CN109804062A - 芽孢杆菌属细菌的培养方法和有用物质的制造方法 - Google Patents

芽孢杆菌属细菌的培养方法和有用物质的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供能够高效地生产芽孢杆菌属细菌的芽孢的培养方法。本发明提供一种芽孢杆菌属细菌的芽孢的制造方法，其特征在于，在培养开始时的糖或糖源原料的浓度为50.1g/L～100g/L的液体培养基中培养芽孢杆菌属细菌，在培养过程中向所述液体培养基供给包含糖或糖源原料和含氮化合物、碳原子与氮原子的重量比(C/N比)为5.5～13.5的补料培养基并进行培养。

Description

芽孢杆菌属细菌的培养方法和有用物质的制造方法
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌属细菌的培养方法。
背景技术
在食品、医药、畜产等众多领域中，正在广泛利用芽孢杆菌属细菌或芽孢杆菌属细菌所生产的有效成分。特别是在以活菌为有效成分的微生物农药、整肠剂中，从耐久性、稳定性的方面考虑一般将芽孢杆菌属细菌以芽孢的状态流通、利用。
一般而言，芽孢杆菌属细菌的培养中主要使用包含糖等碳源、氨基酸、无机铵盐等氮源以及矿物质等的液体培养基。
非专利文献1中公开了，在用包含这些成分的液体培养基通过分批培养方法培养芽孢杆菌属细菌时，可得到3.5E+09spore/ml左右的芽孢。
专利文献1中公开了通过在利用分别最大包含5％、10％、20％、10％、20％的糖类、酵母提取物、玉米浸渍液干燥物、大豆蛋白胨和浓缩烧酒酒糟的培养基中利用包含如下工序的条件进行培养，可得到高浓度的芽孢杆菌属细菌的芽孢，即：将对数增殖期以后的氧浓度控制为10％以下的工序。但是，对于芽孢杆菌属细菌的增殖而言，期望在体系中充分存在氧，另外，芽孢杆菌属细菌中也存在若在对数增殖期在低氧条件下进行培养则引起生长不良的菌株，因此能够应用该方法的菌是有限的。
专利文献2中公开了如下的方法，即，用以高浓度包含糖源原料和氮源的培养基培养产生蛋白酶的芽孢杆菌属细菌来高效生产蛋白酶的方法，该方法中，利用分批培养方法进行培养，一次得到的蛋白酶量有限。
通常，在期望一次性得到更高浓度的芽孢、代谢物的情况下，一般应用提高培养基中的营养底物浓度进行培养的方法，增大芽孢杆菌属细菌能够同化的底物进行培养时，菌浓度、代谢物与之成比例地增加，但是会产生如下的问题，即，当超过一定浓度进行培养时，培养体系的氧供给能力赶不上氧要求量的增大从而引起生长不良，或者培养所需要的时间变得长期化等。非专利文献1中还报道了：特别是在用葡萄糖超过20g/L的培养基培养芽孢杆菌属细菌的情况下，芽孢的形成受到抑制。
因此，为了在不抑制芽孢杆菌属细菌的芽孢形成的情况下一次性得到高浓度的芽孢杆菌属细菌的芽孢、代谢物，进行补料培养(半分批培养)。该方法中，通过将在培养过程中消失的营养底物以适当的浓度和适当的时机进行添加，由此与未进行添加的情况相比，能够得到高浓度的菌体、代谢物。
非专利文献1中公开，通过补料培养，与分批培养时相比可大幅提高菌体的生产率，得到高浓度的芽孢杆菌细菌的芽孢。但是，该文献中表明，包含20g/L以上的葡萄糖的培养基将抑制芽孢化，将培养开始时的糖浓度设得较低，并以低浓度推进糖源原料和氮源地进行补料，但由此，添加时间变得长期化，最终需要60小时之多的培养时间。另外，关于此处所用的培养基成分，使用了将化学上纯净的化合物组合而成的培养基即完全合成培养基，为了用于产业利用而大规模地培养芽孢杆菌属细菌并得到芽孢，要花费巨大的成本。因此，期望使用如下的原料进行培养，即，例如由食品等的大规模制造的工序中排出的残渣、或脱脂大豆粉、酵母提取物等在制造无需大量劳力的混合物形成的原料，但至今还不存在关于如下方法的报告例，即，使用高浓度包含上述物质的培养基来高效得到芽孢杆菌属细菌芽孢的方法。
专利文献3中公开了如下方法，即，根据培养中的葡萄糖的消耗，将葡萄糖以最终浓度为1％的方式以一定间隔向培养基进行补料的方法，但在芽孢杆菌属细菌的培养中，对于增殖而言有利的是不仅进行糖类的补料，也同时添加含氮化合物。
专利文献4中公开了如下方法，即，为了产生3-羟基丁酸，利用以高浓度含有糖、且碳原子与氮原子的重量比(C/N比)以12.4～24构成的培养基，对地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)进行补料培养的方法，但为了以高浓度得到芽孢杆菌属细菌的芽孢，利用以必要以上的高浓度包含糖的培养基进行培养是不合适的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-236286号公报
