JP4227861B2

JP4227861B2 - 多環芳香族化合物分解能を有する新規微生物

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Publication number: JP4227861B2
Application number: JP2003281113A
Authority: JP
Inventors: 浩美神戸; 俊也岡田
Original assignee: Obayashi Corp; Toyota Motor Corp
Current assignee: Obayashi Corp; Toyota Motor Corp
Priority date: 2003-07-28
Filing date: 2003-07-28
Publication date: 2009-02-18
Anticipated expiration: 2023-07-28
Also published as: JP2005046048A

Description

本発明は、多環芳香族化合物分解能を有する新規微生物及び多環芳香族化合物汚染環境の浄化方法に関する。

近年、石油タンカー事故による海洋への石油流出、工場跡地における油による土壌汚染などの油を原因とする環境汚染が問題となっている。油成分の中には、多環芳香族化合物が存在する。多環芳香族化合物は揮発性が低い生物難分解性化合物であり、環境中に残留しやすい。また、多くの多環芳香族化合物が人体に悪影響を及ぼすことが知られている。特にペンゾピレンは、変異原性又は発癌性が高く問題となっている。

一方、多環芳香族化合物を分解することができる微生物が単離されている(特許文献１〜３）。しかしながら、これらの微生物は液体環境中で用いられているため、土壌中で同様の多環芳香族化合物分解能を示すか否かは不明である。また多環芳香族化合物を分解することができる微生物コンソーシアムが得られている(特許文献４〜６)。微生物コンソーシアムとは、微生物の2種あるいはそれ以上の種類間の多少とも安定な物理的結びつきである。微生物コンソーシアム中では、各種の微生物間で相互作用が働き、各種の微生物の数又は機能を再現的に維持することが困難である。従って、微生物コンソーシアムを用いることによって、確実な多環芳香族化合物分解の効果を得ることは困難である。

以上のように、多環芳香族化合物に汚染された環境を浄化する方法が望まれている。浄化方法の1つとして、多環芳香族化合物を分解する微生物を用いる方法が考えられる。しかしながら、液体環境及び土壌の双方で効率的に多環芳香族化合物を分解することができる微生物はこれまで単離されていなかった。

特開平１１−２６２３８４号公報特開平９−２０６０８７号公報特開平７−２３７７３号公報特開２００２−１７３４５号公報特開２００２−１４３８３０号公報特開２０００−２５４６３５号公報

そこで本発明は、効率的に多環芳香族化合物を分解することができる新規微生物及び多環芳香族化合物汚染環境の浄化方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、多環芳香族化合物分解能を有する微生物を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、多環芳香族化合物を分解するPolyporales目に属する微生物である。Polyporales目に属する微生物としては、受託番号FERM P-19293で特定される微生物並びにHapalopilaceae科に属する微生物、特に受託番号FERM P-19294で特定される微生物が挙げられる。

さらに、本発明は、多環芳香族化合物を分解するPolyporales目に属する微生物を添加することを特徴とする、多環芳香族化合物汚染環境を浄化する方法である。Polyporales目に属する微生物としては、受託番号FERM P-19293で特定される微生物、並びにHapalopilaceae科に属する微生物、特に受託番号FERM P-19294で特定される微生物が挙げられる。

本発明により、効率的に多環芳香族化合物を分解することができる新規微生物及び多環芳香族化合物汚染環境の浄化方法が提供される。

本発明に係る微生物は、多環芳香族化合物(以下、「PAH」と呼ぶ)を分解するPolyporales目に属する微生物である。PAHを分解するPolyporales目に属する微生物としては、TY-8株及びHapalopilaceae科に属する微生物が挙げられる。さらに、Hapalopilaceae科に属する微生物としては、TY-16株が挙げられる。なお上記微生物において、自然的又は人工的手段によって変異させて得られ、かつPAHを分解することができる変異株は、本発明に含まれる。

これらPolyporales目に属する微生物は、伐採した丸太若しくは製剤品または生立木の材を腐らせる菌類である木材腐朽菌の1群である白色腐朽菌である。白色腐朽菌はセルロース及びリグニンを分解する能力を有する。

