JPWO2020009097A1 - 石油関連物質により汚染された環境の除染方法および使用する資材 - Google Patents
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Abstract
Description
現在までに、石油汚染のバイオレメデイエーションに利用出来る実用的な微生物としては、Pseudomonas属、Acinetobactor属、Rhodococcus属、Acinetobacter属などの細菌、Candida属、Rhodotorula属などの酵母が石油分解菌として分離されている〔非特許文献3〕。それらの石油分解能を持つ微生物を汚染された環境に投入して汚染物質を分解して除染する目的で、現在までに使用されている微生物は、高分子(炭素数30以上)の炭化水素の分解活性が低く、さらに細胞が高圧では死滅するので、深い地中に投入するには技術的に解決すべき課題があった。
上記の従来のバイオオーグメンテーション法の難点を解決し、保存や使用時の環境条件の制限を解消できる方法として、温度、pH、圧力など、環境の負荷に強い生物体として細菌の胞子(芽胞)〔非特許文献4:西 賢司、加藤 良、富田 守:Bacillus属芽胞の圧力による活性化と殺菌、醸造協会誌、50巻(2号)104110,1995年〕を使用する工法について鋭意研究を行い、本願に係る発明を完成させた。
すなわち、芽胞を形成し、温度70℃でも生存できる菌株で、好気的条件下で、石油関連物質(炭化水素)を分解する細菌を選抜した。検索した複数の細菌を同時に作用させることのよって高分子の炭化水素化合物(炭素数35以上の炭化水素)をも分解する機能を発揮させることに成功し、本願に係る基礎技術発明を完成した。
〔1〕バシルス(Bacillus)属の微生物を用いることを特徴とする石油関連物質の分解法。
〔2〕微生物と微生物の増殖を促進する成分を併用することを特徴とする上記〔1〕記載の石油関連物質の分解法。
〔3〕バイオマス物質を併用することを特徴とする請求項1記載の石油関連物質の分解法。
〔4〕バシルス(Bacillus)属細菌の胞子を用いることを特徴とする上記〔1〕記載の石油関連物質の分解法。
〔5〕バシルス(Bacillus)属細菌が、Bacillus siamensis、Bacillus amyloliquefaciens、及びBacillus velezensisからなる群から選択されたものと遺伝子の相同性の高いバシルス(Bacillus)属細菌であることを特徴とする上記〔1〕記載の石油関連物質の分解法。
〔6〕土壌中の高分子(炭素数30以上)の石油関連物質を分解することを特徴とする上記〔1〕記載の石油関連物質の分解法。
〔7〕Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)の菌体又は胞子とBacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)の菌体又は胞子を併用することを特徴とする上記〔1〕記載の石油関連物質の分解法。
〔8〕バシルス(Bacillus)属細菌を用いて水中の炭化水素を分解除去することを特徴とする方法。
〔9〕バシルス(Bacillus)属の微生物を用いることを特徴とする炭化水素類の生化学的分解法。
〔10〕Bacillus siamensis、Bacillus amyloliquefaciens、及びBacillus velezensisからなる群から選択されたものと遺伝子の相同性の高いバシルス(Bacillus)属細菌で、石油関連物質の分解活性を有することを特徴とするバシルス(Bacillus)属細菌又はその胞子。
〔11〕Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)及びその子孫、Bacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)及びその子孫、及びそれらの胞子(芽胞)からなる群から選択されたことを特徴とする微生物。
〔12〕Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)の菌体又は胞子とBacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)の菌体又は胞子を有効成分として含有することを特徴とする環境汚染物質除去剤。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び/又は改変(あるいは修飾)をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
上記の従来のバイオオーグメンテーション法の難点を解決する目的で、保存や使用時の環境条件の制限を解消できる方法として、温度、pH、圧力など、環境の負荷に強い生物体として細菌の胞子(芽胞)〔西 賢司、加藤 良、富田 守:Bacillus属芽胞の圧力による活性化と殺菌、醸造協会誌、50巻(2号)104110,1995年〕を使用する工法について鋭意研究を行い、本願に係る発明を完成させた。
因みに、従来の工法で用いられて来た微生物は、温度100℃、あるいは圧力5MPa程度で完全に死滅するが、本願に係る発明で開発した菌材は100℃でも死滅することなく、圧力200MPaでも死滅しない。