专利文献2：日本特开平11-103855号公报
专利文献3：日本特开平06-254584号公报
专利文献4：特表平09-502097号公报
非专利文献
非专利文献1：Advances in Microbiology，2014，4，444-454
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，为了利用液体培养在短时间得到高浓度的芽孢杆菌属细菌的芽孢、代谢物等有用物质，需要在生成高浓度的芽孢、代谢物方面所必需的培养底物不会过度也不会不足地供给的条件下，培养芽孢杆菌属细菌，从而需要找到满足这些的新的条件。因此，本发明的课题在于提供一种培养方法，该方法对于在一般的细菌用液体培养基中难以高浓度地获得芽孢、代谢物的芽孢杆菌属细菌，能够高效地生产芽孢、代谢物等有用物质。
解决课题的方法
本发明为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，相对于培养初期的糖源原料的浓度高的培养基，通过供给将包含糖或糖源原料的碳源、以及包含铵盐、氨或者脱脂大豆粉、玉米浸渍液等的氮源设定到一定组成比内的培养基地进行补料培养，由此能够在不抑制芽孢杆菌属细菌的生长的情况下使其增殖，并且能够得到以往方法中无法得到的高浓度的芽孢杆菌细菌芽孢、代谢物等有用物质，从而完成了本发明。
本发明如下所示。
[1]一种芽孢杆菌属细菌的培养方法，其特征在于，
在培养开始时的糖或糖源原料的浓度为50.1g/L～100g/L的液体培养基中培养芽孢杆菌属细菌，在培养过程中向所述液体培养基供给包含糖或糖源原料和含氮化合物、且碳原子与氮原子的重量比即C/N比为5.5～13.5的补料培养基并进行培养。
[2]根据[1]所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其特征在于，向所述液体培养基供给碳原子与氮原子的重量比即C/N比为5.5～12的补料培养基并进行培养。
[3]根据[1]或[2]所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，直至培养结束时之前由补料培养基供给的糖或糖源原料的总量相对于补料前的培养基1L为100g以下。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，在芽孢杆菌属细菌的氧消耗速度达到最大的时刻的前后7小时之间进行所述补料培养基的供给。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，在培养开始后3小时～30小时之间进行所述补料培养基的供给。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，所述补料培养基通过将包含糖或糖源原料和含氮化合物的溶液加热灭菌而得到。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，糖或糖源原料为非还原糖。
[8]根据[7]所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，非还原糖为选自蔗糖、海藻糖、蔗果三糖(ケスト一ス)、松三糖(メレチト一ス)、龙胆三糖(ゲンチアノ一ス)、新果二糖(ネオビフルコ一ス)、蔗果四糖(フンギテトラオ一ス)、车前糖(プランテオ一ス)、棉子糖(ラフイノ一ス)、水苏糖(スタキオ一ス)和果二糖(ビフルコ一ス)中的至少一种。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，含氮化合物从由铵盐、氨组成的无机氮化合物组、以及由氨基酸、肽、蛋白质、尿素、脱脂大豆粉、来源于大豆的成分、来源于酵母的成分、玉米浸渍液、玉米浸渍液干燥粉末、来源于玉米的成分、动植物蛋白质或其分解物组成的有机氮化合物组中选择至少一种。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其特征在于，将液体培养基的溶存氧浓度保持为10％以上。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，将液体培养基的温度控制在20～60℃之间，并对芽孢杆菌属细菌的增殖进行控制。