本発明に係る微生物の単離方法として、まず有機質資材からPAH分解能を有する微生物を、リグニン分解菌をスクリーニングする方法として知られる色素RBBR(Remazol Brilliant Blue)の脱色を指標として選抜する。次いで選抜した微生物をさらに7種のPAH(アントラセン、フルオランテン、ピレン、ベンゾ(a)ピレン、ベンゾ(a)アントラセン、クリセン及びベンゾ(k)フルオランテン)の分解能を測定することにより、本発明に係る微生物を単離する。実際に静岡大学工学部物質工学科中崎清彦教授から供与された牛糞堆肥サンプル及び神奈川県農業総合研究所から供与された牛糞/オガクズ堆肥サンプルの双方からそれぞれ1種類の微生物を単離できた。

以下に単離した2種類の微生物の分類学的性質を説明する。
〔分類学的性質〕
牛糞堆肥サンプル及び牛糞/オガクズ堆肥サンプル由来の微生物が属する目及び/又は科並びに株名は、それぞれPolyporales目/TY-8株(以下、「TY-8株」と呼ぶ)及びPolyporales目/Hapalopilaceae科/TY16株(以下、「TY-16株」と呼ぶ)である。さらに上記微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に平成15年4月9日付で寄託されており、その受託番号は、それぞれFERM P-19293、FERM P-19294である。

TY-8株及びTY-16株について、28S rDNAの塩基配列を決定し、28S rDNAの塩基配列に基づく分子系統樹の作製を行った。決定されたTY-8株の28S rDNAの塩基配列を配列番号１に、TY-16株の28S rDNAの塩基配列を配列番号２に示す。また、近隣結合法(Saitou, N.及びNei, M., Molecular Biology and Evolution 4：406-425, 1987)によって分子系統樹を作製した。進化距離の算出には、木村の2変数法(Kimura, M., Journal of Molecular Evolution, 16(2):111-20, Dec, 1980)を用いて、各系統枝の信頼度をブーツストラップ法(Felsenstein, J., Evolution 39：783-791, 1985)により評価した。得られたTY-8株及びTY-16株の分子系統樹をそれぞれ図１及び２に示す。

図１に示すように、TY-8株は、Hapalopilaceae科のHapalopilus rutilansと系統枝を形成し、その枝はブーツストラップ確率47％で支持された。TY-8株は、Hapalopilaceae科が属するPolyporales目の系統に位置することが示唆された。

一方、図２に示すように、TY-16株は、Hapalopilaceae科のBjerkandera adustaと系統枝を形成し、その枝はブーツストラップ確率100％で支持された。Bjerkandera adustaが、Hapalopilaceae科に帰属することから、TY-16株は、同じHapalopilaceae科に帰属する可能性が示唆された。

また、TY-8株及びTY-16株は、双方とも、上記系統解析からのデータ、並びに無性生殖器官の形態及び高等糸状菌類の特徴である有隔壁菌糸を有することから、担子菌類系統の分節型分生子を形成する高等糸状菌類であることが推定される。

(a)培養的・形態的性質
1.オートミール寒天培地における培養的・形態的性質
1-1.オートミール寒天培地組成
Bacto Oatmeal Agar(Becton Dickinson, NJ, USA)。
1-2.TY-8株のテレオモルフ及びアナモルフの形態学的性質
(巨視的観察結果)
25℃、1週間の培養における生育は、直径65〜70mmとなる。培養1週間以上を経過すると、シャーレ中に菌糸が広がり、気中菌糸(aerial hypha)が発達する様子が認められる。可溶性色素の産生は認められない。なお、培養2週間後までの検体からは、テレオモルフの形成は確認されない。
1-3.TY-16株のテレオモルフ及びアナモルフの形態学的性質
(巨視的観察結果)
25℃、1週間の培養における生育は、直径50mmとなる。培養1週間以上を経過すると、シャーレ中に気中菌糸の発達が顕著に認められる。可溶性色素の産生は認められない。なお、培養2週間後までの検体からは、テレオモルフの形成は確認されない。
1-4.コロニーの表面の形状、色調及びコロニーの裏面の色調

