CN101215535A - 固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法 - Google Patents

Abstract

固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法，属于生物工程技术领域。该菌株是从纳豆中分离得到的一种纳豆芽孢杆菌，命名为Bacillus natto S703，保藏编号CCTCC M207147。其筛选方法是利用纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶这一特征将纳豆的浸提液进行稀释平板分离，获得的单菌落点种于含纤维蛋白的平板初筛选培养基，根据透明圈直径与菌落直径比值的大小选择单菌落进行纯化得到合适的纳豆芽孢杆菌。将该菌株接种于由麸皮、豆粕、玉米淀粉、磷酸氢二钾和硫酸镁组成的固态发酵培养基，经过固态发酵、干燥、粉碎，得到纳豆芽孢杆菌微生态制剂。制得的纳豆芽孢杆菌微生态制剂用于肉鸡饲料，对肉鸡的日增重、饲料系数和存活率均有显著改善。

Description

固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法

技术领域

固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法，属于微生态制剂技术领域。

背景技术

1905年东京大学的泽村教授(Sawamura)从纳豆中首次发现并分离出纳豆芽孢杆菌，并将该菌株命名为Bacillus natto Sawamura。此后于1946年经美国Smith等人的研究，认为纳豆菌应属于枯草杆菌(Bacillus subtilis)的类缘菌(亚种)，因此在分类上从Bergey′s Mannual of Determinative Bacteriology笫6版起，将纳豆菌归属于枯草杆菌中。但由于纳豆菌的维生素要求性或以γ-聚谷氨酸为主要成分的粘质物生产特性，以及噬菌体的感染特异性显然与枯草杆菌不同，故在日本还是与枯草杆菌区别，使用纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto或Bacillusnatto)的名称。

纳豆芽孢杆菌是微生态制剂的理想生产菌株之一，我国农业部公布的12种可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂，其中就包括纳豆芽孢杆菌(农业部第105号公告，1999年)。它耐酸、耐碱、耐100℃高温及耐挤压，在制粒过程及酸性胃环境中均能保持稳定性，在肠胃道中不增殖，只在肠道上段迅速发育转变成具有新陈代谢作用的营养型细胞。纳豆芽孢杆菌能使肠道酸化而有利于铁、钙及维生素D等的吸收，促进动物生长，缩短饲养周期；它能明显提高蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性，增强动物对植物性饲料中某些复杂的碳水化合物的降解，从而提高饲料的转化率并增加饲料原料的可利用种类；纳豆芽孢杆菌能促进双歧杆菌、乳酸杆菌和梭菌等厌氧菌的生长，有效抑制肠道中肠杆菌和肠球菌等需氧菌的生长，促进宿主肠道正常菌群生长，保持微生态平衡的作用。纳豆芽孢杆菌的代谢物具有降血压、抗肿瘤、抗氧化性、溶血栓及预防骨质疏松等作用(蒋立文，周传云，黄香华.纳豆菌的研究现状和应用进展.中国食物与营养.2007年第六期；王发祥，钟青萍，钟士清.纳豆菌的研究和应用.广州食品工业科技.2003年增刊)

由于纳豆芽孢杆菌具有以上优良特性，国内外的学者对其进行了大量研究。研究内容主要集中于纳豆芽孢杆菌的筛选(杨晓斌，谢拥葵，韦燕鹏等.益生菌纳豆芽孢杆菌的筛选.广州食品工业科技.2003年增刊)、以纳豆芽孢杆菌制备纤溶酶的发酵工艺(余功保，郭爱玲，秦巧玲等.一株高产纳豆激酶菌株的筛选及其发酵条件的优化.食品科学.2007年第4期)、纳豆芽孢杆菌的液体深层发酵工艺(朱健辉，杜连祥，路福平.纳豆激酶液态发酵工艺优化.食品与发酵工业.2005年第8期)、纳豆芽孢杆菌粉剂制备工艺(钟青萍，王发祥，刘家畅等.纳豆菌活菌干燥制剂的研制.食品工业科技.2005年第8期)等方面，而纳豆芽孢杆菌的固态发酵工艺则很少见报道。专利CN 101019609A报道了用浸泡豆粕为主要原料生产纳豆芽孢杆菌制剂的固态发酵方法，但由于浸泡豆粕的粘度和粒度较大影响了纳豆芽孢杆菌的生长，因此发酵后的活菌数明显偏低，仅为5×10¹¹左右。