[12]根据[11]所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，在芽孢杆菌属细菌的对数增殖期在28℃～32℃进行培养，之后在35～39℃进行培养。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，芽孢杆菌属细菌选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilliae)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、皮氏芽孢杆菌(Bacillus pichinotyi)、嗜酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、好碱芽孢杆菌(Bacillus alkalicola)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)、环庚烷芽孢杆菌(Bacillus cycloheptanicus)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus aneurinilyticus)、米氏芽孢杆菌(Bacillus migulanus)、深海芽孢杆菌(Bacillus abyssalis)、潮间带芽孢杆菌(Bacillus aestuarii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、或芽孢杆菌属(Bacillus sp.)中。
[14]一种有用物质的制造方法，其特征在于，使用[1]～[13]中任一项所述的培养方法，在所述液体培养基中生成有用物质。
[15]根据[14]所述的有用物质的制造方法，其中，所述有用物质为芽孢杆菌属细菌的芽孢。
[16]根据[14]所述的有用物质的制造方法，其中，所述有用物质为芽孢杆菌属细菌的代谢物。
[17]根据[16]所述的有用物质的制造方法，其中，所述代谢物为环状脂肽。
[18]根据[17]所述的有用物质的制造方法，其中，所述环状脂肽为选自伊枯草菌素(イツリン)、表面活性肽(サ一ファクチン)、制磷脂菌素(プリパスタチン)、丰原素(フエンジシン)、杆菌霉素(バシロマイシン)、地衣素(リチエニシン)、库尔斯塔克素(クルスタキン)、抗霉枯草菌素(マイコサブチリン)、粘杆菌素(コリスチン)、杀镰孢菌素(フザリシジン)、类芽孢杆菌素(パエニバクテリン)、多粘菌素(ポリミキシン)和短小酸素(ピュミラシジン)中的至少一种。
发明效果
根据本发明，能够使芽孢杆菌属细菌以高浓度增殖，能够以高比例生成芽孢、代谢物等有用物质。
具体实施方式
本发明的芽孢杆菌属细菌的培养方法的特征在于，在培养开始时的糖或糖源原料的浓度为50.1g/L～100g/L的液体培养基中培养芽孢杆菌属细菌，在培养过程中向所述液体培养基供给包含糖或糖源原料和含氮化合物、且碳原子与氮原子的重量比(C/N比)为5.5～13.5的补料培养基并进行培养。
通过使用本发明的芽孢杆菌属细菌的培养方法，能够在液体培养基中以高比例生成芽孢、代谢物等有用物质。
本发明中，作为芽孢杆菌属细菌，只要是分类为芽孢杆菌属的细菌，则没有特别限制，例如可举出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilluae)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、皮氏芽孢杆菌(Bacillus pichinotyi)、嗜酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、好碱芽孢杆菌(Bacillus alkalicola)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)、环庚烷芽孢杆菌(Bacillus cycloheptanicus)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus aneurinilyticus)、米氏芽孢杆菌(Bacillus migulanus)、深海芽孢杆菌(Bacillus abyssalis)、潮间带芽孢杆菌(Bacillus aestuarii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、或芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
