CN108192831B

CN108192831B - 一种青霉菌及其在降解芳香族化合物中的应用

Info

Publication number: CN108192831B
Application number: CN201810073186.1A
Authority: CN
Inventors: 叶波平; 吴乐阳; 彭程
Original assignee: Nanjing Genmart Biotechnology Co ltd; China Pharmaceutical University
Current assignee: Nanjing Genmart Biotechnology Co ltd; China Pharmaceutical University
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: CN108192831A

Abstract

本发明提供了一种青霉菌，其分类命名为青霉菌(Penicillium sp.)TIBETAN2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2016228，保藏日期2016年04月26日。该青霉属菌株具有很强的抗逆性能，在较宽的温度与酸碱度范围下以及添加氯化钠与不同重金属的情况下仍能够高效、快速降解苯酚等芳香族化合物，该菌株对降解苯酚等芳香族化合物具有一定的广谱性，而对苯酚具有更高效的降解能力，而且该菌株苯酚降解功能不受葡萄糖、蔗糖、酵母提取物等其他碳源的抑制。该菌株可应用于苯酚等芳香族化合物污染的废水和土壤的生物净化处理和生物修复。

Description

一种青霉菌及其在降解芳香族化合物中的应用

技术领域

本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，特别涉及一种降解芳香族化合物中的应用。

背景技术

芳香族化合物是指含有芳香环(电子离域化的有机环)的化合物，包括苯及其衍生物，以及化学性质类似于苯的多环芳烃类和杂环芳烃类化合物。芳香族化合物广泛应用于化工、医药、冶金等行业，是许多工业生产如农药、纺织品、塑料、合成油等的副产品，也是原油中的组成成分。苯，甲苯，苯酚等单环芳烃，以及苯并芘等多环芳烃具有毒性和/或致癌性，是环境污染控制的重要指标(《污水综合排放标准(GB 8978-1996)》，《中华人民共和国环境保护税法》附表二)。因此，苯酚等芳香族污染物的降解和清除，是工业废水治理、环境保护和环境修复面临的一个重要课题。

芳香族化合物的芳香环含有偶联的大pi键，这种环状结构具有特殊的稳定性，很难在化学反应中打开，因此，芳香族化合物难以通过自发裂解或者化学裂解的方法去除。微生物可降解多种介质或环境中的芳香族化合物，并将它们转变为对人类无害的代谢产物或二氧化碳和水。微生物含有的各种加氧酶能在芳香环上引入氧基团，降低芳香环的反应势能，从而使芳香环裂解开环所需的能量降低了几个数量级，使裂解开环变得容易(Fuchs,G.,M.et al.Nat Rev Microbiol,2011.9(11):803-16)。通过微生物的代谢作用，使待处理土壤和水体中的有机污染物转化为稳定、无害的物质，这种处理方法称为生物处理法。目前，单纯物理或化学处理的方法难以完全去除这类污染物，并且物理或者化学处理方法成本较高，结合使用生物处理法，可以降低成本，更有效从环境中清除有害芳香族化合物。

许多细菌和真菌能够降解芳香族污染物，而真菌较细菌具有更强的环境耐受力，可以在更宽的温度、pH及更为苛刻的条件下生长繁殖，因而受到越来越多的关注。青霉属真菌能够产生与芳香环裂解有关的各种高活性加氧酶，这些加氧酶不仅可用于降解在地球上数量仅次于纤维素的第二类天然有机高分子木质素(以苯丙烷类为结构单元组成)，同时，还可以裂解以苯酚为代表的多种芳香族环境污染物，在化工行业的废水处理和环境污染物的生物治理方法研究中具有潜在的应用前景(Leitao,A.L.et al,Int JEnviron ResPublic Health,2009.6(4):p.1393-417.)。通过常规的功能筛选方法，目前已经获取多株可降解芳香族污染物的青霉属菌株，如：能降解4-正壬基酚(4-n-nonylphenol)并可以利用它作为唯一碳源生长的简青霉(P.simplicissimum)菌株(Zhang,Y.,et al.,Environ SciPollut Res Int,2016.23(15):15122-32)等。

环境土壤和水体具有非常复杂的理化性质，在一些遭受污染的地区，其土壤和水源中往往存在较高浓度的重金属离子或者表现为土壤的盐碱化，这些不利的因素可能会抑制微生物生长或抑制微生物的酶活性，导致微生物对污染物降解能力的下降(Sandrin,T.R.and R.M.Maier,Environ Health Perspect,2003.111(8):1093-101)。许多在实验室中被证明具有降解污染物能力的菌株，在环境土壤和水体的处理过程中并未体现良好的污染物降解效果，甚至没有效果。究其原因，可能与它们缺乏对环境不良条件的耐受性有关。因此，筛选具有各种不利环境因素耐受性的生物降解和生物修复菌株，是环境污染物生物治理的关键。

微生物在极端环境下可获得和保留对各种胁迫因素的适应性特征，从本质上看，这些适应性特征是发生在遗传水平的抗胁迫功能的适应性进化过程，可通过无性生殖的方式传递给后代以维系其种群的繁衍。极端生境下生存着对多种胁迫因素具有耐受性的微生物，例如：冻土、冰川和高山湿地等环境中生存着对低温具有耐受性的微生物，而来自于盐碱化土壤和湖泊的微生物则具有盐碱耐受性。青藏高原海拔高，是世界上低纬度冻土集中分布区，受人类活动的干预较少，在微生物种质资源的发现和利用中具有重要的地位(黄青兰等,《药物生物技术》,2016(4):308-312.)。

迄今为止，人们已经从自然界中分离出多种能够降解苯酚的真菌，其中酵母型真菌有假丝酵母(Candida sp.)(Jiang Y et al.，Biochem.Eng.J.，2005，24：243-247；JiangY et al.Biochem Eng J.2005,24:243–247)以及丝孢酵母(Trichosporon sp.)(Gaal A&HY Neujahr，J.Bacteriol.，1979，137(1)：12-31；Gaal A et al.Arch Microbiol.1981,130:54–58；Godjevargova T et al.Process Biochem.2003,38:915–20；中国专利CN200910182015)；能够降解苯酚的丝状真菌有曲霉(Aspergillus sp.)(Jones etal.Arch Microbiol 1995，163:176–181；中国专利CN201110353032)，枝孢菌(Cladosporium sp.)(中国专利CN201110353026)，镰孢菌(Fusarium sp.)(Anselmo etal.Water Sci Technol 1992，25:161–168；Santos V L&Linardi V R，ProcessBiochem.2004，39：1001-1006),粘束孢菌(Graphium sp.)(Santos et al.J BasicMicrobiol.2003，43:238–248),多变拟青霉(Paecilomyces variotii)(Wang et al.JHazard Mater.2010,183:366–371),青霉菌属(Penicillium sp.)(Leitāo et al.Int JEnviron Res Public Health.2009,6:1393–1417；Guedes et al.Biodegradation.2011，22:409–419；Wolski EA et al.WATER AIR SOIL POLL.2012,223(5):2323-32),白腐菌(white rot fungi)(Sanin S et al.Bull Environ Contam Toxicol.2005,75:466–473)等。