固态发酵工艺具有投资少、工艺简单、生成成本低等优点，可用于饲料添加剂的生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法，选用从纳豆中筛选出合适的纳豆芽孢杆菌并提出该菌株固态发酵生产微生态制剂的方法。

本发明的技术方案：一株固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的菌种，其分类命名为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)S703，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M207147。

固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法，制备步骤为：

1)出发菌株为纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147；

2)种子培养：

液体种子培养基以g/L计为：蛋白胨10、牛肉膏5、NaCl5，pH 7.0～7.2；

培养条件：将纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147接种于肉汤培养基斜面，37℃培养24h；挑取1环斜面种子接种于液体种子培养基，于旋转式摇床200rpm，37℃培养16h，得到一级种子液；

3)二级种子培养：

培养条件：于5～50L的种子发酵罐中装入70％体积的液体种子培养基，121℃灭菌15min，冷却至37℃，接种1％～2％上述一级种子液，37℃培养10～18h，得到二级种子液；

4)固态培养：

配制固态发酵培养基：将5～8份麸皮，1～4份豆饼粉，1～4份玉米淀粉混和均匀，按照固-液重量比1∶0.9～1.4的比例加入含K₂HPO₄·3H₂O 0.5％～2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％～0.2％的溶液，搅拌均匀，121℃灭菌30min，冷却至37℃，得到固态发酵培养基；

培养条件：固态发酵培养基中接种1％～4％上述二级种子液，充分拌匀，在密闭的固态发酵罐中，37℃保温保湿发酵32～40h，得到湿发酵曲；

5)添加载体并干燥：在上述湿发酵曲中加入重量比为10～20倍的玉米淀粉，充分拌匀，于50～80℃的热风中干燥3～15h，得到干燥发酵曲；

6)粉碎：将上述干燥发酵曲粉碎，过40～60目筛，得到纳豆芽孢杆菌微生态制剂。

本发明涉及的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)S703，是利用纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶这一特征将纳豆的浸提液进行稀释平板分离，获得的单菌落点种于含纤维蛋白的平板初筛选培养基，根据透明圈直径与菌落直径比值的大小选择单菌落进行纯化得到的。

经过上述步骤生产的纳豆芽孢杆菌微生态制剂具有耐高温(图2)、耐酸碱(图4)、耐胆汁(图5)的特点，并具有较好的贮存稳定性。微生态制剂产品中的活菌总数为1.0×10¹⁰～2.0×10¹⁰cef/g。纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147还具有产纤溶酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力，在步骤4)得到的湿发酵曲含有一定量的纤溶酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶。

将步骤6)得到的纳豆芽孢杆菌微生态制剂以0.1％的量添加于饲料中，用于肉鸡饲料，对肉鸡的日增重相对于普通饲料提高大于5％，饲料系数和存活率均有显著改善。

本发明的有益效果：由于本固态发酵生产纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法是在一种密闭式固态发酵反应器中进行的，且整个发酵过程遵循无菌操作规程，从而使纳豆芽孢杆菌的固态发酵生产实现了严格意义上的纯种培养，并实现大规模放大生产。本发明涉及的固态发酵培养基解决了以豆粕为主要原料存在的高粘性等问题，大大提高了纳豆芽孢杆菌的产量，发酵产品的活菌数达到20×10¹¹cef/g以上，且具有较高的芽孢率，经载体稀释后达到1×10¹⁰～2×10¹⁰cef/g。且生产成本低，产品质量稳定高效，生产过程无三废产生，属清洁生产工艺。

附图说明

图1纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固体发酵曲线

图2纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147对100℃的耐受性

图3纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147对80℃的耐受性

图4纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147对酸碱的耐受性

图5纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147对胆汁的耐受性

图6发酵温度对活菌数的影响

图7培养基起始pH对活菌数的影响

图8发酵时间对芽孢率的影响

生物材料样品保藏

本发明涉及的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)S703，该菌株已于2007年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号CCTCC NO.M207147。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明：