2.麦芽エキス寒天培地における培養的・形態的性質
2-1.麦芽エキス寒天培地組成

2-2.TY-8株のテレオモルフ及びアナモルフの形態学的性質
(巨視的観察結果)
25℃、1週間の培養における生育は、直径65mmとなる。菌糸の様子等の他の性質は、全て上記オートミール寒天培地における生育の場合と同様である。
2-3.TY-16株のテレオモルフ及びアナモルフの形態学的性質
(巨視的観察結果)
25℃、1週間の培養における生育は、直径55〜62mmとなる。菌糸の様子等の他の性質は、全て上記オートミール寒天培地における生育の場合と同様である。
2-4.コロニーの表面の形状、色調及びコロニーの裏面の色調

3.ポテト-デキストロース寒天培地における培養的・形態的性質
3-1.ポテト-デキストロース寒天培地組成
Bacto Potato Dextrose Agar(Becton Dickinson, NJ, USA)。
3-2.TY-8株のテレオモルフ及びアナモルフの形態学的性質
(巨視的観察結果)
25℃、1週間の培養における生育は、直径60〜70mmとなる。菌糸の様子等の他の性質は、全て上記オートミール寒天培地における生育の場合と同様である。
3-3.TY-16株のテレオモルフ及びアナモルフの形態学的性質
(巨視的観察結果)
25℃、1週間の培養における生育は、直径50〜60mmとなる。菌糸の様子等の他の性質は、全て上記オートミール寒天培地における生育の場合と同様である。

3-4.コロニーの表面の形状、色調及びコロニーの裏面の色調

(b)生理学的・化学分類学的性質

(c)諸性質
TY-8株及びTY-16株は、双方とも光学顕微鏡による菌糸の観察において、分節型の分生子形成構造が確認される。また寒天平板上及び気中の栄養菌糸に不規則な切れ込みが入り、菌糸が分断されている様子が観察される。分断された菌糸は直鎖状に、または僅かに分岐しながら連鎖し、この菌糸が分断した後の細胞の1つ1つが分生子であり、1細胞性で円筒形から長楕円形を示す。なお、長期培養検体からもテレオモルフ及び厚壁胞子の形成は確認されない。

一方、PAHとは、揮発性が低い生物難分解性化合物である。本発明に係る微生物が分解することができるPAHとしては、限定されるものではないが、例えばアントラセン、フルオランテン、ピレン、ベンゾ(a)ピレン、ベンゾ(a)アントラセン、クリセン、ベンゾ(k)フルオランテン及びフェナントレンが挙げられる。

Polyporales目に属する微生物の培養方法は、当該微生物が増殖できるものであれば、いずれのものであってよい。例えば、既に記載した組成から成るポテト-デキストロース寒天培地に当該微生物を接種し、培養することが挙げられる。

上記培養における温度条件は、当該微生物の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定する。例えば、温度は20〜40℃、好ましくは30℃である。また培地のpHは、4〜6、好ましくは4.5に設定すればよい。

培養時間は、栄養源の量や種類により異なるが、通常3日以上、好ましくは7日である。
一方、本発明に係る微生物によるPAHの分解率は、以下のように測定することができる。まず、例えばポテト-デキストロース寒天培地で培養した本発明に係る微生物を、以下の表６に示した窒素欠乏培地に添加し、例えば25℃で4日間静置培養する。4日間の培養終了後、測定したいPAHを培養物に添加して、例えば、25℃で約300luxの光条件下でさらに15日間静置培養する。15日間の培養終了後に、培養物中に残存するPAHを例えばガスクロマトグラフィー/質量分析(以下、「GC/MS」と呼ぶ)により測定する。

本発明に係る微生物は、例えば石油流出に伴う海洋汚染環境及び工場跡地における油による土壌汚染環境を浄化することができる。本発明に係る微生物が浄化することができる環境としては、上述した環境以外に、例えば、ガソリンスタンド、製鉄所、発電所等の種々の石油系炭化水素(ガソリン、灯油、タール、重油等)を取扱う施設の敷地又は跡地が挙げられる。

