KR102545863B1 - 바실루스속 세균 아포의 제조 방법 - Google Patents

바실루스속 세균 아포의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

바실루스속 세균을, C/N 비 (탄소 함량과 질소 함량의 중량비) 가 4 보다 크고 9.5 미만인 액체 배지를 사용하여 배양하는 공정을 포함하는, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.

Description

바실루스속 세균 아포의 제조 방법 {SPORULATION METHOD OF BACILLUS BACTERIUM}
본 발명은, 바실루스속 세균의 아포를 효과적으로 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
바실루스속 세균은 효소나 유용 물질의 생산, 발효 식품의 생산, 유기물의 분해, 미생물 농약이나 미생물 비료 등, 여러 가지 분야에 이용되고 있다. 이러한 미생물 농약, 미생물 비료 등의 이용 상황에서는 바실루스속 세균의 아포를 이용하는 것이 일반적이다. 그러나, 이러한 용도에서 우수한 성능을 발휘하는 균주라고 하더라도, 효율적으로 아포를 형성할 수 없으면 제품화하는 것이 곤란하였다.
바실루스속 세균의 액체 배양에 자주 사용되는 배지로서, 영양 배지 (Nutrient Broth) (DIFCO), 루리아 베르타니 배지 (Luria Bertani broth), 트립티케이스 소이 배지 (Trypticase Soy Broth) (벡턴·디킨슨) 등을 들 수 있는데, 이들 배지에서는 충분한 증식성이 얻어지지 않아, 거의 아포 형성이 보이지 않는 경우가 있었다.
특허문헌 1 에 있어서, 증식 후에 용존 산소 농도를 저하시키는 공정을 포함하는 배양을 실시함으로써 아포 형성시키는 방법이 나타나 있지만, 어떤 종류의 바실루스속 세균에 있어서는, 동일한 수법을 사용하더라도 효율적으로 아포를 형성시키는 것이 곤란하다. 또, 본 방법에서는 배양 공정에 있어서 교반이나 통기 조건의 조정이 필요하기 때문에, 제조 공정이 번잡해질 수 있다.
특허문헌 2 에 있어서, 탄소원을 모두 소비한 후에 장시간 배양을 계속함으로써 아포 형성시키는 방법이 나타나 있지만, 배양이 장기화되기 때문에 배양 비용이 높아져, 실제조에 적합하지 않다. 또, 어떤 종류의 바실루스속 세균에 있어서는, 동일한 수법을 사용하더라도 아포를 형성시키는 것이 곤란하다.
특허문헌 3 에 있어서, 배양액의 인산염 농도의 범위 및 배양 조건으로서 산소 공급량, 교반 속도의 범위를 규정함으로써 아포를 생산하는 방법이 나타나 있지만, 어떤 종류의 바실루스속 세균에 있어서는, 동일한 수법을 사용하더라도 효율적으로 아포를 형성시키는 것이 곤란하다. 또, 실시에 있어서는, 규정되는 배양 조건을 달성할 수 있는 배양 설비를 사용하는 것이 필요해진다.
일본 공개특허공보 2007-236286호 일본 공개특허공보 2000-217567호 일본 공개특허공보 2007-195542호
본 발명은, 일반적인 세균용 액체 배지에서는 아포 형성이 곤란한 바실루스속 세균에 대해, 효율적으로 아포를 생산할 수 있는 배양 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시한 결과, 일반적인 세균용 액체 배지를 사용한 배양에 있어서 아포의 생산 효율이 충분하지 않은 바실루스속 세균에 대해서도, 효율적으로 균체를 증식시키고, 또한 아포를 형성시키는 데에 적합한 액체 배지 조성을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 이하와 같다.
