JP2018166418A - 石油汚染土壌の浄化用組成物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
項2.前記有機資材中のC/N比が10〜30である、項1に記載の製造方法。
項3.前記未発酵資材が前記有機資材中に60質量%以上含まれる、項1又は2に記載の製造方法。
項4.前記未発酵資材が、大豆かす、油かす、籾殻、魚粉、米ぬか、おから、ココナッツファイバー、ピートモス、稲ワラ、水苔、水草、おが屑、チップ、わら、落ち葉、刈草、及びバークからなる群から選択される少なくとも1種である、項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
項5.1×106 cells/g以上の石油分解菌、及び60質量%以上の未発酵資材を含む石油汚染土壌の浄化用組成物。
項6.前記未発酵資材が、大豆かす、油かす、籾殻、魚粉、米ぬか、おから、ココナッツファイバー、ピートモス、稲ワラ、水苔、水草、おが屑、チップ、わら、落ち葉、刈草、及びバークからなる群から選択される少なくとも1種である、項5に記載の組成物。
項7.項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法により製造された汚染土壌の浄化用組成物、又は項5若しくは6に記載の組成物を石油汚染土壌に添加する工程を含む石油汚染土壌の浄化方法。
本発明の石油汚染土壌の浄化用組成物の製造方法は、未発酵資材を含む有機資材に石油分解菌を植菌し培養する工程を含むことを特徴とする。
本発明の石油汚染土壌の浄化用組成物は、1×106 cells/g以上の石油分解菌、及び60質量%以上の未発酵資材を含むことを特徴とする。
本発明の石油汚染土壌の浄化方法は、上記製造方法により製造された汚染土壌の浄化用組成物、又は上記の浄化用組成物を石油汚染土壌に添加する工程を含むことを特徴とする。
・総細菌数
(1) 滅菌(121℃、15分間)した50 ml容ファルコンチューブに試料1.0 g、下記表1に示すDNA抽出緩衝液(pH 8.0) 8.0 ml、及び20%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム溶液1.0 mlを加えた。
(3) 攪拌後の溶液1.5 mlを滅菌済みエッペンドルフチューブに分取し、遠心分離(8,000 rpm、20℃、10分間)した。
(4) 水層700μlを新たなエッペンドルフチューブに分取し、クロロホルム・イソアミルアルコール(24:1, v/v) 700 mlを加えて緩やかに攪拌し、遠心分離(14,000 rpm、20℃、10分間)した。
(5) 水層500μlを新たなエッペンドルフチューブに分取し、2-プロパノール300μlを加えて緩やかに攪拌し、遠心分離(14,000 rpm、20℃、20分間)した。
(6) 水層を除去し、70%(v/v)エタノールを1.0 ml加え、遠心分離(14,000 rpm、20℃、5分間)した。
(7) 水層を除去し、減圧乾燥(アスピレーターで30分間)した。
(8) 下記表2に示す10:1 TE 緩衝液(pH 8.0)を50μl加えて溶解し、eDNA溶液とした。
(10) 画像解析ソフトウェアKODAK 1D Image Analysis software (KODAK)を用いてsmart LadderのDNAバンドを解析し、蛍光強度に対するDNA量の検量線を作成し、この検量線を用いてゲルDNA量を得た。
(11) 得られたゲルDNA量から、下記式によりeDNA量を算出した。
総細菌数(cells/g-soil)=eDNA量(μg/g)×1.70×108[R2=0.938]
前述するのと同様の方法で、eDNA溶液を調製した。eDNA溶液15μlをアガロースゲル電気泳動に供した。アガロースゲルからDNAバンドを切り出し、eDNAを精製した。KAPA SYBR (登録商標) FAST qPCR Master Mixを10μl、10μMのフォワードプライマー(5'-AACTAYMTCGARCAYTAYGG-3':配列番号1)及びリバースプライマー(5'-TGRTCKSWRTGNCGYTGVARGTG-3':配列番号2)を1μl、ROX highを0.4μl、精製したeDNAを1〜5μl含む20μlの反応液を200μl容チューブに加え、Applied Biosystems 7300 Real Time System (Applied Biosystems)にセットして、リアルタイムPCRを行った。PCRの反応条件は、95℃・5〜10分の加熱後、95℃・15〜30秒、60℃・30〜60秒の反応を40サイクルとした。なお、リアルタイムPCRに用いた試料のうち、KAPA SYBR、ROX highは、KAPA SYBR qPCR kit (Kapa Biosystems)のプロトコールに従って用いた。得られたCt値から以下の式を使って石油分解菌数を算出した。