本发明中，有用物质是指，显示出动植物生长促进作用、灭菌/抑菌作用、基因活化作用等生理活性的物质、各种酶、乳酸、氨基酸等能够在产业上活用的物质、作为纳豆、酸奶等食品等使用的发酵物其本身，具体地可举出芽孢杆菌属细菌的芽孢、芽孢杆菌属细菌的代谢物。芽孢杆菌属细菌的代谢物为通过培养产生的活菌以外的有效成分，可举出具有抗菌性、表面活性作用的环状肽、蛋白酶、脂肪酶之类的酶。
关于作为芽孢杆菌属细菌的代谢物的环状脂肽，可举出选自伊枯草菌素(Iturin)、表面活性肽(Surfactin)、制磷脂菌素(plipastatin)、丰原素(Fengycin)、杆菌霉素(bacillomycin)、地衣素、库尔斯塔克素(kurstakin)、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)、粘杆菌素(Colistin)、杀镰孢菌素(Fusaricidin)、类芽孢杆菌素(Paenibacterin)、多粘菌素(Polymixin)和短小酸素(Pumilacidin)中的至少一种。
芽孢杆菌属细菌的培养中使用的培养基至少包含碳源和氮源。
培养中使用的碳源可以使用芽孢杆菌属细菌能够分解代谢的物质，作为能够分解代谢的碳源，可例示芽孢杆菌属细菌能够分解代谢的糖(葡萄糖、乳糖、甘油、阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨糖醇、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇等)或糖源原料。糖源原料是指，经由包括芽孢杆菌属细菌在内的众多微生物所产生的淀粉酶、纤维素酶等酶游离出上述能够分解代谢的糖的底物，并且是指以淀粉、纤维素、果胶、几丁质等多糖、以及稻草、麦草、稻壳、食品废弃物、施工产生木材、木材厂废材等生物质为例的原料。其中，优选非还原糖，具体地可例示选自蔗糖、海藻糖、蔗果三糖、松三糖、龙胆三糖、新果二糖、蔗果四糖、车前糖、棉子糖、水苏糖和果二糖中的至少一种非还原糖。
培养中使用的氮源可以使用芽孢杆菌属细菌能够分解代谢的物质，作为能够分解代谢的氮源，可例示氨基酸、肽、动植物蛋白质及其分解物、尿素、脱脂大豆粉等来源于大豆的成分、来源于酵母的成分、玉米浸渍液、玉米浸渍液干燥粉末、来源于玉米的成分、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵等铵盐、氨、硝酸钠、硝酸钾、谷氨酸钠、尿素等含氮化合物。
作为其他培养基成分，只要不对芽孢形成、代谢物等有用物质的生产造成不良影响，则可以添加芽孢杆菌属细菌的培养中通常使用的微量金属盐等培养基成分，可以根据需要进一步添加氨基酸或维生素等。
培养开始时的培养基中含有的糖或糖源原料的量为50.1～100g/L。通过在芽孢杆菌属细菌的培养中利用以这样的高浓度包含糖或糖源原料的培养基进行培养，由此可以在培养初期得到增殖更活跃的芽孢杆菌属细菌，另一方面，由于这些糖或糖源原料在增殖时被高效地消耗，因此在培养后期没有残留，能够高效地诱导芽孢形成、代谢物等有用物质的生产。此外，若利用小于50.1g/L的浓度的培养基进行培养，则糖源在早期被消耗殆尽，在未得到充分增殖的时候就开始推进芽孢化。另外，若利用高于100g/L的高浓度的培养基进行培养，则对生长、芽孢形成发挥抑制作用，因此，需要利用包含上述范围内的糖或糖源原料的培养基组成进行培养。
培养开始时的培养基中含氮化合物的量优选为8～72g/L，培养开始时的培养基的C/N比优选为5.5～13.5。
培养过程中供给的补料培养基也可以使用上述包含糖或糖源原料和含氮化合物的培养基，但本发明中，补料培养基中的碳原子与氮原子的重量比(C/N比)被调整为5.5～13.5，优选被调整为5.5～12。通过将C/N比调整到该范围，由此能够在不抑制细菌生长的情况下实现高浓度的芽孢生产、代谢物等有用物质的生产。另一方面，在利用糖或糖源原料的比率多的(C/N比超过13.5的)培养基进行培养的情况下，在培养终期在培养基中残留糖或糖源原料。已知，该残留糖会抑制芽孢杆菌属细菌的活细胞的芽孢化。另外，在利用氮源化合物的比率多的(C/N比小于5.5的)培养基进行培养的情况下，生长所需的碳源不足，从而对增殖不利。