如上所述，已经发现多种能够降解苯酚的真菌菌株，但是，由于被芳香族污染物污染的土壤和水体环境具有复杂性特点，尽管这些已发现的菌株各自具有不同的抗逆性特征和生物降解特征，它们在应用于生物降解苯酚和生物修复时，各自具有不同的优缺点。例如：Leitāo et al发现的青霉菌属(Penicillium sp.)菌株CLONA2，其苯酚降解功能受到葡萄糖等碳源的抑制(A.L.,M.P.Duarte,and J.S.Oliveira."Degradation ofphenol by a halotolerant strain of Penicillium chrysogenum."InternationalBiodeterioration&Biodegradation 59.3(2007):220-225.)，这种特征限制了它在受苯酚污染的土壤和水体的生物净化和生物修复中的应用。因此，从自然界发现更多具有降解苯酚功能和抗逆功能的菌株，并对已有菌株、降解相关基因和酶类进行人工干预和基因工程操作，以获得可用于环境生态修复的优良菌株，成为微生物和环境生态领域很重要的任务之一。

发明内容

发明目的：本发明目的是针对苯酚等芳香族化合物污染对水体和土壤造成的严重危害，提供了一株青霉菌，该菌株应用于工业废水和受污染土壤、水体的生物治理与生物修复。

技术方案：本发明为实现上述技术目的，采用如下的技术方案：本发明提供了一种青霉菌，其分类命名为青霉菌(Penicillium sp.)TIBETAN2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，邮政编码为430072，保藏编号为：CCTCCM 2016228，保藏日期2016年04月26日。

本发明所述真菌菌株的筛选分离方法是，在以苯酚为唯一碳源的合成培养基中，对从青藏高原高山草甸土壤中的微生物进行筛选，获得的菌株做进一步分离鉴定和菌株纯化以及功能和特征研究，其中获得的青霉属菌株TIBETAN2，在实验室传代10代后具有形态和遗传稳定性。

具体地，土壤样品采自青海湖周边海拔3000-3500m、表层50cm处的草原或草甸地区的土壤，土壤悬液涂布于含3mM苯酚的矿物质盐琼脂培养基(MSM)上，28℃倒置培养2-7天。将单菌落接种到高氏1号培养基进行纯化，获得纯培养物。共筛选到27株具有在含3mM苯酚的MSM琼脂培养基中生长能力的菌株，其中8株根据形态特征确定为真菌，它们被分别命名为菌株TIBETAN1-8。其中，菌株TIBETAN2生长迅速、旺盛，而且能产大量孢子，在生长势上比其他真菌显示出了明显的优势。本发明以其为目标菌株，开展了分子鉴定和形态鉴定，确定该菌株属于青霉属(Penicillium sp.)真菌菌株。

该菌株在CA琼脂培养基中于25℃培养7天后菌落直径为2.5-3.0厘米，表面呈暗灰绿色，有黄色浸出液产生，边缘处呈白色，菌落背面和靠近菌落培养基呈黄色(见图1)，菌丝致密，绒毛状，有扫帚状分支；分生孢子梗发生于基质，叶柄壁平滑，(130-360)×(2.6-3.3)微米(长×宽)；帚状丝三轮生，少量双轮生；分枝2-3个；安剖形瓶梗，每轮2-7个，(6.0-8.7)×(2.2-2.8)微米(长×宽)；孢子球形或近球形，光滑，(2.6-3.0)×(2.3-2.7)微米(长×宽)(图2，图3)；该菌株可在4-37℃、0-3.5M/L氯化钠浓度、pH 2.5-11.5范围下生长并对浓度为0-17.5mM/L的铅离子、浓度为0-10.0mM/L的镉离子、浓度为0-15.0mM/L的铜离子、浓度为0-25.0mM/L的锌离子具有耐受性。

本发明所述青霉属菌株TIBETAN2基因组中内转录间隔区(ITS)、β-微管蛋白(BenA)、钙调蛋白(CaM)及RNA聚合酶大亚基2(RPB2)基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。该菌株的ITS序列是鉴定该菌株的主要特征依据，依据ITS、BenA、CaM和RPB2序列构建的TIBETAN2菌株系统发育树见图4。

本发明还提供了上述青霉菌在降解芳香族化合物中的应用。

所述应用，所述芳香族化合物包括苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸和萘。

根据环境部门制定的污染控制的指标(《污水综合排放标准(GB 8978-1996)》，《中华人民共和国环境保护税法》附表二)，筛选其中可作碳源利用的芳香族化合物。结果显示，菌株TIBETAN2在以0.5mM-3mM苯、甲苯、氯苯、苯酚、萘、硝基苯和2，4-二氯苯氧乙酸为唯一碳源的MSM固体培养基上均能生长，其中以在含苯酚、萘、苯、甲苯的MSM固体培养基上生长状态最佳，而在含有硝基苯、氯苯、2，4-二氯苯氧乙酸的MSM培养基上生长相对较弱。

本发明所述菌株TIBETAN2，在含不同浓度(0.0-10mM)苯酚的MSM培养基中25℃振荡培养6d后菌株的生物量(图4)，低浓度(0.5-2.5mM)的苯酚在一定程度上可以促进菌株的生长，并在2.5mM浓度时达到最高；其后，随着培养基中苯酚含量的升高，菌株的生物量逐步下降，并在10mM浓度时基本停止了生长。由此推测菌株TIBETAN2可降解苯酚的范围为0-5mM，以2.5mM苯酚降解能力最强。

本发明所述菌株TIBETAN2在15-35℃和/或pH 2.5-11.5下都表现出稳定的苯酚降解能力，该菌的最佳生长和降解条件为：25℃，pH 8.0(图6，图7)。

所述应用，所述青霉菌在仅有芳香族化合物为唯一碳源的环境中生长并降解芳香族化合物，或者在含有有机碳源和/或氮源与芳香族化合物为共同碳源的环境中生长并降解芳香族化合物。