实施例1：纳豆芽孢杆菌微生态制剂的固态发酵方法

将纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147接种于肉汤培养基斜面，37℃培养24h。挑取1环斜面种子接种于液体种子培养基(蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、NaCl0.5％，pH 7.0～7.2)，于旋转式摇床200r.p.m，37℃培养16h，得到一级种子液。于50L的种子发酵罐中装入35L液体种子培养基，121℃灭菌15min，冷却至37℃，接种1.5％一级种子液，37℃培养10h，得到二级种子液。6.5份麸皮，2份豆饼粉，1.5份玉米淀粉混和均匀，按照固-液重量比1∶1.2的比例加入无机盐溶液(溶液中含K₂HPO₄·3H₂O 1.0％，MgSO₄·7H₂O 0.1％)拌匀，121℃灭菌30min，冷却至37℃，得到固态发酵培养基。固态发酵培养基中接种1.5％上述二级种子液，充分拌匀，在密闭的固态发酵罐中，37℃保温保湿发酵40h左右，得到湿发酵曲。其发酵过程曲线见图1。在湿发酵曲中加入重量比为15倍的玉米淀粉，充分拌匀，于55℃的热风中干燥6h，得到干燥发酵曲。将干燥发酵曲粉碎，过60目筛，得到纳豆芽孢杆菌微生态制剂。

实施例2：纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147对温度的耐受性

将纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147的芽孢液和营养体菌液分别于100℃、80℃水浴中保温一段时间后分别进行活菌计数，以未进行水浴前的活菌数为对照，计算相对存活率。结果见图2，3。

实施例3：纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147对酸碱的耐受性

将纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147的营养体菌液在37℃时不同pH下保温45min后分别进行活菌计数，以未处理的营养体菌液活菌数为对照，计算其相对存活率。结果见图4。

实施例4：纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147对胆汁的耐受性

将纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147营养体菌液在37℃时于不同浓度胆盐溶液中保温一段时间后分别进行活菌计数，以未进行水浴前的活菌数为对照，计算相对存活率。结果见图5。

实施例5：纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147最佳固态发酵培养基的确定

(1)氮源的确定：将底物麸皮固定为8份，与不同的氮源混和均匀，按照固-液重量比1∶1.2的比例加入无机盐溶液(溶液中含K₂HPO₄·3H₂O 0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.1％)拌匀，121℃灭菌30min，冷却至37℃，接种种子液，37℃保温保湿发酵32h左右，取样检测活菌总数。结果如表1显示，选用豆饼粉是较适合的氮源。

表1不同氮源对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响

氮源	添加比例(份)	活菌总数(1×1011cef/g)
			豆饼粉硫酸铵硝酸钠蛋白胨酵母膏	2.00.270.350.480.82	8.52.01.02.74.5

(2)豆饼粉添加量的确定：将3～9份麸皮与不同添加量的豆饼粉混和均匀，其余操作条件同(1)，取样检测活菌总数。结果如表2所示，较适合的添加比例为2份豆饼粉加8汾麸皮。

表2豆饼粉浓度对对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响

豆饼粉添加比例(份)	麸皮添加比例(份)	活菌总数(1×1011cef/g)
			1234567	9876543	6.87.56.25.33.61.90.9

(3)碳源的确定：将7.5份麸皮、2份豆饼粉和0.5份不同碳源混和均匀，其余操作条件同(1)，取样检测活菌总数。结果如表3所示，玉米淀粉是最适合的碳源。

表3不同碳源对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响

碳源	添加比例(份)	活菌总数(1×1011cef/g)
			葡萄糖乳糖果糖蔗糖玉米粉玉米淀粉对照	0.50.50.50.50.50.5不添加	2.2103.56.87.117.65.4

(4)玉米淀粉添加量的确定：将6～8份麸皮、2份豆饼粉和不同添加量的玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同(1)，取样检测活菌总数。结果如表4所示，玉米淀粉最适合的添加量为：1.5份玉米淀粉加6.5份麸皮。

表4不同玉米淀粉添加量对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响

玉米淀粉的添加比例(份)	麸皮添加比例(份)	活菌总数(1×1011cef/g)
			00.51.01.52.0	8.07.57.06.56.0	6.917.320.523.519.3

(5)加水比的确定：将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，按照固-液重量比1∶0.9～1.4的比例加入无机盐溶液拌匀，其余操作条件同(1)，取样检测活菌总数。结果如表5所示，最适合的加水比为1∶1.2。

表5不同加水比对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响

加水比	活菌总数(1×1011cef/g)
		1∶0.91∶1.01∶1.11∶1.21∶1.31∶1.4	141719212018

(6)无机盐浓度的确定：将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同(1)，最适合的K₂HPO₄浓度为1.0％、MgSO₄浓度为0.1％。