此外，C/N比如下所示地算出。
C/N比＝各培养基成分中含有的碳含量的合计÷各培养基成分中含有的氮含量的合计。
培养基成分中的天然系原料的碳含量可以分别以总糖量的40％重量和总蛋白质量的50％重量估算。总糖量可以在酸中在100℃水解2.5小时后，利用绍莫吉法以还原糖浓度定量。总蛋白质量可以通过先利用凯氏定氮法对总氮量定量后，乘以换算系数6.25来估算。
直至培养结束时之前被补料的培养基的量没有特别限制，但优选由补料培养基供给的糖或糖源原料的总量相对于补料前的培养基1L为100g以下。
补料培养基优选通过将含有包含非还原糖或非还原糖的糖源原料以及含氮化合物的溶液加热灭菌而得到。
对于培养基成分，通常在培养开始前实施高压反应釜等加热灭菌处理，但在具有还原性的糖和氮源共存的条件下进行高压反应釜时，它们成为底物而发生美拉德反应，生长所需的营养成分被转变为其他化合物，而丧失本来的作为营养源的功能。由此，芽孢杆菌属细菌难以有效地增殖，无法得到充分的菌体、代谢物等有用物质。因此，一般为将糖源和氮源分别进行加热灭菌、并在充分冷却后将两者混合供于培养的方法。该混合工序中要打开保持了灭菌状态的体系，因此污染风险提高，另外，也增加了必要的设备、作业工序。
与此相对，本发明的方法中，通过使用蔗糖等非还原糖，即使将碳源和氮源同时加热灭菌也不引起美拉德反应等，因此培养基易于制备。
补料培养基的供给可以仅进行1次，也可以进行多次，例如以2～6次不连续地进行供给，但优选配合着营养源的消耗速度而连续地进行补料培养基的供给。
补料培养基的供给期望在芽孢杆菌属细菌的增殖活跃、且氧、营养源的消耗更活跃的时刻进行。若在培养初期开始添加，则营养浓度变高，增殖变得活跃，氧被剧烈消耗从而氧供给变得不充分，或者因浸透压效应而导致生长不良。另外，在希望在增殖活跃的时期过后进行补料从而得到充分的芽孢、代谢物等有用物质的情况下，需要更长的培养时间。一般而言，芽孢在营养不足的状态时形成，因此，若将补料持续至培养后期，则在培养基中残留大量培养底物，从而不形成芽孢。因此，例如优选在微生物的氧消耗速度达到最大的时刻(例如培养开始经过8小时的时刻)的前后7小时之间进行补料培养基的施与，优选在培养开始后3小时～30小时之间进行补料培养基的施与。更优选在培养开始后5～20小时开始补料培养基的施与，在培养开始后13～25小时之间结束补料培养基的施与。此外，总的培养时间例如为24～48小时。
需要说明的是，培养液中的溶存氧浓度可以利用隔膜加尔瓦尼电极式感应器等进行实时监测。
作为培养条件，为通常的芽孢杆菌属细菌的液体培养中使用的条件即可，但例如控制为20～60℃、优选控制为20～40℃，优选控制芽孢杆菌属细菌的增殖。例如在对数增殖期在28～32℃、优选30℃±1℃进行培养从而控制芽孢杆菌属细菌的增殖和糖或糖源原料的消耗，之后在35～39℃、优选37℃±1℃进行培养，由此能够更有效地实现芽孢形成。
此外，优选在好氧条件(例如氧浓度10％以上、优选15～50％)下边搅拌边进行培养，培养基的pH优选为6.5～8.5，更优选7.0～8.0。
此外，可以在利用上述糖或糖源原料的浓度为50.1g/L～100g/L的液体培养基进行培养之前，进行前培养。
由此地可以得到高芽孢化率(例如50％以上、优选80％以上)的芽孢杆菌属细菌的菌体、芽孢杆菌属细菌的代谢物。这样的高芽孢化率的芽孢杆菌属细菌的菌体、芽孢杆菌属细菌的代谢物可以在适宜进行培养基的浓缩或除去、干燥等操作后用于期望的目的。
以下举出实施例来具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
实施例、参考例、比较例中使用的培养基的组成如表1所示。培养基成分中的葡萄糖、蔗糖、CSL的碳含量分别以总糖量的40％重量和总蛋白质量的50％重量算出。关于总糖量，在酸中在100℃水解2.5小时后，利用绍莫吉法以还原糖浓度定量。关于总蛋白质量，先利用凯氏定氮法对总氮量定量后，乘以换算系数6.25来算出。
【表1】
表1
培养基条件 1 2 3 4 5
g/L
葡萄糖 12.5 50 0 0 250
蔗糖 0 0 50 250 0
CSL[粉末] 15 60 60 90 90
MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.09 0.36 0.36 1.8 1.8
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.25 1 1 5 5
