匀的培养物，分别装入可透气内膜袋中，进行兼性厌氧发酵，发酵24-36h，每12h检测其T600、OD280、还原糖、pH，待发酵物料产生明显醇香味，纯培养发酵结束；
7）发酵好的两种纯培养物，在混料器中直接混合，或按比例加入新鲜生产培养基混合，搅拌均匀后装袋，中间每12-24h翻料，根据发酵情况进行20-30%的补料1-2次，兼性厌氧混合发酵48-72h，待物料无异味，且有明显醇香味时，pH在6.0-7.0之间，混合固态发酵结束，得到活性微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，步骤1）中，从生产车间菌渣池取长时间自然发酵样品，从养殖场取新鲜的鸡粪或猪粪样品；
发酵样品进行预处理，LB培养基稀释涂布前，含菌样品进行加热预处理，样品稀释10倍后，煮沸10min处理；
PDA培养基稀释涂布前，样品稀释10倍后加入25ug/ml～50ug/ml氨苄青霉素；
培养温度控制在36-42℃。
4.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，所述的液体筛选配方原料按重量配比为：春雷霉素菌渣15-25%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、碳酸氢钠0.5%、春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物20-30%、纯水30-50%组成。
5.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，所述的固态筛选配方原料按重量配比：春雷霉素菌渣35-45%、多抗霉素菌渣15-25%、酸性蛋白酶0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸铵2%、5-10%春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物、玉米皮10-25%、碳酸氢钠0.5-1%、酵母菌或芽孢杆菌摇瓶培养物5-15%，液碱调节pH至7.0-7.5之间，残液浓缩物和玉米皮控制物料理论湿度在40%左右，手握物料后可成型。
6.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，所述的生产培养基配方按重量配比及配料次序：依次加入春雷霉素菌渣25-45%、多抗霉素菌渣15-35%、酸性蛋白酶0.05-0.15%、磷酸氢二钾0.05-0.5%、硫酸铵2-6%、5-10%春雷霉素和多抗霉素残液浓缩物，用液碱调节pH至7.0-7.5之间，再依次加入玉米10-25%、碳酸氢钠0.5-1%；
配置过程通过残液浓缩物和玉米皮比例，控制物料理论湿度在40%左右，手握物料后可成型。
7.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，步骤5）中，生产培养基搅拌均匀后，将物料平均分开，无需灭菌，分别加入酵母菌和芽孢杆菌两种摇瓶培养物各3-15%。
8.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，步骤 6）中，在湿度为45%-75%，温度为35-45℃的发酵环境中，进行培养。
9.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，步骤7）中，将两种纯培养物按1:1混合直接混合，或按5-25%比例和新鲜生产培养基物料混合；
生产温度为28-45℃的发酵环境中，进行固态发酵培养。
10.根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，步骤7）后，还包括步骤8）：将每批的纯培养物或混合培养物留样，内膜袋封口，保存在25℃以下，作为下批发酵培养扩大种子；
使用前，检查菌丝情况正常后，重复步骤5）至7），或直接按25-30%的比例添加新鲜生产培养基，进行下批发酵培养；
步骤8）中，每批的纯培养物5-15%或混合培养物15-25%作为留样，镜检无污染，可连续使用5-6次。
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