优选地，生长环境中还包括浓度为0-17.5mM/L的铅离子、浓度为0-10.0mM/L的镉离子、浓度为0-15.0mM/L的铜离子和/或浓度为0-25.0mM/L；所述生长环境中还包括重量百分比0.5％-3.5％蔗糖和/或重量百分比0.5％-3.5％葡萄糖和/或重量百分比0.5％-3.5％酵母提取物；所述生长环境中还包括重量百分比0％-7.5％NaCl，或在同等盐胁迫条件下进行；生长条件为：15～35℃和/或pH 2.5～11.5。

所述应用，所述青霉菌在添加芳香族化合物为唯一碳源的无机盐培养基中生长并降解芳香族化合物，或者在添加有机碳源和/或氮源与芳香族化合物为共同碳源的无机盐培养基中生长并降解芳香族化合物。

优选地，生长环境中还包括浓度为0-17.5mM/L的铅离子、浓度为0-10.0mM/L的镉离子、浓度为0-15.0mM/L的铜离子和/或浓度为0-25.0mM/L；所述生长环境中还包括重量百分比0.5％-3.5％蔗糖和/或重量百分比0.5％-3.5％葡萄糖和/或重量百分比0.5％-3.5％酵母提取物；所述生长环境中还包括重量百分比0％-7.5％NaCl，或在同等盐胁迫条件下进行；所述无机盐培养基为3.78g Na₂HPO₄·12H₂O，0.5g KH₂PO₄，5.0g NH₄Cl，0.2g MgSO₄·7H₂O，加蒸馏水溶至1000ml,自然pH，121℃下灭菌20min；培养条件为：15～35℃和/或pH2.5～11.5。

本发明分析了所述菌株TIBETAN2在添加0.5％的不同碳源(葡萄糖、蔗糖或酵母提取物)后对2.5mM苯酚的降解能力，证明不同类型的碳源对菌株TIBETAN2降解苯酚的能力没有明显的影响(图9)，而已报道的部分可降解苯酚微生物在存在有其他碳源时出现苯酚降解活性被抑制的情况(A.L.,M.P.Duarte,and J.S.Oliveira.Degradation ofphenol by a halotolerant strain of Penicilliumchrysogenum.InternationalBiodeterioration&Biodegradation 59.3(2007):220-225.；Bastos,A.E.,et al.Salt-tolerantphenol-degrading microorganisms isolated from Amazoniansoilsamples.Archives of Microbiology174.5(2000):346-352.)。菌株TIBETAN2在添加有0.5％-3.5％蔗糖的培养基中生长时，该浓度范围内的蔗糖对菌株TIBETAN2降解苯酚的能力没有明显的影响(图10)。

本发明所述菌株TIBETAN2在含有0.5-3.5 M NaCl的察氏琼脂培养基(Czapek-Doxagar，CA培养基)上均能生长，随着培养基中盐浓度的升高，菌落的直径明显缩小，该菌株仍可耐受3.5 M的NaCl(约20.5％NaCl)。菌株TIBETAN2在含有终浓度为0-10％NaCl的培养基(含2.5 mM苯酚)中培养时均具有苯酚降解能力，且以在NaCl浓度等于或小于7.5％(约1.28 M/L)的条件下苯酚降解最强(图11)。本发明测定了菌株TIBETAN2在含有不同浓度重金属离子的察氏琼脂培养基(Czapek-Dox agar，CA培养基)上的生长状况，发现菌株TIBETAN2能在极限浓度分别为17.5 mM、9.0 mM、3.0 mM和25.0 mM的Pb²+、Cd²+、Cu²+和Zn²+的环境中生长。检测了菌株TIBETAN2在添加有不同终浓度重金属离子(Pb²+15.0 mM，Cd²+6.0 mM，Cu²+10.0 mM，Zn²+12.5 mM)的培养基中对2.5 mM苯酚的降解能力，结果证明：菌株TIBETAN2在四种重金属离子所选取的终浓度下仍可快速地降解苯酚。相比较而言，菌株TIBETAN2在15.0 mM Pb²+浓度下的苯酚降解能力受到轻微程度的抑制(图12)。

本发明还提供了青霉菌在治理含有芳香族污染物的土壤和水体中的应用。

本发明还提供了青霉菌在治理含有芳香族残留的化工企业废水处理中的应用。

有益效果：本发明的优势是，本发明中的具有降解苯酚等芳香族化合物功能的青霉属菌株TIBETAN2具有很强的抗逆性能，可在4-37℃,0-3.5 M/L氯化钠浓度与pH2.5-11.5范围下生长并对铅离子(0-17.5 mM/L)、镉离子(0-10.0 mM/L)、铜离子(0-15.0mM/L)、锌离子(0-25.0 mM/L)等重金属具有耐受性。该青霉属菌株在较宽的温度(15-35℃)和/或酸碱度(pH 2.5-11.5)和/或添加不同浓度的NaCl(0-7.5％)和/或不同种类、浓度重金属离子如：铅离子(0-15.0 mM/L)、镉离子(0-6.0 mM/L)、铜离子(0-10.0 mM/L)、锌离子(0-12.5mM/L)等的情况下仍能够高效、快速降解苯酚等芳香族化合物。该菌株降解苯酚等芳香族化合物具有一定的广谱性，对苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸、萘等芳香族化合物具有高效的降解能力，而且该菌株对苯酚等芳香族化合物的降解功能不受葡萄糖、蔗糖、酵母提取物等其他碳源的抑制。因此，菌株TIBETAN2可以应用于在含有不同碳源的净化池中，净化处理不同温度与pH条件下，含有较高NaCl浓度(或相应的渗透胁迫环境)或含有部分重金属离子的受苯酚类化合物污染的土壤、水体。由于本发明的青霉属菌株TIBETAN2具有良好的环境适应性和生长特征，本身在环境中广泛存在，在环境释放时不会造成环境污染，是良好的受苯酚等芳香族化合物污染土壤的生物净化微生物。

