CN113249276B - 一种蜡样芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种蜡样芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RBC‑1，于2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2021024；本发明涉及的蜡样芽孢杆菌RBC‑1具有耐高盐、高氯、碱性等特性，能够耐受9％的盐度以及pH＝10的环境；接种蜡样芽孢杆菌RBC‑1的环氧丙烷皂化污水活性污泥对COD的去除具有明显的提高效果。

Description

一种蜡样芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种蜡样芽孢杆菌及其应用。
背景技术
蜡样芽胞杆菌大小约为1-1.3×3-5μm，革兰氏阳性，是一种兼性需氧微生物。可在体内形成芽胞，菌体两端较平整，多数呈链状排列。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在土壤等环境中广泛存在，因其能够产生丰富的蛋白酶、SOD、淀粉酶及抑菌物质等代谢产物，应用非常广泛。同时，蜡样芽孢杆菌也可作为肠道益生菌用于维持肠道内微生态平衡，减少炎症反应保护肠道屏障，减少疾病的发生率，提高机体免疫及抗病害能力。同时，因其具有良好的抗逆性以及降解部分污染物的能力，也被开发应用于处理重金属污水(吴民熙，硫酸盐还原菌结合生物材料处理重金属污水的研究，2017)。但应用蜡样芽孢杆菌处理环氧丙烷皂化废水少有报道。
环氧丙烷是重要的化工原料，大量用于生产丙二醇、聚醚、表面活性剂等，是仅次于聚丙烯和丙烯晴的第三大丙烯衍生物。目前，世界丙烯消耗量的8％用于生产环氧丙烷。目前国内企业的环氧丙烷生产线都采用氯醇法生产工艺，通过该工艺产生的废水具有温度高、pH值高、氯根含量高、COD含量高、悬浮物含量高的“五高”特点，废水进水水温一般在30～40℃，pH值为9～11，CaCl2浓度约为3.5％～4.0％，COD约为1000mg/L，氯离子浓度约为23000-25000mg/L。成分的复杂性决定了它难以处理，并且每生产1吨环氧丙烷就产生约50吨皂化废水，废水量非常大，因此如何有效的处理废水中的COD是公司环保治理的最大难点和需要迫切解决的问题。目前国内处理环氧丙烷废水主要是生物法，通过对废水的冷却、沉降、曝气等处理使其达到污水的国家排放标准。其中最主要的环节是通过活性污泥里的微生物对污水中有机污染物进行降解，但是一般情况下高浓度的含氯废水对微生物具有毒害作用，主要表现在废水的高渗透压破坏了微生物的细胞膜和膜内酶，使其菌株的代谢能力受到影响。因此环氧丙烷废水在处理前先要经过稀释，降低氯离子浓度后，才能进行废水处理，从而造成了稀释用水的大量浪费。通过在自然环境中筛选耐盐微生物，配合原有的活性污泥，实现对环氧丙烷皂化废水原液COD的有效降解，能够减轻下游处理过程的压力，进一步降低水处理成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种蜡样芽孢杆菌及其应用。
本发明针对环氧丙烷皂化废水的处理，从环氧丙烷皂化废水的活性污泥中筛选获得一株蜡样芽孢杆菌，经检测其具备高效降解环氧丙烷皂化废水COD的特性，可作为正常环氧丙烷皂化废水污泥的添加剂，提高其处理效果。
本发明涉及的蜡样芽孢杆菌具有高效去除环氧丙烷皂化污水中COD的作用，COD去除率为78.97％。
环氧丙烷造化废水是指使用氯醇法生产环氧丙烷时产生的废水。
本发明的技术方案如下：
一种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RBC-1，于2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号CCTCCNO：M 2021024。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RBC-1以下简称“蜡样芽孢杆菌RBC-1”。
上述蜡样芽孢杆菌RBC-1的形态特征：革兰氏染色情况如图1所示，蜡样芽胞杆菌大小约为1-1.3×3-5μm，革兰氏阳性，是一种兼性需氧微生物，可在体内形成芽胞，菌体两端较平整，多数呈链状排列。
上述蜡样芽孢杆菌RBC-1的制备方法，包括如下步骤：
取蜡样芽孢杆菌RBC-1接种于固体培养基上，25-37℃倒置活化培养20-36h，制得活化后菌株；取制得的活化后菌株接种至液体培养基中，25-37℃、150-200rpm培养12-18h，制得种子液；取制得的种子液，按体积百分比1-3％转接至液体培养基中，25-37℃、150-200rpm扩大培养12-18h，制得蜡样芽孢杆菌RBC-1菌液。
根据本发明优选的，上述制备方法中，所述固体培养基为LB固体培养基，所述液体培养基为LB液体培养基。
上述蜡样芽孢杆菌RBC-1在废水处理中的应用。
根据本发明优选的，上述蜡样芽孢杆菌RBC-1在含高氯废水处理中的应用。
进一步优选的，上述蜡样芽孢杆菌RBC-1在含高氯、高盐、碱性废水处理中的应用。
进一步优选的，上述蜡样芽孢杆菌RBC-1在含盐度(W/V)9％以下的废水处理中的应用。
