CN103980535A - 芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法 - Google Patents

芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵和生物降解技术领域，具体是提供了一种利用芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法。本发明采用芽孢杆菌YP1(CGMCC6318，Bacillus sp.YP1)与含铜离子的发酵培养基混合发酵，通过低温离心、硫酸铵沉淀和冷冻干燥相结合的方法分离浓缩得漆酶，然后用所得酶处理聚乙烯薄膜。通过水接触角(WCA)、ATR-FTIR和SEM的表征看出，聚乙烯薄膜经漆酶处理后接触角从98.1°降低到69.0°，变得相对亲水；表面出现了极性基团羰基C＝O；表面出现裂缝、凹槽等侵蚀现象，变得相对粗糙。证明芽孢杆菌YP1胞外漆酶具有氧化和降解聚乙烯的能力，为探索聚乙烯生物降解的酶处理方法提供了一定的研究基础。

Description

芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法
本发明涉及一种利用芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，属于微生物发酵和固体废物生物降解的技术领域。
背景技术
塑料废弃物是目前非常严重的固体废物污染问题，它正以每年4000万t的速度在环境中积累，造成严重的生态环境污染。聚乙烯-[CH2-CH2]n-是日常生活中最常用的高分子材料之一，大量用于制造塑料袋、塑料薄膜及牛奶桶的产品等，被广泛应用于国民经济和人类生活的各个方面。由于其长链、疏水大分子结构特点，一般认为聚乙烯在自然环境中的生物降解过程是极其缓慢的。长期以来，各国研究者都在努力探索有效的聚乙烯生物降解方法和途径。
高分子的生物降解是指微生物或酶切断聚合物分子链，在分子链水平上利用生化过程降解大分子的方法。目前，研究已经发现了一些真菌和细菌等微生物具有降解聚乙烯的作用：这些微生物能够利用聚乙烯作为唯一碳源生长，使聚乙烯表面产生明显的侵蚀。此外，少数报道表明链霉菌胞外酶、真菌木质素锰过氧化物酶和红球菌漆酶对预处理聚乙烯(UV或改性剂处理)有氧化降解的潜力，大豆过氧化物酶和细菌单加氧酶对未处理聚乙烯具有氧化降解的潜力。
漆酶是一种含铜的氧化还原酶，广泛存在于植物、动物和微生物(真菌和细菌)中。漆酶具有较强的催化氧化能力，能催化氧化降解多种难降解的有机物，包括农药、多环芳烃(PAHs)、多氯联苯(PCBs)、酚类、苯胺类及蒽醌类等，尤其对天然高分子木质素的降解研究的比较多。当漆酶催化底物氧化时，漆酶利用氧分子作为电子受体，从被氧化的底物分子中通过单电子提取方式去除一个氢原子，形成相应的底物自由基，这些自由基不稳定会进一步发生水合作用、歧化作用等非酶促反应，从而氧化芳基-烷基及其侧链烷基的C-C键等。聚乙烯由长链C-C键链接而成，漆酶的这些催化特性使得其也可能具有氧化降解聚乙烯的能力。
发明内容
本发明可通过以下方式得以实现：
在选定的培养基中接种芽孢杆菌YP1(CGMCC6318，)种子液，在适宜的产酶条件下发酵，通过一定的方法分离浓缩得到漆酶，再将酶用于降解聚乙烯薄膜，在适宜条件下作用一定时间后取出样品，洗净后表征酶降解效果。
发酵产酶培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，KH2PO40.7，K2HPO40.7，MgSO4·7H2O0.7，NaNO32.0，NaCl0.005，FeSO4·7H2O0.002，ZnSO4·7H2O0.002，MnSO4·H2O0.001，CuSO4·5H2O0～0.005，pH自然。
产酶工艺：在产酶培养基中，加入培养24h的芽孢杆菌YP1(接种浓度2×105CFU/mL)，37℃、125r/min震荡培养2～10d。发酵液离心后收集上清液，以85％饱和度硫酸铵沉淀，4000rpm冷冻离心40min后得到蛋白质沉淀，以高纯水重悬浮配，Mw3500Da透析除盐和离心除变性蛋白后以丁香醛连氮测定漆酶活力。当培养基中不含Cu2+时，上清液中基本无漆酶活性；当培养基中Cu2+浓度为10μM，培养6d时菌株YP1产漆酶活性最大。漆酶的最适反应温度和pH分别为60℃和5.0。可将冷冻干燥后得到的酶粉在-20℃保存备用。
将上述得到的酶粉加高纯水溶解，测定浓度。将聚乙烯薄膜裁成1.5cm×1.0cm和1.5cm×0.5cm尺寸的小片(约100mg)加入到磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)中，加入酶液(约0.92mg)用以处理聚乙烯薄膜，37℃、125r/min震荡下反应4d。
反应结束后取出聚乙烯小片，首先用1％SDS溶液浸泡30min，然后用蒸馏水彻底冲洗，自然干燥。分别以水接触角(WCA)、ATR-FTIR和SEM方法表征漆酶对聚乙烯的降解效果。
本发明具有以下特点：
1.在分离过程中，采用各种浓缩方法相结合，提高了实验室条件下大量培养菌株分离胞外酶的效率。
2.胞外酶的生产分离及酶对聚乙烯的处理过程不需要特殊的仪器，易操作。
3.本发明提供的芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，不仅可以应用于淀粉基聚乙烯，也可应用于石油基聚乙烯，可以应用于低密度聚乙烯(LDPE)、中密度聚乙烯(MDPE)及高密度聚乙烯(HDPE)的任何一种聚合物的氧化降解。
附图说明
图1为聚乙烯薄膜经漆酶处理前后的接触角(WCA)结果。未处理聚乙烯的WCA为98.1±2.2°；酶处理聚乙烯的WCA为69.0±5.4°；*表示两独立样本t检验p<0.001，表明酶处理前后聚乙烯薄膜的WCA有显著性差异，聚乙烯亲水性增强。
图2为聚乙烯薄膜经漆酶处理前后ATR-FTIR结果。酶处理后聚乙烯表面在1740、1660和1000～1200cm-1出现新峰。
图3为聚乙烯薄膜经漆酶处理前后的SEM照片。(a)为未处理聚乙烯，表面光滑；(b)为酶处理聚乙烯，表面出现裂缝和凹槽，有明显侵蚀现象；放大倍数均为20,000×。
具体实施方式
实施例1
向500mL的锥形瓶中装入含10μM Cu2+的发酵培养基200mL，灭菌后加入培养24h的种子液，接种浓度2×105CFU/mL；37℃、125r/min震荡培养6d。发酵完成后，将培养液分装入50mL离心管，在3500rpm、4℃下离心20min，收集上清弃去沉淀。向发酵液中缓慢加硫酸铵粉末至85％饱和度，4℃保温一夜。4000rpm、4℃离心40min，收集蛋白质沉淀，多次水重悬浮去除不溶性物质。透析脱盐后以丁香醛连氮测定漆酶活力，为43.4U/mL。漆酶的最适反应温度和pH分别为60℃和5.0。
实施例2
将聚乙烯薄膜裁成1.5cm×1.0cm和1.5cm×0.5cm大小，用1％SDS溶液浸泡30min，然后用蒸馏水彻底冲洗，自然干燥。向装有100mg聚乙烯小片的50mL锥形瓶中，加入10mL灭菌的100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)和0.1mL酶溶液(约0.92mg酶)；同样条件，未加酶溶液的作对照实验。37℃、125r/min，反应。4d后取样，用1％SDS溶液浸泡聚乙烯30min，用蒸馏水彻底冲洗，自然干燥后作表征。WCA、ATR-FTIR和SEM的结果见附图1～3。
图1接触角(WCA)的结果表明，聚乙烯薄膜经漆酶处理后表面亲疏水性质发生了显著变化，WCA减小，从98.1°降低到69.0°，聚乙烯变得相对亲水。图2ATR-FTIR可以看出，聚乙烯薄膜经漆酶处理后表面官能团发生了变化，出现了极性基团羰基C＝O。图3SEM观察表明，聚乙烯薄膜经漆酶处理后表面物理形貌发生变化，出现了裂缝、凹槽等侵蚀现象，表面变得相对粗糙。
从上述结果可以看出，本发明方法得到的胞外漆酶对聚乙烯具有氧化和降解作用，且在分离过程中采用各种浓缩方法相结合，提高了实验室条件下大量培养菌株分离聚乙烯降解酶的效率。