具体地说，它涉及一株青霉属菌株TIBETAN2(Penicillium sp.strainTIBETAN2)，中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 2016228；该青霉属菌株具有很强的抗逆性能，可在4-37℃,0-3.5M/L氯化钠浓度与pH 2.5-11.5范围下生长并对铅离子(0-17.5mM/L)、镉离子(0-10.0mM/L)、铜离子(0-15.0mM/L)、锌离子(0-25.0mM/L)等重金属具有耐受性。该青霉属菌株在较宽的温度(15-35℃)和/或酸碱度(pH 2.5-11.5)和/或添加不同浓度的NaCl(0-7.5％)和/或不同种类、浓度重金属离子如：铅离子(0-15.0mM/L)、镉离子(0-6.0mM/L)、铜离子(0-10.0mM/L)、锌离子(0-12.5mM/L)等的情况下仍能够高效、快速降解苯酚等芳香族化合物。该菌株降解苯酚等芳香族化合物具有一定的广谱性，对苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸、萘等芳香族化合物具有高效的降解能力，而且该菌株对苯酚等芳香族化合物的降解功能不受葡萄糖、蔗糖、酵母提取物等其他碳源的抑制。该菌株在以苯酚为唯一碳源生长时，先将苯酚通过苯酚羟化酶氧化成邻苯二酚，然后在菌株产生的邻苯二酚-1,2-双加氧酶的作用下，通过邻位开环的方式，将邻苯二酚开环成烃类，从而进一步被降解利用。该菌株适用于生产苯酚等芳香族化合物的工业废水的生物处理和对含有苯酚等芳香族污染物污染的土壤和水体的生物修复(生物整治)

该菌株降解苯酚等芳香族化合物具有一定的广谱性，对苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸、萘等芳香族化合物具有高效的降解能力，而且该菌株对苯酚等芳香族化合物的降解功能不受葡萄糖、蔗糖、酵母提取物等其他碳源的抑制。该菌株在以苯酚为唯一碳源生长时，先将苯酚通过苯酚羟化酶氧化成邻苯二酚，然后在菌株产生的邻苯二酚-1,2-双加氧酶的作用下，通过邻位开环的方式，将邻苯二酚开环成直链烃类，再进一步被菌株降解利用。该菌株适用于生产苯酚等芳香族化合物化工企业的工业废水的生物处理和对受苯酚等芳香族化合物污染土壤、水体的生物修复(生物整治)。

附图说明

图1为青霉属菌株TIBETAN2在CA琼脂培养基中25℃静置培养7天后的菌落形态；

图2为青霉属菌株TIBETAN2在CA琼脂培养基中25℃静置培养3天后光学显微镜下分生孢子梗形态；

图3为青霉属菌株TIBETAN2在CA琼脂培养基中25℃静置培养3天后光学显微镜下分生孢子形态；

图4为青霉属菌株TIBETAN2在含不同终浓度苯酚的MSM培养基中25℃振荡培养6天后菌株的生物量与苯酚降解情况；

图5为基于ITS、BenA、CaM及RPB2基因序列分析基础上的青霉属菌株TIBETAN2系统发育树；

图6为不同温度对青霉属菌株TIBETAN2苯酚降解能力的影响；

图7为不同pH对青霉属菌株TIBETAN2苯酚降解能力的影响；

图8为不同苯酚初始浓度下青霉属菌株TIBETAN2苯酚降解能力的变化；

图9为0.5％葡萄糖、蔗糖或酵母提取物对青霉属菌株TIBETAN2苯酚降解能力的影响；

图10为不同浓度蔗糖对青霉属菌株TIBETAN2苯酚降解能力的影响；

图11为不同浓度NaCl对青霉属菌株TIBETAN2苯酚降解能力的影响；

图12为不同重金属离子对青霉属菌株TIBETAN2苯酚降解能力的影响；

图13为青霉属菌株TIBETAN2对不同芳香族化合物的降解活性；

图14为青霉属菌株TIBETAN2对苯酚的降解曲线以及生物量曲线；

图15为青霉属菌株TIBETAN2对萘的降解曲线以及生物量曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施例用于说明本发明，但是不用来限制本发明的范围。

实施例1青霉属菌株TIBETAN2的分离与菌种纯化

本发明提供了一株耐盐、耐重金属且具有降解芳香族化合物功能的菌株，该菌株为从青藏高原高山草甸土壤中分离获得，属于青霉属(Penicillium sp.)，在实验室传代至10代后仍具有遗传稳定性。本发明耐盐、耐重金属且具有降解芳香族化合物功能的菌株的分离方法如下：

取采集自青海湖周边高山草甸的新鲜土壤样品13份，剔除其中的枯枝杂草及直径大于5mm的石块。称取各土样2.5g，分别加入到装有22.5mL无菌生理盐水、十几颗小玻璃珠及终浓度为10mM的苯酚的三角瓶中，25℃，150rpm摇床震荡培养30分钟后，取土壤悬液，以此为稀释度1，然后按10倍倍比进行稀释，稀释度分别为10^-3、10^-4、10^-5。取750ul的10^-3、10^-4、10^-5土壤悬液涂布于含3mM/L苯酚的无机盐琼脂培养基上(MSM)，25℃静置培养2-7天待菌落大小长至1-2mm时，将单菌落划线接种到高氏1号固体培养基上进行纯化，直至获得纯培养物单菌落。将各纯培养物接种到含3mM/L苯酚的无机盐琼脂培养基上培养2-7天，获得阳性菌菌株TIBETAN1-27，经纯培养后，用MSM固体培养基4℃保存。其中，所述的无机盐琼脂培养基成分为3.78g Na₂HPO₄·12H₂O，0.5g KH₂PO₄，5.0g NH₄Cl，0.2g MgSO₄·7H₂O，加蒸馏水溶至1000mL,自然pH，121℃下灭菌20min。所述的高氏1号液体培养基成分为20.0g可溶性淀粉，1g KNO₃，0.5g NaCl，0.5g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄，0.01g FeSO₄，加蒸馏水溶至1000mL，调节pH至7.2-7.4，121℃下灭菌20min。

根据中华人民共和国环境保护部公布的环境污染物检测目录，目前芳香族化合物污染物主要有挥发性芳香烃类、酚类、多环芳烃类、硝基苯类及苯氧羧酸类五大类，分别选取苯、甲苯、氯苯、苯酚、萘、硝基苯及2，4-二氯氧乙酸作为代表性污染物进行菌株生物降解能力的进一步评测。

将前述通过苯酚平板初步筛选获得的阳性菌株TIBETAN1-27分别接种在含有3mM/L苯酚的MSM琼脂培养基上，25℃静置培养7天后，将活化的菌株分别接种到含有0.5mM或3mM/L的不同种类单一芳香族化合物的MSM琼脂培养基上，25℃静置培养7天，观察生长状态并记录。