[1] 바실루스속 세균을, C/N 비 (탄소 함량과 질소 함량의 중량비) 가 4.0 보다 크고 9.5 미만인 액체 배지를 사용하여 배양하는 공정을 포함하는, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[2] 배양에 사용하는 액체 배지의 C/N 비가 4.5 이상 9.5 미만인, [1] 에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[3] 배양에 사용하는 액체 배지의 C/N 비가 4.5 이상 7.5 이하인, [1] 에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[4] 배양에 사용하는 액체 배지의 C/N 비가 6.0 이상 7.5 이하인, [1] 에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[5] 액체 배지에 있어서의 탄소 함량이 50 g/ℓ 이하인, [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[6] 액체 배지에 있어서의 탄소 함량이 25 g/ℓ 이하인, [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[7] 액체 배지에 있어서의 칼륨 함량이 2.0 g/ℓ 미만인, [1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[8] 액체 배지에 있어서의 칼륨 함량이 1.9 g/ℓ 이하인, [1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[9] 액체 배지에 포함되는 탄소원 및 질소원은 바실루스속 세균이 이화 (異化) 할 수 있는 탄소원 및 질소원인, [1] ∼ [8] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[10] 바실루스속 세균이 이화할 수 있는 탄소원은, 전분, 글루코오스, 락토오스, 글리세롤, 아라비노오스, 리보오스, 자일로오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 만노오스, 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 셀로비오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 자일리톨, 알코올, 유기산, 유기산염, 및 알칸으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류 이상의 탄소원이고, 바실루스속 세균이 이화할 수 있는 질소원은, 대두 유래 성분, 효모 유래 성분, 콘 유래 성분, 동식물 단백질 및 그 분해물, 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염, 암모니아, 질산나트륨, 질산칼륨, 글루타민산나트륨, 우레아 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류 이상의 질소원인, [9] 에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[11] 바실루스속 세균이, 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex), 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스·아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스·푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실루스·메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실루스·투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실루스·포필리에 (Bacillus popilliae), 바실루스·세레우스 (Bacillus cereus), 바실루스·리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스·피르무스 (Bacillus firmus), 바실루스·벨레젠시스 (Bacillus velezensis), 바실루스·스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus), 바실루스·피치노티 (Bacillus pichinotyi), 바실루스·아시도칼다리우스 (Bacillus acidocaldarius), 바실루스·알카로필러스 (Bacillus alcalophilus), 바실루스·알칼리콜라 (Bacillus alkalicola), 바실루스·코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실루스·아조토포르만스 (Bacillus azotoformans), 바실루스·안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실루스·시아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스·바디우스 (Bacillus badius), 바실루스·바타비엔시스 (Bacillus bataviensis), 바실루스·브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스·시클로헵타니쿠스 (Bacillus cycloheptanicus), 바실루스·서큘란스 (Bacillus circulans), 바실루스·아네우리니리티커스 (Bacillus aneurinilyticus), 바실루스·미굴라너스 (Bacillus migulanus), 바실루스·아비살리스 (Bacillus abyssalis), 바실루스·에스투아리 (Bacillus aestuarii), 바실루스·폴리믹사 (Bacillus polymyxa), 또는 바실루스·에스피 (Bacillus sp .) 인, [1] ∼ [10] 중 어느 한 항에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
[12] 바실루스속 세균이, 바실루스·시아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex) 또는 바실루스·메가테리움 (Bacillus megaterium) 인, [1] ∼ [10] 중 어느 하나에 기재된 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
본 발명에 의하면, 바실루스속 세균의 안정적인 증식, 아포 형성이 보여지고, 더욱 고농도로 증식시켜, 높은 비율로 아포를 형성시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 바실루스속 세균으로는 바실루스속으로 분류되는 세균이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex), 바실루스·서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스·아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스·푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실루스·메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실루스·투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis), 바실루스·포필리에 (Bacillus popilliae), 바실루스·세레우스 (Bacillus cereus), 바실루스·리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스·피르무스 (Bacillus firmus), 바실루스·벨레젠시스 (Bacillus velezensis), 바실루스·스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus), 바실루스·피치노티 (Bacillus pichinotyi), 바실루스·아시도칼다리우스 (Bacillus acidocaldarius), 바실루스·알카로필러스 (Bacillus alcalophilus), 바실루스·알칼리콜라 (Bacillus alkalicola), 바실루스·코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실루스·아조토포르만스 (Bacillus azotoformans), 바실루스·안트라시스 (Bacillus anthracis), 바실루스·시아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스·바디우스 (Bacillus badius), 바실루스·바타비엔시스 (Bacillus bataviensis), 바실루스·브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스·시클로헵타니쿠스 (Bacillus cycloheptanicus), 바실루스·서큘란스 (Bacillus circulans), 바실루스·아네우리니리티커스 (Bacillus aneurinilyticus), 바실루스·미굴라너스 (Bacillus migulanus), 바실루스·아비살리스 (Bacillus abyssalis), 바실루스·에스투아리 (Bacillus aestuarii), 바실루스·폴리믹사 (Bacillus polymyxa), 또는 바실루스·에스피 (Bacillus sp .) 를 들 수 있다.