一方、多環芳香族化合物汚染環境に対して本発明に係る微生物を添加する場合、本発明に係る微生物は、例えば、菌の担体としてオガクズ等に植菌して培養し、菌糸が十分に生育した菌床の形態で土壌等に添加し、混合することができる。

多環芳香族化合物汚染環境に対して添加する本発明に係る微生物の量としては、上記環境中に含まれる多環芳香族化合物を浄化できる範囲内であればいずれの量でもよいが、例えば、土壌に対し1/2倍量(容積)の菌床であることが好ましい。

さらに、本発明に係る微生物を、本発明に係る微生物のPAH分解能を促進する物質とともに多環芳香族化合物汚染環境に添加することができる。

本発明に係る微生物は、液体環境及び土壌の双方で効率的に多環芳香族化合物を分解することができる。従って、本発明に係る微生物により、実用的な生物学的環境修復の方法を確立することできる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。

〔実施例１〕TY-8株及びTY-16株の系統解析
１．ゲノムDNAの単離
TY-8株及びTY-16株の検体を、ポテトデキストロース寒天培地「ダイゴ」(日本製薬, 東京)で25℃で10日間培養した。次いで集菌した菌体からFastPrep FP120(Qbiogene, ILLKIRCH CEDEX, France)とFastDNA Kit(Qbiogene, ILLKIRCH CEDEX, France)を用いてゲノムDNAを分離した。

２．28S rDNAの単離及び配列決定分析
得られたゲノムDNAを鋳型として28S rDNAフラグメントのPCR増幅を行った。なお、PCRは、puReTaq Ready-To-Go PCR beads(Amercham Biosciences, NJ, USA)と以下のプライマー(NL1及びNL4)(O' Donnell, K., Fusarium and its near relatives. In Reynolds, D.R. and Taylor, J. W. (編) The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, CAB International, Wallingford, UK, pp.225-233, 1993)を用いて、GeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems, CA, USA)上でサーマルサイクルを行った。
プライマー；
NL1：5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3'（配列番号３）
NL4：5'-TGG TCC GTG TTT CAA GAC GG-3'（配列番号４）

得られたDNAフラグメントをQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN, CA, USA)を用いて精製し、サイクルシークエンシング反応に供した。なお、サイクルシークエンシング反応は、ABI PRISM BigDye Terminator Kit(Applied Biosystems, CA, USA)と上記2種のプライマーに加えて以下のプライマー(NL2及びNL3) (O' Donnell, K., Fusarium and its near relatives. In Reynolds, D.R. and Taylor, J. W. (編) The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, CAB International, Wallingford, UK, pp.225-233, 1993)を用いて、GeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems, CA, USA)上で反応を行った。
プライマー；
NL2：5'-CTC TCT TTT CAA AGT TCT TTT CAT CT-3'（配列番号５）
NL3：5'-AGA TGA AAA GAA CTT TGA AAA GAG AG-3'（配列番号６）

反応産物を、DyeEx2.0 Spin Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)を用いて精製し、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, CA, USA)で配列決定を行い、さらにAutoAssembler(Applied Biosystems, CA, USA)を用いて各シークエンス断片を結合させ、目的の28S rDNAの塩基配列を得た。

決定されたTY-8株の28S rDNAの塩基配列を配列番号１に、TY-16株の28S rDNAの塩基配列を配列番号２に示す。

３．28S rDNA遺伝子の塩基配列を用いた分子系統樹の作製
TY-8株又はTY-16株の28S rDNAの塩基配列に類似する塩基配列をGenBank(GenBank/EMBL/DDBJ 国際DNA配列データベース)から検索するために、BLAST(Altschul, S. F.ら, Nucleic Acids Res. 25：3389-3402, 1997)による相同性分析を行った。さらに、近隣結合法(Saitou, N.及びNei, M., Molecular Biology and Evolution 4：406-425, 1987)による分子系統樹を作製した。進化距離の算出には、木村の2変数法(Kimura, M., Journal of Molecular Evolution, 16(2):111-20, Dec, 1980)を用いて、各系統枝の信頼度をブーツストラップ法(Felsenstein, J., Evolution 39：783-791, 1985)により評価した。