C重量(g/L) 8.70 34.8 34.8 72.19 72.19
N重量(g/L) 1.05 4.20 4.20 6.31 6.31
C/N 8.28 8.28 8.28 11.45 11.45
总糖量(g/L) 13.4 56 56 280 280
参考例1.糖源原料的比较(葡萄糖和蔗糖)
在500mL容量三角烧瓶中以达到制成的表1的培养基条件1中记载的终浓度的方式分别制成含有葡萄糖(和光纯药)、CSL(ROQUETTE)、MnCl2(和光纯药)、KH2PO4(和光纯药)的培养基各100ml，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合)。从在普通琼脂平板培养基上生长的枯草芽孢杆菌MBI-600的菌落取1铂耳，无菌地接种到表1的培养基条件1中记载的培养基，在30℃以150rpm震荡培养1晚，得到前培养液。
使用5L容量培养槽，以达到表1的培养基条件2(试验编号2)和3(试验编号3)中记载的终浓度的方式，制成2瓶2L培养基，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合，蔗糖(和光纯药)与全部培养基成分预先混合后进行灭菌)。
从上述中得到的枯草芽孢杆菌MBI-600的前培养液中各自取100ml无菌地接种到5L容量培养槽中，在30℃、500rpm的条件下开始培养，以不使溶存氧浓度低于10％的方式调整氧供给量。溶存氧浓度是指，将每单位体积的培养液中溶存的氧的量以百分率表示的数值，为了计测其值，例如可以利用台式培养装置(MDL-8C)(公司丸菱生物工程公司制)等设备测定。
培养34小时后，对于所得到的培养液用灭菌水稀释后，涂布于普通肉汤琼脂培养基(荣研化学公司)，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定菌体数。另外，将预先制备的稀释液在80℃加热30分钟后，同样地涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定耐热菌数，由这些结果算出芽孢形成率。其结果示出于表2。
【表2】
表2
培养基条件 2 3
菌体数(cfu/ml) 1.50E+10 1.36E+10
耐热菌数(cfu/ml) 1.39E+10 1.29E+10
芽孢形成率 92.22％ 95.04％
本培养试验中在以下情况时在耐热菌数方面没有观察得到显著差异，即，在利用使用葡萄糖作为碳源、并与氮源分别灭菌的培养基培养枯草芽孢杆菌MBI-600时、与在利用使用蔗糖作为碳源、并与氮源同时灭菌的培养基培养枯草芽孢杆菌MBI-600时。
实施例1.基于补料培养方法的培养中的菌数的比较
在500mL容量三角烧瓶中分别制成各100ml的以达到制成的表1的培养基条件1中记载的终浓度的方式调整的培养基，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合)。从在普通琼脂平板培养基上生长的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MBI-600的菌落取1铂耳，无菌地接种到所得培养基中，在30℃以150rpm震荡培养1晚，得到前培养液。
使用5L容量培养槽，以达到表1的培养基条件3中记载的终浓度的方式制成2瓶2L培养基，进行高压反应釜灭菌(全部培养基成分预先混合后进行高压反应釜灭菌)。
使用500mL容量杜兰瓶，以达到表1的培养基条件4中记载的终浓度的方式制成1瓶0.4L的培养基。以能够将其补料到加入了培养基条件3的培养基的5L容量培养槽的方式预先用管连接，进行高压反应釜灭菌(全部培养基成分预先混合后进行高压反应釜灭菌)。
从所得到的前培养液中各取100ml无菌地接种到包含上述2L培养基的5L容量培养槽，在37℃的条件下开始培养。从培养开始经过5小时后，将培养基条件4的培养基以每2小时100mL、分成4次地添加到5L容量培养槽中的一方。从开始添加后，将培养温度降低到30℃，进行培养。此时，以使培养液中的溶存氧浓度不低于10％的方式控制转速、调整氧供给量。氧消耗速度在开始培养约8小时后达到最大。从培养开始经过24小时后，将培养温度升高到37℃进行培养。