进一步优选的，上述蜡样芽孢杆菌RBC-1在环氧丙烷皂化废水处理中的应用。
有益技术效果
本发明涉及的蜡样芽孢杆菌RBC-1具有耐高盐、高氯、碱性等特性，能够耐受9％的盐度以及pH＝10的环境；接种蜡样芽孢杆菌RBC-1的环氧丙烷皂化污水活性污泥对COD的去除具有明显的提高效果，去除率为78.97％，48h的去除速率12.2mg/(L·h)。
附图说明
图1为蜡样芽孢杆菌RBC-1的革兰氏染色图片；
图2为蜡样芽孢杆菌RBC-1的系统进化树图；
图3为蜡样芽孢杆菌RBC-1在不同盐度条件下的生长曲线图；
图4为蜡样芽孢杆菌RBC-1在不同pH条件下的生长曲线图；
图5为环氧丙烷皂化污水活性污泥与分别接种蜡样芽孢杆菌RBC-1和枯草芽孢杆菌168的环氧丙烷皂化污水活性污泥对环氧丙烷皂化污水的COD处理效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明内容的保护范围不局限于此。
实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为普通市售产品。
实施例1
蜡样芽孢杆菌RBC-1的筛选，包括如下步骤：
菌株筛选自环氧丙烷皂化废水剩余污泥，取1mL剩余污泥样品，置于150mL无菌三角瓶中，加入无菌生理盐水50mL，无菌玻璃珠2g，在25℃、180rpm条件下震荡15分钟，吸取菌液，用无菌水进行梯度稀释，分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，分别吸取100μL稀释液涂布至含有氯化钠质量浓度为5％、8％、10％的无菌LB固体培养基平板上，在25℃条件下静置培养2d，挑取生长快、菌落大的克隆至50mL含有氯化钠质量浓度为10％的LB液体培养基，在25℃、180rpm条件下培养2d，之后吸取100μL菌液涂布至含有氯化钠浓度为10％的无菌LB固体培养基，挑取单克隆。
直接取单克隆的菌苔作为模板，以27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG SEQ ID NO.2)和1492R(TACGGCTACCTTGTTACGACTT SEQ ID NO.3)作为引物，利用PCR获得16SrDNA序列。PCR反应体系如下(50μL)见表1：
表1
Figure BDA0003146375020000031
菌落PCR程序参数设定如下所示：
Figure BDA0003146375020000032
Figure BDA0003146375020000041
PCR产物利用Omega胶回收试剂盒回收后送至青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，其16S rDNA序列含有1486bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank数据库进行BLAS(网址：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，并构建其系统进化树，如图2所示，结果表明该菌属于Bacillus cereus，命名为蜡样芽孢杆菌RBC-1。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)RBC-1，于2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2021024。
实施例2
蜡样芽孢杆菌RBC-1的发酵培养方法，包括如下步骤：
取蜡样芽孢杆菌RBC-1划线于LB固体培养基上，25℃倒置活化培养1天，制得活化后菌株；取制得的活化后菌株接种至LB液体培养基中，25℃、200rpm摇床培养12h，制得种子液；取制得的种子液，按体积百分比1％转接至LB液体培养基中，25℃、200rpm扩大培养12h，制得菌液；经检测，菌液的菌体浓度为2×108cfu/mL。
液体培养基为LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容至1L，pH自然。
固体培养基为LB固体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉20g，定容至1L，pH自然。
实验例
(1)蜡样芽孢杆菌RBC-1在不同盐度条件下的生长情况
取0.1mL蜡样芽孢杆菌RBC-1接种到LB培养基中，25℃、200rpm培养24h，制得活化后菌液；取制得的活化后菌液，按体积百分比1％接种至不同盐度LB液体培养基中，盐度(w/v)为1％、3％、5％、7％、9％、11％和15％，25℃、200rpm摇床培养，间隔6h取样一次，测定菌液OD600，绘制菌种生长曲线，结果如图3所示。
液体培养基为LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容至1L，pH自然。
不同盐度LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠的量根据盐度计算(盐度(w/v)为1％、3％、5％、7％、9％、11％和15％)，定容至1L，pH自然。