结果表明，在所有27个菌株中，菌株TIBETAN2在以0.5mM或3.0mM硝基苯、苯酚、萘、苯、甲苯、氯苯或2，4-二氯苯氧乙酸为唯一碳源的MSM固体培养基上均能生长，其中以在含苯酚、萘、苯、甲苯的MSM固体培养基上生长状态最佳，而在含有硝基苯、氯苯、2，4-二氯苯氧乙酸的MSM培养基上生长相对较弱。其它菌株在上述培养基上培养时的生长相对较弱。

实施例2菌株TIBETAN2的形态特征与分子鉴定

菌株接种于查氏(CA)琼脂培养基上，于25℃，静置培养7天后，挑取单菌落，按Ultraclean^TMMicrobial DNA isolation Kit(USA,MOBIO)说明书提取基因组DNA，保存于4℃，作为PCR反应的模板。扩增TIBETAN2的ITS、BenA、CaM和RPB2基因的上下游引物序列分别如下：

ITS基因：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′与ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；BenA基因：Bt2a：5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′与Bt2b：5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′；CaM基因：CMD5：5′-CCGAGTACAAGGARGCCTTC-3′与CMD6：5′-CCGATRGAGGTCATRACGTGG-3′；RPB2基因：5Feur：5′-GAYGAYCGKGAYCAYTTCGG-3′与7CReur：5′-CCCATRGCYTGYTTRCCCAT-3′。

扩增ITS,BenA和CaM序列的PCR反应程序为：94℃预变性5min后，按照94℃变性35s、55℃退火45s和72℃延伸45s进行35个循环，最后72℃延伸7min结束反应。

扩增RPB2序列的PCR反应程序为：94℃预变性5min后，按照94℃变性35s、48℃退火45s和72℃延伸60s进行5个循环，94℃变性35s、50℃退火45s和72℃延伸60s进行5个循环，94℃变性35s、52℃退火45s和72℃延伸60s进行30个循环，最后72℃延伸7min结束反应。

将PCR产物进行测序(于南京金斯瑞生物科技有限公司完成)，测序结果见序列表。

将菌株TIBETAN2的ITS、BenA、CaM和RPB2序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号分别为KX230124、KX230125、KX230126和KX230127。将上述序列同Genbank中的基因序列进行BLAST分析，发现该菌株与青霉属(Penicillium)真菌菌株最为接近。为了进一步确定鉴定结果，进行形态学鉴定。

菌株TIBETAN2在CA琼脂培养基中25℃静置培养7天后的菌落直径为2.5-3.0cm。菌落表面呈暗灰绿色，有黄色浸出液产生，菌落背面和培养基呈黄色，边缘处呈白色，菌丝致密，绒毛状，有扫帚状分支。分生孢子梗发生于基质，叶柄壁平滑，130-360×2.6-3.3微米；帚状丝三轮生，少量双轮生；分枝2-3个；安剖形瓶梗，每轮2-7个，6.0-8.7×2.2-2.8微米；孢子球形或近球形，光滑，2.6-3.0×2.3-2.7微米。根据《中国真菌志》的描述进行比对与分析，发现菌株TIBETAN2的形态特征与青霉属真菌相近，基于其ITS、BenA、CaM和RPB2序列等均与青霉属真菌相近，故确定该菌株属于青霉属(Penicillium sp.)真菌。

所述察氏琼脂培养基(Czapek-Dox agar，CA)：3.0g NaNO₃，30.0g蔗糖，1.3gK₂HPO₄·3H₂O，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.5g KCl，0.01g FeSO₄·7H₂O，0.005g CuSO₄·5H₂O，0.01g ZnSO₄·7H₂O，20.0g琼脂，加蒸馏水溶至1000mL，调节pH至6.3±0.2，121℃下灭菌20min。

实施例3青霉属菌株TIBETAN2对苯酚生物降解活性的检测与抗逆性分析

1.不同温度下菌株TIBETAN2对苯酚的生物降解特性

在不同温度下实施菌株TIBETAN2对苯酚的降解实验，发现其在15-35℃具有较高且稳定的降解苯酚的能力，从实际应用角度看，25℃为最佳温度，此时苯酚的去除率最高。具体实施步骤如下：分别取150mL液体无机盐培养基(含终浓度为2.5mM/L的苯酚)分装至30个500mL的锥形瓶中，灭菌，分成两组，每组15瓶。将菌株TIBETAN2接种至CA液体培养基25℃振荡培养2天，取50mL液体培养基离心获得菌株，用无菌生理盐水清洗2-3次，再用50mL生理盐水重悬。根据抽滤再称重获得每毫升生理盐水中的菌株湿重，其中一组于每瓶中按比例添加一定体积的菌悬液至最终添加接种量为3％(即4.5mL/150mL)，根据称重的每毫升生理盐水中的菌株湿重计算出每150mL大约接种0.015g菌株，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的摇床中200rpm培养；以不加菌株的培养基分别置于对应的温度同时培养，作为空白对照。每个温度设置3个平行，培养48h后，取培养液，利用HPLC检测苯酚的浓度，绘制苯酚的去除率曲线图(图6)，结果证明：在15-35℃范围内，菌株TIBETAN2均具有较高且稳定的降解苯酚的能力，培养48h后对苯酚的去除率高达95％以上，证明菌株TIBETAN2能够在较广的温度范围下保持高效的苯酚降解活性。该菌株最适生长温度为20-30℃。

2.不同pH下菌株TIBETAN2对苯酚的降解特性

在不同pH下实施菌株TIBETAN2对苯酚的降解实验，结果表明，该菌株在pH 4-10仍能高效、快速地降解苯酚，而最佳的降解pH值为8.0。具体实施方案如下：在12个500mL的锥形瓶中加入150mL等量的液体无机盐培养基，终浓度为2.5mM/L的苯酚作为唯一碳源，分别调节培养基中的pH至2.5、4.0、6.0、8.0、10.0、11.5；以不加菌株的相同的培养基作为空白对照。每个pH值设置3组平行。将菌株TIBETAN2接种至CA液体培养基25℃振荡培养2天，取50mL液体培养基离心获得菌株，用无菌生理盐水清洗2-3次，再用50mL生理盐水重悬。根据抽滤再称重获得每毫升生理盐水中的菌株湿重，其中一组于每瓶中按比例添加一定体积的菌悬液至最终添加接种量为3％(即4.5mL/150mL)，根据称重的每毫升生理盐水中的菌株湿重计算出每150mL大约接种0.015g菌株，在25℃，200rpm下培养。培养48h后，HPLC法检测培养体中的苯酚浓度，绘制苯酚去除率曲线图(图7)。结果证明：在pH为2.5、4.0、6.0、8.0、10.0、11.5时，菌株TIBETAN2均具有较高且稳定的降解苯酚的能力，且在pH4.0-10.0范围内，培养48h后对苯酚的去除率都在90％以上。说明菌株能够在较广的pH值范围下保持高效的苯酚降解活性。该菌株生长的最适pH值为8.0。