培养34小时后，对于所得到的培养液用灭菌水稀释后，涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定菌体数。另外，将预先制备的稀释液在80℃加热30分钟后，同样地涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定耐热菌数，由这些结果算出芽孢形成率。其结果示出于表3。
【表3】
表3
培养基条件 3 3+4
菌体数(cfu/ml) 1.36E+10 1.87E+10
耐热菌数(cfu/ml) 1.29E+10 1.83E+10
芽孢形成率 95.04％ 97.90％
本培养试验中，利用使用蔗糖作为碳源、将全部培养基成分同时灭菌的培养基进行了补料培养的枯草芽孢杆菌的菌浓度，与未进行补料培养的情况相比，观察到大约1.5倍的菌浓度的增加，耐热芽孢也增加了。
实施例2.使用了将还原糖或非还原糖同时灭菌的培养基的培养试验
在500mL容量三角烧瓶中制成各100ml的以达到表1的培养基条件1中记载的终浓度的方式调整的培养基，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合)。从在普通琼脂平板培养基上生长的枯草芽孢杆菌MBI-600的菌落取1铂耳，无菌地接种到所得培养基中，在30℃以150rpm震荡培养1晚，得到前培养液。
在5L容量培养槽中，各制成2L以达到表1的培养基条件2和3中记载的终浓度的方式分别调整的培养基(葡萄糖和蔗糖与全部培养基成分预先混合后进行灭菌)。
使用500mL容量杜兰瓶，各制成0.4L以达到表1的培养基条件4和5中记载的终浓度的方式分别调整的培养基。培养基条件4的培养基以能够向加入了培养基条件2的成分的5L容量培养槽补料的方式预先用管连接，培养基条件5的培养基以能够向加入了培养基条件3的成分的5L容量培养槽补料的方式预先用管连接，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖和蔗糖与全部培养基成分预先混合后进行灭菌)。
从所得到的前培养液中各取100ml无菌地接种到包含上述2L培养基的5L容量培养槽，在37℃的条件下开始培养。从培养开始经过5小时后，将培养基条件4的培养基以每2小时100mL、分成4次地添加到培养基条件3的培养基中，将培养基条件5的培养基以每2小时100mL、分成4次地添加到培养基条件2的培养基中。从开始添加后，将培养温度降低到30℃，进行培养。此时，以使培养液中的溶存氧浓度不低于10％的方式控制转速、调整氧供给量。开始补料时，以培养基条件2培养的培养液的葡萄糖浓度低于40g/L，另外，氧消耗速度在开始培养约8小时后达到最大。从培养开始经过24小时后，将培养温度升高到37℃进行培养。
培养34小时后，对于所得到的培养液用灭菌水稀释后，涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定菌体数。另外，将预先制备的稀释液在80℃加热30分钟后，同样地涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定耐热菌数，由这些结果算出芽孢形成率。其结果示出于表4。
【表4】
表4
培养基条件 3+4 2+5
菌体数(cfu/ml) 1.87E+10 1.85E+10
耐热菌数(cfu/ml) 1.83E+10 1.48E+10
芽孢形成率 97.90％ 80.30％
本培养试验中，利用使用葡萄糖作为碳源、将全部培养基成分同时灭菌的培养基进行了补料培养的枯草芽孢杆菌的菌浓度，与使用蔗糖作为碳源进行了补料培养的体系相比，所得到的耐热芽孢菌数更少。
实施例3.苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的补料培养试验
在500mL容量三角烧瓶中制成各100ml的以达到表1的培养基条件1中记载的终浓度的方式调整的培养基，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合)。从在普通琼脂平板培养基上生长的苏云金芽孢杆菌NBRC 101235的菌落取1铂耳，无菌地接种到所得培养基中，在30℃以150rpm震荡培养1晚，得到前培养液。
在5L容量培养槽中，各制成2L合计3瓶的以达到表1的培养基条件2中记载的终浓度的方式调整的培养基(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合)。