本発明では使用する微生物として、芽胞を形成し、温度70℃でも生存できる菌株で、好気的条件下で、石油関連物質(炭化水素)を分解する細菌を選抜した。検索した複数の細
菌を同時に作用させることによって高分子の炭化水素化合物(炭素数35以上の炭化水素)を分解する機能を発揮させることに成功し、本願に係る技術発明を完成した。
これらの菌株のリボソームDNA(16S rDNA-500)の塩基配列、すなわち、配列表の配列番号1 (SEQ ID NO: 1)や配列表の配列番号2 (SEQ ID NO: 2)に対する相同性の分析から、Bacillus siamensis PD-A10T株、Bacillus amyloliquefaciens NBRC 15535T株、及びBacillus velezensis CR-50T株からなる群から選択されたものと高い遺伝子の相同性(例えば、99.6%の相同性)を示すが、その相同性よりも高い遺伝子相同性を有するものを、本発明のバシルス(Bacillus)属菌に含めてよい。
このような上記菌株と一定の類似性を示す微生物は、石油関連物質、例えば、揮発油の分解活性を指標にする、実施例1に記載された手法を利用したり、土壌試料から、配列番号1〜2に記載の塩基配列を指標として単離してくることができる。
上記培養における温度条件は、使用する微生物の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定する。例えば20〜30℃、好ましくは25℃に設定することができる。なお、培地のpHは、6.5〜7.5の範囲に設定すればよい。
培養時間は、栄養源の量や種類により異なるが、十分な増殖を達成できるように選ぶことが可能である。例えば、培養時間は、数分間とか、数時間とか、数日であっても良い。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
石油関連物質の分解能を持つ菌株を、下記の手法で検索を行った。
すなわち、口径1.3 cmのガラス製試験管に滅菌した液体(0.5%のペプトンと0.1%の酵母エキスを含む水溶液)5mLと0.5mL〜1.0mLの潤滑油を入れ攪拌する。
これをスクリーニング培地として、分離源のサンプルを少量添加して、27℃で振盪培養した。
この培養液では、静置すると石油関連物質は液上面に層を形成して培養液層と分離するが、この石油層が培養により減少したサンプルの培養液層を上記スクリーニング培地に繰り返して移植し、微生物を集積培養した。
このスクリーニング培養の一例を図1の写真に示すが、この手法で潤滑油の分解活性を有すると看做した菌株を集めた。因みに、本発明に係る研究では、本実施例で示した様に、石油分解菌を包含した球状の液泡を形成する(図1の写真参照)ことを発見し、これを指標として、容易に石油分解菌の検出を可能にした。
この手法で、大阪府堺市内の土壌を試料として、石油(潤滑油)を分解する活性を有する微生物の検索を行い、市内の汚泥中から目的に適う細菌(sf-1株と称する)と(sf-5株と称する)の2株を単離した。sf-1株は、潤滑油の分解活性は微弱であるが、界面活性機能を持つ物質を生産し、sf-5株の潤滑油の分解を促進した。
本発明に関する石油関連物質に汚染された土壌の除染活性の測定(以下、活性の測定)は、下記の手法に沿って行った。
使用した土壌品は、大阪府内の山林を整地して造成した農場用地で採取した。石油汚染土の試料は、前記の農場用地の表面からの深度約1メートルで採取した土を用い、これにディーゼル油及び/又は潤滑油を吸着させて調製した。ディーゼル油および潤滑油は何れも日本国内で市販されている商品を用いた。
これに、sf-1株およびsf-5株の胞子の混合物(M-U)およびM-U中の胞子の発芽・増殖を誘発し、促進する素材(A-U)を添加し、充分攪拌して、活性測定用サンプルとした。
活性の測定は、次の手順で行った。すなわち、上記の活性測定用サンプルを27℃で反応させ、サンプル中の石油関連物質は、下記の〔石油関連物質の抽出法〕に示す手法で抽出して抽出物の重量の変化を測定する重量法およぴ、表1に示す条件での、ガスクロマトグラフィー法(GC-FID)によって分析した。
本発明に関する石油関連物質に汚染された土(及び/又は汚染土標品と呼ぶ)の除染活性の測定(以下、活性の測定)は、下記の手法に沿って行った。
土標品にディーゼル油あるいは潤滑油を所定の重量比で添加し、ブレンダーを用いて充分に攪拌して石油汚染土サンプルとした。これに、M-U及びA-Uを添加し、ブレンダーで充分攪拌して活性測定用サンプルとした。
活性の測定は、次の手順で行った。すなわち、上記の活性測定用サンプルを27℃で反応させ、サンプル中の石油関連物質は、下記の〔石油関連物質の抽出法〕の手法で抽出して重量の変化を測定する重量法および、表1に示す条件での、ガスクロマトグラフィー法(GC-FID)によっても分析した。
土標品からの石油関連物質の抽出の標準的な手順は次の通りである。すなわち、(1)5 gの土サンプルを50 mL容のファルコンチューブに入れ、(2)これに15 gのNa2SO4と15 mLのn-ヘキサンを添加し、攪拌して、石油関連物質を抽出し、(3)抽出液を濾過で集めた。この操作を3回繰り返し、抽出液とした。(4)この抽出液を減圧濃縮してn-ヘキサンを除去して、石油関連物質を集め秤量して、石油関連物質の含量を測定した。この手法で、M-U及びA-Uの石油関連物質の分解活性を測定した。
また、表1に示した条件によるガスクロマトグラフィーによる常法の分析法によつても石油関連物質の含量を測定した。