3.菌株TIBETAN2对不同终浓度苯酚的降解活性

在不同苯酚终浓度下，实施菌株TIBETAN2对苯酚降解活性的分析，结果证明菌株TIBETAN2对苯酚的耐受浓度为5.0mM/L。具体实施方案如下：在500mL的厌氧瓶中加入150mL的液体无机盐培养基，苯酚作为唯一碳源。苯酚的终浓度分别设置为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和5.0mM/L。将菌株TIBETAN2接种至CA液体培养基25℃振荡培养2天，取50mL液体培养基离心获得菌株，用无菌生理盐水清洗2-3次，再用50mL生理盐水重悬。根据抽滤再称重获得每毫升生理盐水中的菌株湿重，其中一组于每瓶中按比例添加一定体积的菌悬液至最终添加接种量为3％(即4.5mL/150mL)，根据称重的每毫升生理盐水中的菌株湿重计算出每150mL大约接种0.015g菌株，在25℃，200rpm下培养。间隔24h取培养液，HPLC法检测培养体中的苯酚浓度，绘制菌株TIBETAN2对苯酚的降解曲线图(图8)，结果证明：在培养基中的苯酚终浓度低于5.0mM/L时，菌株TIBETAN2可快速地降解苯酚，而在5.0mM/L时，菌株TIBETAN2的苯酚降解活性受到明显抑制，完全降解时间明显延长。

4.不同碳源对菌株TIBETAN2苯酚降解活性的影响

在添加其他不同种类(蔗糖、葡萄糖、酵母提取物)与不同浓度(0.5％、1.5％、2.5％、3.5％)的碳源下，实施菌株TIBETAN2对苯酚的降解，结果证明：菌株TIBETAN2在添加其他碳源的情况下，其苯酚降解活性并未受到明显的抑制。具体实施方案如下：在500mL的厌氧瓶中加入150mL的液体无机盐培养基，添加苯酚至初始终浓度为2.5mM/L，再分别添加0.5％蔗糖、1.5％蔗糖、2.5％蔗糖、3.5％蔗糖、0.5％葡萄糖或0.5％酵母提取物。将菌株TIBETAN2接种至CA液体培养基25℃振荡培养2天，取50mL液体培养基离心获得菌株，用无菌生理盐水清洗2-3次，再用50mL生理盐水重悬。根据抽滤再称重获得每毫升生理盐水中的菌株湿重，其中一组于每瓶中按比例添加一定体积的菌悬液至最终添加接种量为3％(即4.5mL/150mL)，根据称重的每毫升生理盐水中的菌株湿重计算出每150mL大约接种0.015g菌株，在25℃，200rpm下培养。间隔24h取培养液，HPLC法检测培养体中的苯酚浓度，绘制菌株TIBETAN2对苯酚的降解曲线图9，图10)，结果证明：添加其他不同种类与不同浓度的碳源对菌株TIBETAN2降解苯酚的能力并无明显影响，培养液中的苯酚都在72h以内降解完全。

5.不同NaCl浓度对菌株TIBETAN2降解苯酚活性的影响

接种2.0μL半固体孢子悬液到含有不同浓度NaCl的CA固体培养基上，每种浓度设置3个平行，25℃黑暗倒置培养7天，观察生长状态、拍照并记录菌落直径。

半固体孢子悬液制备方法:无菌蒸馏水冲洗活化菌株TIBETAN2的孢子，加入0.2％的琼脂和0.05％的吐温80，充分混匀，调节孢子浓度为1×10⁶个/mL，4℃保存，24h内使用。菌株盐耐受试验结果见表1。

表1NaCl浓度对青霉属菌株TIBETAN2生长的影响

表1结果表明，菌株TIBETAN2在含有0.5-3.5M NaCl的CA培养基上均能生长，但伴随着培养基中盐浓度的升高，菌落的直径明显缩小，暗示盐浓度对菌株的生长具有明显的影响，但该菌株仍可耐受3.5M的NaCl。

在不同NaCl浓度下实施菌株TIBETAN2对苯酚的降解实验，结果表明，该菌株在0％-7.5％NaCl浓度下仍能高效、快速地降解苯酚，其降解苯酚的活性对NaCl的耐受浓度为7.5％(约1.28M/L)。具体实施方案如下：在15个500mL的厌氧瓶中分别加入150mL等量的液体无机盐培养基，以终浓度为2.5mM/L的苯酚作为唯一碳源。向厌氧瓶中分别添加NaCl至终浓度0％、2.5％、5.0％、7.5％、10.0％；同时准备15瓶相同的培养基作为空白对照。每个浓度值设置3组平行。将菌株TIBETAN2接种至CA液体培养基25℃振荡培养2天，取50mL液体培养基离心获得菌株，用无菌生理盐水清洗2-3次，再用50mL生理盐水重悬。根据抽滤再称重获得每毫升生理盐水中的菌株湿重，其中一组于每瓶中按比例添加一定体积的菌悬液至最终添加接种量为3％(即4.5mL/150mL)，根据称重的每毫升生理盐水中的菌株湿重计算出每150mL大约接种0.015g菌株，在25℃，200rpm下培养。每隔24h取发酵液，HPLC法检测培养液中的苯酚含量，绘制苯酚去除率曲线图(图11)，结果证明：在NaCl浓度低于7.5％(约1.28M/L)时，菌株TIBETAN2仍可快速降解苯酚，而当NaCl浓度为10.0％(约1.71M/L)时，苯酚的降解受到明显抑制。

5.重金属离子对菌株TIBETAN2降解苯酚活性的影响

将孢子悬液接种到含有不同浓度、不同种类重金属离子(Pb²+、Cd²+、Cu²+、Zn²+)的CA琼脂培养基上，每种浓度设置3个平行，25℃黑暗倒置培养7天，观察生长状态、拍照并记录菌落直径。菌株在含有不同浓度重金属离子Pb²+、Cd²+、Cu²+和Zn²+的CA培养基中的生长情况见表2,3,4,5。

表2青霉属TIBETAN2菌株在不同Pb²+浓度下的生长情况

表2结果证明，在培养基中的Pb²+浓度介于0-12.5mM时，菌株的生长(以菌落大小判断)基本不受影响，但当浓度达到15.0mM及以上时，菌株的生长受到明显的抑制。根据菌株TIBETAN2在不同浓度Pb²+下的生长状况，推测菌株TIBETAN2能耐受的最高Pb²+浓度为17.5mM。