이 중에서는, 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex), 바실루스·시아멘시스 (Bacillus siamensis) 또는 바실루스·메가테리움 (Bacillus megaterium) 이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 배양에는 C/N 비 (탄소 함량과 질소 함량의 중량비) 가 4.0 보다 크고 9.5 미만인 액체 배지를 사용한다. 여기에서, C/N 비는 4.5 이상 9.5 미만인 것이 바람직하고, 4.5 이상 7.5 이하인 것이 보다 바람직하고, 6.0 이상 7.5 이하인 것이 더욱 바람직하다.
C/N 비는 이하와 같이 산출된다.
C/N 비 = 각 배지 성분에 포함되는 탄소 함량의 합계 ÷ 각 배지 성분에 포함되는 질소 함량의 합계.
본 발명에 있어서 사용되는 액체 배지에 있어서는, 탄소 함량이 50 g/ℓ 이하인 것이 바람직하고, 25 g/ℓ 이하인 것이 보다 바람직하다. 한편, 탄소 함량은 3 g/ℓ 이상인 것이 바람직하다.
배양에 사용하는 액체 배지의 탄소원 및 질소원은 바실루스속 세균이 이화할 수 있는 것을 사용할 수 있는데, 이화 가능한 탄소원으로서, 바실루스속 세균이 이화할 수 있는 당 (전분, 글루코오스, 락토오스, 글리세롤, 아라비노오스, 리보스, 자일로오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 만노오스, 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 셀로비오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 자일리톨 등), 알코올, 유기산, 유기산염, 알칸 또는 다른 일반적인 탄소원이 예시되고, 이화 가능한 질소원으로서, 대두 유래 성분, 효모 유래 성분, 콘 유래 성분, 동식물 단백질 및 그 분해물, 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염, 암모니아, 질산나트륨, 질산칼륨, 글루타민산나트륨, 우레아 등이 예시된다.
또, 본 발명에 있어서 사용되는 액체 배지에 있어서는, 추가적인 고아포화율을 달성하기 위해, 칼륨 함량이 2 g/ℓ 미만인 것이 바람직하고, 1.9 g/ℓ 이하인 것이 보다 바람직하다. 칼륨 함량은 0.2 g/ℓ 이상인 것이 바람직하다. 칼륨의 공급원으로서, 예를 들어, 대두 유래 성분, 효모 유래 성분, 콘 유래 성분, 동식물 단백질 및 그 분해물, KH2PO4, K2HPO4, KCl 등에서 적어도 1 종류 이상을 선택하여 배양을 실시한다.
그 밖의 배지 성분으로는, 아포 형성에 악영향을 미치지 않는 한, 바실루스속 세균의 배양에 통상적으로 사용되는 미량 금속염 등의 배지 성분을 첨가해도 되고, 또한, 필요에 따라 아미노산 또는 비타민 등을 첨가할 수 있다.
배양 조건으로는, 통상적인 바실루스속 세균의 액체 배양에 사용되는 조건이면 되는데, 예를 들어, 20 ∼ 40 ℃ 에서, 호기 조건 (예를 들어, 산소 농도 15 ∼ 50 ％) 에서, 교반하면서, 10 ∼ 100 시간 배양하는 조건이 예시된다. 배지의 pH 는 6.5 ∼ 8.5 가 바람직하고, 7.0 ∼ 8.0 이 보다 바람직하다.
또한, 상기 C/N 비의 액체 배지에서 배양하기 전에, 전배양을 실시해도 된다.
이와 같이 하여, 높은 아포화율 (예를 들어, 50 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상) 의 바실루스속 세균의 균체가 얻어진다. 이러한 높은 아포화율의 바실루스속 세균의 균체는, 적절히 배지의 농축 또는 제거, 건조 등의 조작을 실시한 다음에, 원하는 목적으로 사용할 수 있다.