４．結果
得られたTY-8株及びTY-16株の分子系統樹をそれぞれ図１及び２に示す。
図１に示すように、TY-8株は、Hapalopilaceae科のHapalopilus rutilansと系統枝を形成し、その枝はブーツストラップ確率47％で支持された。TY-8株は、Hapalopilaceae科が属するPolyporales目の系統に位置することが示唆された。

〔実施例２〕液体培地におけるPAH分解実験
１．種菌の調製
シャーレにポテト-デキストロース寒天培地を調製し、シャーレの中央に本発明に係るPAH分解微生物、TY-8株及びTY-16株をそれぞれ植菌し、菌糸がシャーレ全体に広がるまで培養した。次いでこれらの培地から菌糸及び寒天培地を含む1cm²角を切りだし、さらに1cm²角を1mm角に細片化し、これを以下の実験に使用する種菌とした。

２．PAH溶液の調製
アントラセン、フルオランテン、ピレン、ベンゾ(a)ピレン、ベンゾ(a)アントラセン、クリセン及びベンゾ(k)フルオランテンをそれぞれ、ジクロロメタン/アセトニトリル(7：3)溶液と混合し、各PAH溶液1000ppmを調製した。

３．培養
100ml容三角フラスコに窒素欠乏培地10mlを添加した。次に青梅綿を用いて三角フラスコを綿栓し、オートクレーブに供して滅菌した。

次いで、滅菌した三角フラスコに上記種菌を接種し、25℃で4日間静置培養した。4日間の培養後、上記で調製した各PAH溶液をそれぞれ、(1)アントラセン、フルオランテン、ピレン及びベンゾ(a)ピレン、並びに(2)ベンゾ(a)アントラセン、クリセン及びベンゾ(k)フルオランテンに分けて、培養物を含有する三角フラスコに各組を各PAHが10ppm濃度となるように添加した。次に培養物を25℃で約300luxの光条件下で15日間さらに静置培養した。

４．PAHの抽出と定量
培養が終了した培養物を、三角フラスコごと凍結乾燥した。次に三角フラスコに水2ml及びヘキサン10mlを添加し30分間超音波処理に供した。30分後、ヘキサン層を回収し、これをガスクロマトグラフィー/質量分析GC/MS用サンプルとした。なお、種菌を接種していないサンプルを対照サンプルとした。

サンプル中の各PAHの残存量をGC/MSで定量した。なお、GC/MS条件は以下の表７に示した通りであった：

５．結果
定量結果をTY-8株については図３に示し、TY-16株については図４に示す。図中の略号は、以下のPAHを意味する；A：アントラセン、B：フルオランテン、C：ピレン、D：ベンゾ(a)ピレン、E：ベンゾ(a)アントラセン、F：クリセン、G：ベンゾ(k)フルオランテン。

図３及び４から、対照サンプルと比較してTY-8株およびTY-16株由来の種菌を接種したサンプルでは、各PAHが減少したことが判る。従って、TY-8株及びTY-16株がPAHを分解できることが示された。

〔実施例３〕モデル汚染土におけるPAH分解実験
１．菌床の調製
TY-8株及びTY-16株の種菌をそれぞれ、1/3倍量のトウモロコシ糠等の栄養成分を含む滅菌したオガクズに植菌し、25℃で培養して、菌糸がオガクズ内部及び周囲に伸びるまで静置培養した。

２．モデル汚染土の調製
風乾した川砂5gを100ml容耐圧ビンに入れ、加熱滅菌に供した。一方、4種類のPAH、フェナントレン、アントラセン、ピレン及びベンツ(a)ピレン100mgをそれぞれ、溶媒としてジクロロメタン/アセトニトリル(7：3)溶液20mlと混合し、各PAH溶液5000ppmを調製した。次に、上記加熱滅菌した耐圧ビンに各PAH溶液200μlを添加し、溶媒が完全に乾燥するまで(約10分間)ドラフトチャンバー内で風乾した。これを、上記4種類のPAHをそれぞれ濃度200ppmで含むPAHモデル汚染土として以下の実験に用いた。