表3青霉属TIBETAN2菌株在不同Cd²+浓度下的生长情况

表3结果证明，Cd²+对菌株TIBETAN2的生长具有显著的抑制作用，随着Cd²+离子浓度的增加，这种抑制作用加强。根据菌株在不同浓度下的生长状况，确定该菌株能耐受的最高Cd²+浓度为9.0mM。显微观察结果显示，Cd²+对菌株的抑制作用可能主要是抑制孢子的产生(图略)。

表4青霉属TIBETAN2菌株在不同Cu²+浓度下的生长情况

表4结果证明，Cu²+对菌株TIBETAN2的生长有一定的影响，低浓度(0-2.5mM)的Cu²+对菌株生长的抑制作用相对微弱，当浓度继续升高时，菌株的生长明显受到抑制。根据菌株在不同Cu²+离子浓度下的生长状况，推测其对Cu²+的最高耐受浓度为15.0mM。

表5青霉属TIBETAN2菌株在不同Zn²+浓度下的生长情况

表5结果证明，菌株TIBETAN2的生长对Zn²+浓度非常敏感，2.5mM Zn²+对菌株的生长具有相对较强的促进作用，但随着培养基中Zn²+离子浓度的继续升高，菌株生长能力迅速下降，显微镜下可见分生孢子数目明显减少，Zn²+离子浓度达到20.0mM以上时，尽管可见有菌丝体的生长，但已观测不到分生孢子。根据菌株TIBETAN2在不同Zn²+离子浓度下的生长状况，推测其对Zn²+的最高耐受浓度为25.0mM。

根据菌株在含有不同浓度、不同种类重金属离子(Pb²+、Cd²+、Cu²+、Zn²+)的CA培养基上的生长情况，选取菌株直径在10.0mm左右对应的重金属浓度，检测该浓度下苯酚的降解情况，具体实施方案如下：在12个500mL的厌氧瓶中加入150mL等量的液体无机盐培养基，以终浓度为2.5mM/L的苯酚作为唯一碳源，分别添加不同种类的重金属离子(Pb²+、Cd²+、Cu²+、Zn²+)，其中Pb²+15.0mM、Cd²+6.0mM、Cu²+10.0mM、Zn²+12.5mM；以相同的不接种菌株的培养基作为空白对照；准备3瓶没有添加任何重金属的培养基作为阳性对照。每个浓度值设置3组平行。将菌株TIBETAN2接种至CA液体培养基25℃振荡培养2天，取50mL液体培养基离心获得菌株，用无菌生理盐水清洗2-3次，再用50mL生理盐水重悬。根据抽滤再称重获得每毫升生理盐水中的菌株湿重，其中一组于每瓶中按比例添加一定体积的菌悬液至最终添加接种量为3％(即4.5mL/150mL)，根据称重的每毫升生理盐水中的菌株湿重计算出每150mL大约接种0.015g菌株，在25℃，200rpm下培养。每隔24h取培养液，HPLC法检测培养液中的苯酚含量，绘制苯酚去除率曲线图(图12)，证明菌株TIBETAN2在四种重金属离子存在的情况下仍可快速地降解苯酚。相比较而言，菌株TIBETAN2在15.0mM Pb²+浓度下的苯酚降解能力受到轻微程度的抑制。

实施例4菌株TIBETAN2对不同种类芳香族化合物的降解活性分析

在15个500mL的锥形瓶中加入150mL的液体无机盐培养基，分别以终浓度2.5mM/L的邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸或萘作为唯一碳源。以不加菌株的培养基作为空白对照。每种芳香族化合物进行3组平行。将菌株TIBETAN2接种至CA液体培养基25℃振荡培养2天，取50mL液体培养基离心获得菌株，用无菌生理盐水清洗2-3次，再用50mL生理盐水重悬。根据抽滤再称重获得每毫升生理盐水中的菌株湿重，其中一组于每瓶中按比例添加一定体积的菌悬液至最终添加接种量为3％(即4.5mL/150mL)，根据称重的每毫升生理盐水中的菌株湿重计算出每150mL大约接种0.015g菌株，在25℃，200rpm下培养。培养48h后取培养液，分别利用HPLC法检测邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸或萘的含量(图13)。

结果证明：培养48h后，菌株TIBETAN2对邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸、萘的去除率分别为94％、92％、67％、72％、52％。

实施例5菌株TIBETAN2对苯酚与萘的生物降解性能以及生物量检测

在9个500mL的锥形瓶中加入150mL的液体无机盐培养基，分别以终浓度2.5mM/L的苯酚或萘作为唯一碳源。以不加菌株的培养基作为空白对照。苯酚或萘分别进行3组平行实验。将菌株TIBETAN2接种至CA液体培养基25℃振荡培养2天，取50mL液体培养基离心获得菌株，用无菌生理盐水清洗2-3次，再用50mL生理盐水重悬。根据抽滤再称重获得每毫升生理盐水中的菌株湿重，其中一组于每瓶中按比例添加一定体积的菌悬液至最终添加接种量为3％(即4.5mL/150mL)，根据称重的每毫升生理盐水中的菌株湿重计算出每150mL大约接种0.015g菌株，在25℃，200rpm下培养，每隔24h取培养液，利用HPLC法检测苯酚或萘的含量；同时，取20mL培养液抽滤，烘干后称重并记录为生物量。

绘制菌株TIBETAN2对苯酚或萘的降解曲线和生长曲线(图14，图15)，结果证明，随着培养时间的延长，菌株TIBETAN2的生物量明显增加，并分别在培养70h或96h后与对应的不加苯酚或萘的对照培养一致，而于此同时，培养液中的苯酚或萘的含量明显下降，其中，菌株TIBETAN2可在60h内完全降解初始终浓度为2.5mM苯酚，或96h内完全降解初始终浓度为2.5mM的萘。

序列表

<110> 中国药科大学

南京晶玛生物科技有限公司

<120> 一株青霉属菌株及其在苯酚等芳香族污染物降解中的应用

<130> 188390621

<140> 2017103776249

<141> 2017-05-27

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 533

<212> DNA

<213> 青霉属菌株TIBETAN2(Penicillium sp.strain TIBETAN2)