実施例1で発見、単離したsf-1株及びsf-5株は、何れも好気性の細菌で、胞子を形成するグラム陽性の桿菌であった。これらの性質は、分類学上バシルス(Bacillus)属に分類される細菌であることを示している。
また、リボソームDNA(16S rDNA-500)の相同性の分析から(図2及び3)、この2菌株は、共にBacillus siamensisに近縁(相同率卒99.6%)なBacillus sp.と同定された。
sf-1株のDNAの塩基配列〔配列表の配列番号1 (SEQ ID NO: 1)〕
これらの事実から、sf-1株とsf-5株は、大量の微生物菌体を使用する石油汚染の除染(バイオオーグメンテーション)に用いるには、極めて適切な微生物であると評価される。 なお、マウスを用いる動物試験で、経口急性毒性および遅延型過敏反応の何れも陰性で有ることを確認している。
本発明で用いた土の標品は、何れも日本国内で山林を整地した農業用地で採取した。微生物資材としては、(1g中にsf-1株とsf-5株の胞子を各々107ヶを含む粉末:以下、M-Uと称する)を用いた。
さらに、微生物資材の発芽・増殖活性を持つ素材としてA-Uを開発した。A-Uの成分は、胞子の発芽および当該菌株の増殖活性を有する物質であれば、単品であれ混合物であれ、その組成を問わない。例えば、糖質、タンパク質、酵母の抽出物、核酸、リン酸、カリウム、カルシウム、マグネシウム塩などの混合物を使用したが、単品でも混合物の何れでも用いることが出来る。本発明のA-Uの一例を示せば、グルコース 2%、ペプトン 0.5%および酵母エキス 0.3%を含む混合物である。
以下、表2に示す組成の土の標品100 gを500 mL容のプラスチック製の容器に入れ綿栓をして、27℃で反応させ、ディーゼル油と潤滑油の分析を行い、M-Uの効果を評価した。
また、GC-FID法による分析結果から、この方法で、C30(炭素数30、クロマトグラム中の最大ピークの部分)程度の高分子の炭化水素が分解できることが明らかになった。現在までの知見によると、C30程度の高分子の炭化水素の微生物分解は容易では無いので、本発明の技術は極めて貴重な技術と言える。
反応中、1週間の間隔で試料表面から5 cmの深度の土を採取して、石油関連物質の濃度を測定した。測定結果を表7及び図6に示すが、22週間の反応で土中に潤滑油が検出不能になる状態になった。これらの結果、本発明の石油関連物質に汚染された土の除染への有効性が実証された。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
バシルス属(Bacillus sp.)菌af-5株: NITE P-02736
SEQ ID NO: 2, 16S-rDNA
Claims (12)
- バシルス(Bacillus)属の微生物を用いることを特徴とする石油関連物質の分解法。
- 微生物と微生物の増殖を促進する成分を併用することを特徴とする請求項1記載の石油関連物質の分解法。
- バイオマス物質を併用することを特徴とする請求項1記載の石油関連物質の分解法。
- バシルス(Bacillus)属細菌の胞子を用いることを特徴とする請求項1記載の石油関連物質の分解法。
- バシルス(Bacillus)属細菌が、Bacillus siamensis、Bacillus amyloliquefaciens、及びBacillus velezensisからなる群から選択されたものと遺伝子の相同性の高いBacillus属細菌であることを特徴とする請求項1記載の石油関連物質の分解法。
- 土壌中の高分子(炭素数30以上)の石油関連物質を分解することを特徴とする請求項1記載の石油関連物質の分解法。
- Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)の菌体又は胞子とBacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)の菌体又は胞子を併用することを特徴とする請求項1記載の石油関連物質の分解法。
- バシルス(Bacillus)属細菌を用いて水中の炭化水素を分解除去することを特徴とする方法。
- バシルス(Bacillus)属の微生物を用いることを特徴とする炭化水素類の生化学的分解法。
- Bacillus siamensis、Bacillus amyloliquefaciens、及びBacillus velezensisからなる群から選択されたものと遺伝子の相同性の高いバシルス(Bacillus)属細菌で、石油関連物質の分解活性を有することを特徴とするバシルス(Bacillus)属細菌又はその胞子。
- Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)及びその子孫、Bacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)及びその子孫、及びそれらの胞子(芽胞)からなる群から選択されたことを特徴とする微生物。
- Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)の菌体又は胞子とBacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)の菌体又は胞子を有効成分として含有することを特徴とする環境汚染物質除去剤。
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