３．PAH分解実験
100容耐圧ビン中の上記PAHモデル汚染土に、上記菌床3.3gと砂5g(2：1(容積))を添加した。十分に攪拌した後、さらに0.1％のTween 80 0.7mlを添加し、混合した。次に100容耐圧ビンを水平にし、25℃で4週間静置培養した。さらに、静置培養開始時の培養物のサンプリングも行った。なお、100容耐圧ビン中にモデル汚染土のみ、及び滅菌した菌床を添加したものを陰性対照とした。滅菌は、オートクレーブを用いて120℃で1時間行った。

４．PAHの抽出と定量
培養が終了した培養物(開始時及び4週間後)を、100容耐圧ビンごと-20℃の冷凍庫で保管した。次いで、保存培養物を凍らせたまま、凍結乾燥機(TAITEC社、VD-16 freeze dry)に5時間以上供して、完全に凍結乾燥させた。次に乾燥培養物にジクロロメタン15mlを添加し攪拌して、30分間静置した。30分後に、上清のジクロロメタンを約1mlを取り出し、0.2μmフィルターで濾過した。この濾液をHPLC用サンプルとした。

サンプル中の各PAHの残存量を逆相HPLC(Hewlett Packard 1090)で定量分析した。測定は、HPLC(ダイオードアレイ検出)を用いた絶対検量線法で行った。なお、HPLC分析条件は以下の表８に示す通りであった：

５．結果
測定結果を図５〜９に示す(図５：TY-8株菌床、図６：TY-16株菌床、図７：滅菌TY-8株菌床、図８：滅菌TY-16株菌床、図９：モデル汚染土のみ)。それぞれの結果は、2連で測定した結果の平均値である。

図５及び６から、TY-8株およびTY-16株由来の菌床を添加したサンプルでは、静置培養4週間後には各PAHが減少したことが判る。従って、TY-8株及びTY-16株は土壌中のPAHも分解できることが示された。しかしながら、図７及び８に示されるように滅菌したTY-8株及びTY-16株由来の菌床によっては、各PAHが減少しなかった。

図１は、TY-8株の分子系統樹における位置付けを示す。図２は、TY-16株の分子系統樹における位置付けを示す。図３は、液体培地におけるTY-8株のPAH分解実験の結果を示す。図４は、液体培地におけるTY-16株のPAH分解実験の結果を示す。図５は、モデル汚染土におけるTY-8株由来の菌床を用いたPAH分解実験の結果を示す。図６は、モデル汚染土におけるTY-16株由来の菌床を用いたPAH分解実験の結果を示す。図７は、モデル汚染土における滅菌したTY-8株由来の菌床を用いたPAH分解実験の結果を示す。図８は、モデル汚染土における滅菌したTY-16株由来の菌床を用いたPAH分解実験の結果を示す。図９は、モデル汚染土のみを用いたPAH分解実験に対する陰性対照の結果を示す。

配列番号３〜６は、プライマーである。

Claims

受託番号FERM P-19293又はFERM P-19294で特定される、多環芳香族化合物を分解する微生物。
請求項１に記載の微生物を汚染環境に添加することを特徴とする、多環芳香族化合物汚染環境を浄化する方法。
前記汚染環境が土壌である、請求項２に記載の方法。
前記多環芳香族化合物がアントラセン、フルオランテン、ピレン、ベンゾ(a)ピレン、ベンゾ(a)アントラセン、クリセン、ベンゾ(k)フルオランテン及びフェナントレンから成る群より選択されるものである、請求項２に記載の方法。
前記多環芳香族化合物がアントラセン、ピレン、ベンゾ(a)ピレン及びフェナントレンから成る群より選択されるものである、請求項２に記載の方法。