[ 실시예]
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
＜바실루스·심플렉스 NBRC15720 주의 평가＞
500 ㎖ 삼각 플라스크를 사용하여, 표 1 에 기재된 종농도가 되도록, 글루코오스 (와코 순약), 탈지 대두 분말 (아지노모토 헬시 서플라이), 효모 엑기스 (Difco), CSL (Corn Steep Liquor : ROQUETTE), 펩톤 (Difco), KH2PO4 (와코 순약) 를 함유하고, 또한 MnCl2 (와코 순약) 를 100 ppm, NaCl (와코 순약) 을 400 ppm, MgCl2 (와코 순약) 를 250 ppm, CaCl2 (와코 순약) 를 75 ppm, FeSO4 (와코 순약) 를 0.3 ppm 함유시킨 배지를 각각 100 ㎖ 씩 제작하고, 실리콘 마개를 끼워 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 메일라드 반응을 피하기 위해, 별도 멸균한 후 무균적으로 혼합하였다).
먼저, 보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·심플렉스 NBRC15720 주의 콜로니로부터 1 백금이를 취하여, 표 1 의 배지 조건 1 에 기재된 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다.
얻어진 전배양액으로부터 3 ㎖ 를, 표 1 에 기재된 각종 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 150 rpm 으로 40 시간 ∼ 72 시간 진탕 배양을 실시하여, 배양액을 얻었다.
배양 후, 광학 현미경 및 세균용 셀 카운터를 사용하여, 배양액 중의 균체 농도 및 균체의 아포화율을 계측하였다.
균체 농도, 아포 농도, 아포화율의 측정 방법은 이하와 같다.
배양액 중에 증식된 바실루스·심플렉스균을 멸균수, 0.01 ％ Tween 20 액 등으로 희석한 후에, 균체 농도 (영양 세포 및 아포), 아포 농도를 세균용 셀 카운터에 의해 카운트하였다. 아포화율은 아포 농도 ÷ 균체 농도로 산출하였다.
C/N 비는 각 배지 성분에 포함되는 탄소 함량과 질소 함량의 중량비로부터 산출하였다.
C/N 비 = 각 배지 성분에 포함되는 탄소 함량의 합계 ÷ 각 배지 성분에 포함되는 질소 함량의 합계.
각 배지 성분의 탄소 함량의 측정은, 산 중에서 가수분해한 후 소모기법으로 환원당 농도를 정량 후, 전체 당량 (糖量) 에 0.4 를 곱하여 산출하였다.
각 배지 성분의 질소 함량의 측정은, 켈달법에 의해 실시하였다.
각 배지 성분에 포함되는 칼륨 함량의 측정은, 원자 흡광 광도법 (측정 파장 766.5 ㎚) 에 의해 실시하였다.
Figure 112017107226099-pct00001
결과를 표 2 에 나타낸다. C/N 비가 9.5 이상의 조건에 있어서, 균체의 증식은 보이지만, 아포화율의 저하가 확인되었다. 한편, C/N 비가 4.0 이하의 조건에 있어서, 균체의 증식은 보이지만, 아포화율의 저하가 확인되었다. 또, 칼륨 함량은 0.2 ∼ 1.9 g/ℓ 의 범위가 양호한 것을 알 수 있었다.
Figure 112017107226099-pct00002
실시예 2
＜바실루스·심플렉스 NBRC104473 주의 평가＞
500 ㎖ 삼각 플라스크를 사용하여, 표 3 에 기재된 배지 조건 1 ∼ 3 의 종농도가 되도록, 글루코오스 (와코 순약), 탈지 대두 분말 (아지노모토 헬시 서플라이), 효모 엑기스 (Difco), CSL (ROQUETTE), 펩톤 (Difco), KH2PO4 (와코 순약) 를 함유하고, 또한 각각 MnCl2 (와코 순약) 를 100 ppm, NaCl (와코 순약) 을 400 ppm, MgCl2 (와코 순약) 를 250 ppm, CaCl2 (와코 순약) 를 75 ppm, FeSO4 (와코 순약) 를 0.3 ppm 함유시킨 배지를 각각 100 ㎖ 씩 제작하고, 실리콘 마개를 끼워 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 메일라드 반응을 피하기 위해, 별도 멸균한 후 무균적으로 혼합하였다).