表6无机盐浓度对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响

K2HPO4浓度(％)	MgSO4浓度(％)	活菌总数(1×1011cef/g)
			0.30.51.00.50.5	0.10.10.10.050.2	22.424.725.221.519.4

实施例6：纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147最佳固态发酵条件的确定

(1)最佳发酵温度的确定：将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，按照固-液重量比1∶1.2的比例加入无机盐溶液(溶液中含K₂HPO₄·3H₂O0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.1％)拌匀，其余操作条件同实施例5(1)，取样检测活菌总数。结果如图7所示，最适合的固态发酵温度为37℃。

(2)最佳发酵pH的确定：将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同实施例5(1)，取样检测活菌总数。结果如图7所示，最适合的固态发酵pH为5.5～6.5，即自然pH。

实施例7：发酵时间对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147芽孢率的影响

芽孢杆菌产芽孢后，可大大提高其对恶劣环境的耐受能力。为了提高纳豆芽孢杆菌制剂的加工性能以及对动物消化系统环境的适应性，一般要求芽孢杆菌制剂既要具有较高的活菌数又要具有较高的芽孢率(大于80％)。将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同实施例5(1)，37℃保温保湿发酵50h左右，在发酵过程中每间隔一定的时间取样测定其活菌数和芽孢率，结果如图8所示，发酵40h后芽孢率超过80％。

实施例8：纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147的产酶能力

将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同实施例5(1)，37℃保温保湿发酵40h左右，监测湿发酵曲中的纤溶酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力，结果如表7所示，纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147具有一定的产纤溶酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力。

表7纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147的产酶能力

	纤溶酶	蛋白酶	淀粉酶	纤维素酶
					酶活力(U/g干曲)	286	1054	127	106

实施例9：纳豆芽孢杆菌微生态制剂的应用

选择健康活泼、体重相近的19日龄AA肉鸡3600羽，试验鸡随机分为对照组和试验组，每组设4个重复，试验37天。饲养试验自由采食，自由饮水，各组饲养条件基本一致。各项管理按常规进行，每天观察记录鸡只的生长活动、健康与疾病情况等，在试验第37天(56日龄)空腹称重和试验分析。试验组肉鸡全价配合饲料组成为玉米70％、豆粕25％、预混料5％、添加纳豆芽孢杆菌微生态制剂(活菌数≥1.0×10¹⁰cfu/g)为全价配合饲料量的0.1％；对照组的肉鸡全价配合饲料组成与试验组相同，但不添加纳豆芽孢杆菌制剂，试验组比对照组增重提高6.96％(P＜0.01)、饲料系数提高5.04％(P＜0.05)、存活率提高2.14％(P＜0.05)。说明本发明涉及的纳豆芽孢杆菌微生态制剂能显著改善肉鸡的日增重、饲料系数和存活率。

Claims (1)

1.一株固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的菌种，其分类命名为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)S703，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M207147。

2、固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法，其特征是制备步骤为：

1)出发菌株为纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147；

2)种子培养：

液体种子培养基以g/L计为：蛋白胨10、牛肉膏5、NaCl5，pH 7.0～7.2；

培养条件：将纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147接种于肉汤培养基斜面，37℃培养24h；挑取1环斜面种子接种于液体种子培养基，于旋转式摇床200rpm，37℃培养16h，得到一级种子液；

3)二级种子培养：

培养条件：于5～50L的种子发酵罐中装入70％体积的液体种子培养基，121℃灭菌15min，冷却至37℃，接种1％～2％上述一级种子液，37℃培养10～18h，得到二级种子液；

4)固态培养：

配制固态发酵培养基：将5～8份麸皮，1～4份豆饼粉，1～4份玉米淀粉混和均匀，按照固-液重量比1∶0.9～1.4的比例加入含K₂HPO₄·3H₂O 0.5％～2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％～0.2％的溶液，搅拌均匀，121℃灭菌30min，冷却至37℃，得到固态发酵培养基；

培养条件：固态发酵培养基中接种1％～4％上述二级种子液，充分拌匀，在密闭的固态发酵罐中，37℃保温保湿发酵32～40h，得到湿发酵曲；

5)添加载体并干燥：在上述湿发酵曲中加入重量比为10～20倍的玉米淀粉，充分拌匀，于50～80℃的热风中干燥3～15h，得到干燥发酵曲；

6)粉碎：将上述干燥发酵曲粉碎，过40～60目筛，得到纳豆芽孢杆菌微生态制剂。