石油分解菌数(cells/g-sample) = (3×1014) × e(-0.516×Ct値)
この方法により、石油分解菌を特異的に高感度で定量することができる。
発酵資材として牛糞堆肥(発酵乾燥牛ふん、京種株式会社)と鶏糞堆肥(発酵鶏ふん、アグリエヌワイ)を、未発酵資材として大豆かす(加工大豆、株式会社J-オイルミルズ)とピートモス(ピートモス, グリーンメール)を選択した。各バイオマスの乾燥状態の総炭素量(TC)を全有機体炭素計(TOC-V CPH、株式会社島津製作所)及び固体試料燃焼装置(SSM-5000A、株式会社島津製作所)を用いて測定した。また、総窒素量(TN)をケルダール法及びインドフェノール青法で測定した。乾燥状態のバイオマスのTC、TN及びC/N比を以下の表3に示す。
発酵資材のみの混合バイオマスと発酵資材と未発酵資材を用いた混合バイオマスでのロドコッカス・エリスロポリスNDKK6の生育挙動を解析した。培養は、バイオマス300 mlに、5×105 cells/g-biomassとなるように植菌し、室温、静置培養で行った。また、バイオマスはオートクレーブ滅菌したものを使用した。各混合バイオマス1 g中のロドコッカス・エリスロポリスNDKK6数をロドコッカス・エリスロポリスNDKK6が有するalkB R2遺伝子を用いたreal-time PCRによって4週間定量した。結果を以下の表4に示す。
試験例2と同様に発酵資材のみの混合バイオマスと発酵資材と未発酵資材を用いた混合バイオマスでの石油分解菌ゴルドニア・テラエNDKY76Aの生育挙動を解析した。各混合バイオマス1 g中のゴルドニア・テラエNDKY76A数をゴルドニア・テラエNDKY76Aが有するalkB GT遺伝子を用いたreal-time PCRによって4週間定量した。結果を表6に示す。
未発酵資材のみを用いた混合バイオマス(大豆かす・ピートモス)中のロドコッカス・エリスロポリスNDKK6の生育挙動を試験例2と同様に解析した。結果を表8に示す。
未発酵資材のみを用いた混合バイオマス(大豆かす・ピートモス)中のゴルドニア・テラエNDKY76Aの生育挙動を試験例2と同様に解析した。結果を表10に示す。
ロドコッカス・エリスロポリスNDKK6の生育に適したバイオマスを探索したところ、未発酵資材である大豆かすとピートモスを混合させたC/N比が20のバイオマスでロドコッカス・エリスロポリスNDKK6が維持・活性化されることが分かった。そこで、このバイオマスを用いて炭化水素汚染土壌のバイオレメディエーションを行った。
石油分解菌ロドコッカス・エリスロポリスNDKK6と同様に、石油分解菌ゴルドニア・テラエNDKY76Aの生育に適したバイオマスを探索したところ、未発酵資材である大豆かすとピートモスを混合させたC/N比が20のバイオマスでゴルドニア・テラエNDKY76Aが維持・活性化されることが分かった。この結果は、石油分解菌ロドコッカス・エリスロポリスNDKK6と同様であった。そこで、このバイオマスを用いて炭化水素汚染土壌のバイオレメディエーションを行った。
Claims (7)
- 未発酵資材を含む有機資材に石油分解菌を植菌し培養する工程を含む石油汚染土壌の浄化用組成物の製造方法。
- 前記有機資材中のC/N比が10〜30である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記未発酵資材が前記有機資材中に60質量%以上含まれる、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記未発酵資材が、大豆かす、油かす、籾殻、魚粉、米ぬか、おから、ココナッツファイバー、ピートモス、稲ワラ、水苔、水草、おが屑、チップ、わら、落ち葉、刈草、及びバークからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 1×106 cells/g以上の石油分解菌、及び60質量%以上の未発酵資材を含む石油汚染土壌の浄化用組成物。
- 前記未発酵資材が、大豆かす、油かす、籾殻、魚粉、米ぬか、おから、ココナッツファイバー、ピートモス、稲ワラ、水苔、水草、おが屑、チップ、わら、落ち葉、刈草、及びバークからなる群から選択される少なくとも1種である、請求項5に記載の組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法により製造された汚染土壌の浄化用組成物、又は請求項5若しくは6に記載の組成物を石油汚染土壌に添加する工程を含む石油汚染土壌の浄化方法。
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