보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·심플렉스 NBRC104473 주의 콜로니로부터 1 백금이를 취하여, 표 3 에 기재된 배지 조건 1 에 기재된 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다. 얻어진 바실루스·심플렉스 NBRC104473 주의 전배양액으로부터 각각 3 ㎖ 를, 표 3 에 기재된 각 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 150 rpm 으로 40 시간 ∼ 72 시간 진탕 배양을 실시하여, 배양액을 얻었다. 배양 후, 광학 현미경 및 세균용 셀 카운터를 사용하여, 배양액 중의 균체 농도 및 균체의 아포화율을 계측하였다.
Figure 112017107226099-pct00003
결과를 표 4 에 나타낸다. NBRC104473 주에 대해서도 실시예 1 과 동일한 경향이 보였다.
Figure 112017107226099-pct00004
실시예 3
＜대용량 배양계에서의 평가＞
5 ℓ 용 배양조를 사용하여, 표 5 에 기재된 배지 조건 1 ∼ 3 의 종농도가 되도록, 글루코오스 (와코 순약), 탈지 대두 분말 (아지노모토 헬시 서플라이), 효모 엑기스 (Difco), CSL (ROQUETTE), 펩톤 (Difco), KH2PO4 (와코 순약) 를 함유하고, 또한 각각 MnCl2 (와코 순약) 를 100 ppm, NaCl (와코 순약) 을 400 ppm, MgCl2 (와코 순약) 를 250 ppm, CaCl2 (와코 순약) 를 75 ppm, FeSO4 (와코 순약) 를 0.3 ppm 함유시킨 배지를 각각 2,000 ㎖ 씩 제작하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 메일라드 반응을 피하기 위해, 별도 멸균한 후 무균적으로 혼합하였다).
보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·심플렉스 NBRC15720 의 콜로니로부터 1 백금이를 취하여, 500 ㎖ 용 삼각 플라스크에 제작한 실시예 1 (표 1) 에 기재된 배지 조건 1 의 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다. 얻어진 바실루스·심플렉스 NBRC15720 주의 전배양액으로부터 각각 60 ㎖ 를, 표 5 에 기재된 각 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 400 rpm 의 조건으로 40 시간, 통기 교반 배양을 실시하여, 배양액을 얻었다. 배양 후, 광학 현미경 및 세균용 셀 카운터를 사용하여, 배양액 중의 균체 농도 및 균체의 아포화율을 계측하였다.
Figure 112017107226099-pct00005
결과를 표 6 에 나타낸다. C/N 이 일정한 범위이면, 대용량 배양계에서도, 바실루스·심플렉스 NBRC15720 주의 50 ％ 이상의 아포화율이 얻어졌다.
Figure 112017107226099-pct00006
실시예 4
＜대용량 배양계에서의 바실루스·시아멘시스의 평가＞
5 ℓ 용 배양조를 사용하여, 표 7 에 기재된 배지 조건 1 ∼ 3 의 종농도가 되도록, 글루코오스 (와코 순약), 탈지 대두 분말 (아지노모토 헬시 서플라이), 효모 엑기스 (Difco), CSL (ROQUETTE), 펩톤 (Difco), KH2PO4 (와코 순약) 를 함유하고, 또한 각각 MnCl2 (와코 순약) 를 100 ppm, NaCl (와코 순약) 을 400 ppm, MgCl2 (와코 순약) 를 250 ppm, CaCl2 (와코 순약) 를 75 ppm, FeSO4 (와코 순약) 를 0.3 ppm 함유시킨 배지를 각각 2,000 ㎖ 씩 제작하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 메일라드 반응을 피하기 위해, 별도 멸균한 후 무균적으로 혼합하였다).
보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·시아멘시스의 콜로니로부터 1 백금이를 취하여, 500 ㎖ 용 삼각 플라스크에 제작한 표 7 에 기재된 배지 조건 1 의 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다. 얻어진 바실루스·시아멘시스의 전배양액으로부터 각각 60 ㎖ 를, 표 7 에 기재된 각종 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 400 rpm 의 조건으로 40 시간, 통기 교반 배양을 실시하여, 배양액을 얻었다. 배양 후, 광학 현미경 및 세균용 셀 카운터를 사용하여, 배양액 중의 균체 농도 및 균체의 아포화율을 계측하였다.