Claims (8)

1.芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是：在选定的含铜培养基中接种菌株，在适宜的产酶条件下发酵，通过一定的方法分离浓缩得到漆酶，再用此酶降解聚乙烯薄膜，在适宜条件下作用一定时间后取出样品，洗净后表征漆酶降解效果。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是：本发明采用的菌株为芽孢杆菌YP1(CGMCC6318，Bacillus sp.YP1)。所用种子培养基为普通肉汤培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加去离子水至1L，pH7.4±0.2)。
3.根据权利要求书1所述的芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是：聚乙烯可以是淀粉基聚乙烯，也可以是石油基聚乙烯，可以是低密度聚乙烯(LDPE)、中密度聚乙烯(MDPE)及高密度聚乙烯(HDPE)的任何一种。
4.根据权利要求书1所述的芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是：发酵产酶培养基组成为(g/L)：葡萄糖20，KH2PO40.7，K2HPO40.7，MgSO4·7H2O0.7，NaNO32.0，NaCl0.005，FeSO4·7H2O0.002，ZnSO4·7H2O0.002，MnSO4·H2O0.001，CuSO4·5H2O0～0.005，pH自然。
5.根据权利要求书1所述的芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是：发酵产酶条件为37℃、125r/min震荡培养2～10d。
6.根据权利要求书1所述的芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是：在4℃、4000rpm离心40min后得发酵上清液，再逐渐加硫酸铵粉末至85％饱和度，得蛋白质沉淀，Mw3500Da透析除硫酸铵和离心除变性蛋白后以冷冻干燥法得酶粉。
7.根据权利要求书4和5所述的芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是：当发酵培养基中Cu2+浓度为10μM，培养6d时菌株YP1产漆酶活性最大；漆酶的最适反应温度和pH分别为60℃和5.0。
8.根据权利要求书1所述的芽孢杆菌胞外漆酶降解聚乙烯的方法，其特征是：漆酶降解聚乙烯的条件为：聚乙烯薄膜100mg(裁成1.5cm×1.0cm和1.5cm×0.5cm的小片)、0.92mg酶、pH7.0、37℃、125r/min，反应4d。
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