(2)蜡样芽孢杆菌RBC-1在不同pH条件下的生长情况
取0.1mL蜡样芽孢杆菌RBC-1接种到LB培养基中，25℃、200rpm培养24h，制得活化后菌液；取制得的活化后菌液，按体积百分比1％接种至不同pH的LB液体培养基中，pH为6、7、8、9、10和11，25℃、200rpm摇床培养，间隔6h取样一次，测定菌液OD600，绘制菌种生长曲线，结果如图4所示。
液体培养基为LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容至1L，pH自然。
不同pH的LB液体培养基，成分组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，定容至1L，pH分别调为6、7、8、9、10和11。
根据以上实验结果表明，本发明中蜡样芽孢杆菌RBC-1能够耐受9％的盐度，且在盐度低于9％时生长良好。此外，该菌能够适应中性及强碱性环境，即使在pH为10时，仍能生长良好。这说明该菌能够在高盐及强碱性环境中生长良好，将其应用于环氧丙烷皂化污水的处理具有巨大的优势。
应用例
利用蜡样芽孢杆菌RBC-1进行污水处理的实验及效果描述：
将蜡样芽孢杆菌RBC-1和枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)分别在LB液体培养基中培养24h，取培养后的菌液在10000rpm下离心10min，倒掉上清液得离心管底部菌体。然后用5mL生理盐水重悬菌体，再10000rpm下离心10min，重复两次，以消除菌液中LB带入的有机物对污水COD的影响。最后将得到的两株菌的菌体悬液以体积分数10％的接种量分别接种到装有200mL环氧丙烷皂化污水和环氧丙烷皂化活性污泥(MLSS约为30g/L)的锥形瓶中，25℃和200rpm下培养，0h、12h、24h、36h和48h分别取样测定接种蜡样芽孢杆菌RBC-1和枯草芽孢杆菌168后环氧丙烷皂化污水活性污泥对COD的去除效果，并与不接种蜡样芽孢杆菌RBC-1和枯草芽孢杆菌168的环氧丙烷皂化污水活性污泥处理效果作对比，结果如图5所示。从图中可以看到，48h内未接种蜡样芽孢杆菌RBC-1和枯草芽孢杆菌168的环氧丙烷皂化污水活性污泥对COD的去除率仅为69.76％，接种枯草芽孢杆菌168的环氧丙烷皂化污水活性污泥48h内对COD的去除率约为71.04％，污水COD去除率仅提高了1.28％；而接种蜡样芽孢杆菌RBC-1的环氧丙烷皂化污水活性污泥在48h内对COD的去除速率为12.2mg/(L·h)，对COD的去除率为78.97％，污水COD去除率提高了9.21％，去除效果显著高于接种枯草芽孢杆菌168的效果。这说明，接种到污泥的蜡样芽孢杆菌RBC-1能够适应环氧丙烷皂化污水的高盐、高氯、高碱和高COD的环境，并迅速生长以降解环氧丙烷皂化污水中的有机物，进而有效降低环氧丙烷皂化污水的COD。
利用氯醇法生产环氧丙烷产生的废水除了高盐、高氯、高pH的特点外，还含有一定浓度的有机氯化物。有机氯化物因具有高稳定性，同时能够高效去除农作物害虫，因而常被用于高效杀虫剂，例如七氯双环庚二烯以及六六六、滴滴涕和六氯代苯等。这些有机氯化物不但对昆虫有致命影响，对微生物的生长和正常代谢也有一定的影响。本发明涉及的蜡样芽孢杆菌RBC-1克服了这些不利于微生物代谢的因素，能够有效降低环氧丙烷皂化污水的COD。
SEQUENCE LISTING
<110> 王清
<120> 一种蜡样芽孢杆菌及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1486
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaggggcac ttgttcgact tcccccaatc atctgtccac cttaggcggc tggctccaaa 60
aaggttaccc caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac 120
aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg attccagctt 180
catgtaggcg agttgcagcc tacaatccga actgagaacg gttttatgag attagctcca 240
cctcgcggtc ttgcagctct ttgtaccgtc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata 300
aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct 360
tagagtgccc aacttaatga tggcaactaa gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta 420
acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac tctgctcccg 480