Figure 112017107226099-pct00007
결과를 표 8 에 나타낸다. C/N 이 일정한 범위이면, 대용량 배양계에서, 바실루스·시아멘시스의 88 ％ 이상의 아포화율이 얻어졌다.
Figure 112017107226099-pct00008
실시예 5
＜대용량 배양계에서의 바실루스·메가테리움의 평가＞
5 ℓ 용 배양조를 사용하여, 표 9 에 기재된 배지 조건 1 ∼ 3 의 종농도가 되도록, 글루코오스 (와코 순약), 탈지 대두 분말 (아지노모토 헬시 서플라이), 효모 엑기스 (Difco), CSL (ROQUETTE), 펩톤 (Difco), KH2PO4 (와코 순약) 를 함유하고, 또한 각각 MnCl2 (와코 순약) 를 100 ppm, NaCl (와코 순약) 을 400 ppm, MgCl2 (와코 순약) 를 250 ppm, CaCl2 (와코 순약) 를 75 ppm, FeSO4 (와코 순약) 를 0.3 ppm 함유시킨 배지를 각각 2,000 ㎖ 씩 제작하고, 오토클레이브 멸균을 실시하였다 (글루코오스는 메일라드 반응을 피하기 위해, 별도 멸균한 후 무균적으로 혼합하였다).
보통 한천 평판 배지 상에 생육시킨 바실루스·메가테리움의 콜로니로부터 1 백금이를 취하여, 500 ㎖ 용 삼각 플라스크에 제작한 표 9 에 기재된 배지 조건 1 의 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 150 rpm 으로 하룻밤 진탕 배양을 실시하여, 전배양액을 얻었다. 얻어진 바실루스·메가테리움의 전배양액으로부터 각각 60 ㎖ 를, 표 9 에 기재된 각종 배지에 무균적으로 식균하고, 37 ℃, 400 rpm 의 조건으로 40 시간, 통기 교반 배양을 실시하여, 배양액을 얻었다. 배양 후, 광학 현미경 및 세균용 셀 카운터를 사용하여, 배양액 중의 균체 농도 및 균체의 아포화율을 계측하였다.
Figure 112017107226099-pct00009
결과를 표 10 에 나타낸다. C/N 이 일정한 범위이면, 대용량 배양계에서, 바실루스·메가테리움의 78 ％ 이상의 아포화율이 얻어졌다.
Figure 112017107226099-pct00010

Claims (12)

  1. 바실루스속 세균을, C/N 비 (탄소 함량과 질소 함량의 중량비) 가 4.5 이상 9.5 미만이고, 칼륨 함량이 1.9 g/ℓ 이하인 액체 배지를 사용하여 배양하는 공정을 포함하는, 바실루스·시아멘시스 (Bacillus siamensis), 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex) 및 바실루스·메가테리움 (Bacillus megaterium) 으로부터 선택되는 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    배양에 사용하는 액체 배지의 C/N 비가 4.5 이상 7.5 이하인, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    배양에 사용하는 액체 배지의 C/N 비가 6.0 이상 7.5 이하인, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    액체 배지에 있어서의 탄소 함량이 50 g/ℓ 이하인, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    액체 배지에 있어서의 탄소 함량이 25 g/ℓ 이하인, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    액체 배지에 포함되는 탄소원 및 질소원은 바실루스속 세균이 이화할 수 있는 탄소원 및 질소원인, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    바실루스속 세균이 이화할 수 있는 탄소원은, 전분, 글루코오스, 락토오스, 글리세롤, 아라비노오스, 리보오스, 자일로오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 만노오스, 이노시톨, 만니톨, 소르비톨, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 셀로비오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 자일리톨, 알코올, 유기산, 유기산염, 및 알칸으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류 이상의 탄소원이고, 바실루스속 세균이 이화할 수 있는 질소원은, 대두 유래 성분, 효모 유래 성분, 콘 유래 성분, 동식물 단백질 및 그 분해물, 질산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염, 암모니아, 질산나트륨, 질산칼륨, 글루타민산나트륨, 우레아 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종류 이상의 질소원인, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    바실루스속 세균이, 바실루스·심플렉스 (Bacillus simplex) 인, 바실루스속 세균의 아포의 제조 방법.
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