<400> 1

acctcccacc cgtgtttatt ttaccttgtt gcttcggcgg gcccgcctta actggccgcc 60

ggggggctta cgcccccggg cccgcgcccg ccgaagacac cctcgaactc tgtctgaaga 120

ttgtagtctg agtgaaaata taaattattt aaaactttca acaacggatc tcttggttcc 180

ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga tacgtaatgt gaattgcaaa ttcagtgaat 240

catcgagtct ttgaacgcac attgcgcccc ctggtattcc ggggggcatg cctgtccgag 300

cgtcattgct gccctcaagc acggcttgtg tgttgggccc cgtcctccga tcccggggga 360

cgggcccgaa aggcagcggc ggcaccgcgt ccggtcctcg agcgtatggg gctttgtcac 420

ccgctctgta ggcccggccg gcgcttgccg atcaacccaa attttttatc caggttgacc 480

tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag gaa 533

<210> 2

<211> 479

<212> DNA

<213> 青霉属菌株TIBETAN2(Penicillium sp.strain TIBETAN2)

<400> 2

ggtaaccaaa tcggtgctgc tttctggtaa gtctcggagc ttttttttcg cgttgggtat 60

caattgacaa gttgctaact ggattacagg caaaccatct ctggcgagca cggtctcgat 120

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cggtaccatg gacgctgtcc gctccggtcc cttcggcaag cttttccgcc ccgacaactt 420

cgtcttcggt cagtccggtg ctggtaacaa ctgggccaag ggtcactaca ctgagggta 479

<210> 3

<211> 550

<212> DNA

<213> 青霉属菌株TIBETAN2(Penicillium sp.strain TIBETAN2)

<400> 3

tccgagtaca aggaagcctt ctccctgttt gtgagtgaca ccacacacac attgaagatg 60

tgatcatcga atacatgctg accggggttt gttttgttgc gaaataggac aaggatggcg 120

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caccaaggaa cttggcacag tcatgcgctc gctgggtcag aacccctccg agtccgaatt 300

gcaggatatg atcaacgagg ttgatgccga caacaacggc actattgact tccccggtac 360

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caatgatggc tcgtaagatg aaggataccg attccgagga ggagatccgc gaggcattca 480

aggtcttcga tcgcgataac aacgggttca tttccgccgc cgagcttcgc cacgttatga 540

cctctatcgg 550

<210> 4

<211> 1083

<212> DNA

<213> 青霉属菌株TIBETAN2(Penicillium sp.strain TIBETAN2)

<400> 4

ttttggcaag tcttttccga actcttttca cccgagtcac gaaggatctc cagcgttacg 60

tccagcgatg cgttgagacc aatcgagaaa tttatctcaa cattggtatc aaggctagca 120

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cggcttccgc caaggctggt gtgtcccagg tgctgagtcg ttacacattt gcctcctcct 240

tgtctcatct gcgccggaca aacaccccca ttggcagaga tggaaagatc gccaaacctc 300

gccagctcca caatactcat tggggtctgg tctgcccggc cgagacacct gaaggtcaag 360

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aacctatcgt ggatttcatg attcagcgga acatggaagt cctcgaggag tttgaacccc 480

aagtgacgcc taatgcaaca aaggtgtttg tcaatggtgt ctgggtgggt attcatcggg 540

atccttcgca tcttgttact acgatgcaga atctgcgtcg acgaaacatg atctcccatg 600

aagtcagttt gattcgtgac atccgtgaac gggagttcaa gatcttcacc gatactggac 660

gtgtctgccg gccactcttc gttattgata atgatcccaa gagtgaaaac tcgggcggat 720

tggtccttaa caaggaacac attcggaagc tcgaggccga caaagacttg ccaacagaca 780

tggcaccaga ggaacgccgc gaacagtact tcggatggga tggcctggtt cgttcaggag 840

cagttgagta tgtcgacgct gaagaagagg aaactatcat gattgtcatg acccctgagg 900

atcttgagat ctctcgacag ctccaggctg gctacgctct gccagatgac gaaaccagcg 960

accccaacaa gcgtgttcgg tcgattctca gccagcgtgc ccacacctgg acgcactgcg 1020

aaatccaccc tagtatgatc ctgggtgttt gcgctagtat tattccgttc ccggatcata 1080

acc 1083

Claims

1.一种青霉菌，其分类命名为青霉菌(Penicillium sp.)TIBETAN2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2016228，保藏日期2016年04月26日。

2.权利要求1所述的青霉菌在降解芳香族化合物中的应用,所述芳香族化合物为苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸或萘。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述青霉菌在仅有芳香族化合物为唯一碳源的环境中生长并降解芳香族化合物，或者在含有有机碳源和/或氮源与芳香族化合物的环境中生长并降解芳香族化合物。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：生长环境中还包括浓度为15.0mM/L的铅离子、浓度6.0mM/L的镉离子、浓度为10.0mM/L的铜离子或浓度为12.5mM/L的锌离子；所述生长环境中还包括重量百分比0.5％-3.5％蔗糖和/或重量百分比0.5％-3.5％葡萄糖和/或重量百分比0.5％-3.5％酵母提取物；所述生长环境中还包括重量百分比0％-7.5％NaCl，或在同等盐胁迫条件下进行；生长条件为：15～35℃和/或pH 2.5～11.5。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述青霉菌在添加芳香族化合物为唯一碳源的无机盐培养基中生长并降解芳香族化合物，或者在添加有机碳源和/或氮源与芳香族化合物的无机盐培养基中生长并降解芳香族化合物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：生长环境中还包括浓度为0-17.5mM/L的铅离子、浓度为0-10.0mM/L的镉离子、浓度为0-15.0mM/L的铜离子或浓度为0-25.0mM/L的锌离子；所述生长环境中还包括重量百分比0.5％-3.5％蔗糖和/或重量百分比0.5％-3.5％葡萄糖和/或重量百分比0.5％-3.5％酵母提取物；所述生长环境中还包括重量百分比0％-7.5％NaCl，或在同等盐胁迫条件下进行；所述无机盐培养基为3.78gNa₂HPO₄·12H₂O，0.5gKH₂PO₄，5.0g NH₄Cl，0.2g MgSO₄·7H₂O，加蒸馏水溶至1000ml,自然pH，121℃下灭菌20min；培养条件为：15～35℃和/或pH 2.5～11.5。

7.权利要求1所述的青霉菌在治理含有芳香族污染物的土壤和水体中的应用；所述芳香族污染物为苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸或萘。

8.权利要求1所述的青霉菌在治理含有芳香族残留的化工企业废水处理中的应用；芳香族残留为苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、甲苯、苯甲酸或萘残留。