aaggagaagc cctatctcta gggttttcag aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc 540
gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga 600
gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttaac ttcagcacta 660
aagggcggaa accctctaac acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat 720
ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgcg cctcagtgtc agttacagac cagaaagtcg 780
ccttcgccac tggtgttcct ccatatctct acgcatttca ccgctacaca tggaattcca 840
ctttcctctt ctgcactcaa gtctcccagt ttccaatgac cctccacggt tgagccgtgg 900
gctttcacat cagacttaag aaaccacctg cgcgcgcttt acgcccaata attccggata 960
acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt 1020
taggtaccgt caaggtgcca gcttattcaa ctagcacttg ttcttcccta acaacagagt 1080
tttacgaccc gaaagccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt 1140
gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt 1200
ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgttgcctt ggtgagccgt tacctcacca 1260
actagctaat gcgacgcggg tccatccata agtgacagcc gaagccgcct ttcaatttcg 1320
aaccatgcgg ttcaaaatgt tatccggtat tagccccggt ttcccggagt tatcccagtc 1380
ttatgggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg ctaacttcat aagagcaagc 1440
tcttaatcca ttcgctcgac ttgcattata gcacgccgcc acaccc 1486
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (8)

1.一种蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）RBC-1，于2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2021024。
2.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）RBC-1的制备方法，包括如下步骤：
取蜡样芽孢杆菌RBC-1接种于固体培养基上，25-37 °C倒置活化培养20-36 h，制得活化后菌株；取制得的活化后菌株接种至液体培养基中，25-37 °C、150-200 rpm培养12-18h，制得种子液；取制得的种子液，按体积百分比1-3%转接至液体培养基中，25-37 °C、150-200 rpm扩大培养12-18 h，制得蜡样芽孢杆菌RBC-1菌液。
3.如权利要求2所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）RBC-1的制备方法，其特征在于，所述固体培养基为LB固体培养基，所述液体培养基为LB液体培养基。
4.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）RBC-1在废水处理中的应用。
5.如权利要求4所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）RBC-1在含高氯废水处理中的应用。
6.如权利要求5所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）RBC-1在含高氯、高盐、碱性废水处理中的应用。
7.如权利要求6所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）RBC-1在含盐度W/V 9%以下的废水处理中的应用。
8.如权利要求6所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）RBC-1在环氧丙烷皂化废水处理中的应用。
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