使用500mL容量杜兰瓶，各制成0.4L以达到表1的培养基条件4和5中记载的终浓度的方式分别调整的培养基。培养基条件4和5的培养基以能够分别向加入了培养基条件2的成分的5L容量培养槽补料的方式预先用管连接，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合，蔗糖与全部培养基成分预先混合后进行灭菌)。另外，将不进行补料培养的培养基条件2的培养基作为对照。
从所得到的前培养液中各取100ml无菌地接种到包含上述2L培养基的5L容量培养槽，在37℃的条件下开始培养。从培养开始经过6小时后，将培养基条件4或培养基条件5的培养基以每2小时100mL、分成4次地分别各自添加到5L容量培养槽中的2瓶中。从开始添加后，将培养温度降低到30℃，进行培养。此时以使培养液中的溶存氧浓度不低于10％的方式控制转速、调整氧供给量，同时向各个发酵槽中添加10％盐酸水溶液和2M氢氧化钠溶液，以使培养中的培养液的pH为6.7～7.3的方式进行调节。开始补料时，以培养基条件2培养的培养液的葡萄糖浓度低于40g/L，另外，氧消耗速度在培养开始约8小时后达到最大。从培养开始经过24小时后，将培养温度升高到37℃进行培养。
培养34小时后，对于所得到的培养液用灭菌水稀释后，涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定菌体数。另外，将预先制备的稀释液在80℃加热30分钟后，同样地涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定耐热菌数，由这些结果算出芽孢形成率。其结果示出于表5。
【表5】
表5
培养基条件 2 2+5 2+4
菌体数(cfu/ml) 1.25E+09 1.33E+09 1.74E+09
耐热菌数(cfu/ml) 1.19E+09 1.22E+09 1.61E+09
芽孢形成率 95.1％ 91.6％ 92.6％
本培养试验中，通过对苏云金芽孢杆菌进行补料培养，由此与未进行补料的条件相比，可得到更多的耐热芽孢。另外，与作为还原糖的葡萄糖相比，用包含作为非还原糖的蔗糖的培养基进行补料时，可得到更多的耐热芽孢。
比较例1.仅补料碳源的补料培养
在500mL容量三角烧瓶中分别制成各100ml的以达到制成的表1的培养基条件1中记载的终浓度的方式调整的培养基，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合)。从在普通琼脂平板培养基上生长的枯草芽孢杆菌MBI-600的菌落取1铂耳，无菌地接种到所得培养基中，在30℃以150rpm震荡培养1晚，得到前培养液。
使用5L容量培养槽，以达到表1的培养基条件2中记载的终浓度的方式制成2L培养基，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合)。
使用500mL容量杜兰瓶，以使葡萄糖达到125g/L终浓度的方式制成1瓶0.4L的培养基。以能够将其补料到加入了培养基条件2的培养基的5L容量培养槽的方式预先用管连接，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合)。
将所得到的前培养液100ml无菌地接种到上述培养基，在37℃的条件下开始培养。从培养开始经过5小时后，以每2小时100mL、分成4次地添加葡萄糖溶液。从开始添加后，将培养温度降低到30℃，进行培养。此时，以使培养液中的溶存氧浓度不低于10％的方式控制转速、调整氧供给量。开始补料时，以培养基条件2培养的培养液的葡萄糖浓度低于40g/L，另外，氧消耗速度在培养开始约8小时后达到最大。从培养开始经过24小时后，将培养温度升高到37℃进行培养。
培养34小时后，对于所得到的培养液用灭菌水稀释后，涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定菌体数。另外，将预先制备的稀释液在80℃加热30分钟后，同样地涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定耐热菌数，由这些结果算出芽孢形成率。其结果表示于6。
【表6】
表6
培养基条件 2+Glu
菌体数(cfu/ml) 1.39E+10
耐热菌数(cfu/ml) 1.13E+10
芽孢形成率 81.29％
在本培养试验中可知，仅补料了作为碳源的葡萄糖的枯草芽孢杆菌的菌浓度，与使用同时包含碳源和氮源的培养基进行了补料培养时(表4的2+5)相比，所得到的芽孢浓度更低。
实施例4.基于补料培养方法的培养中的伊枯草菌素量的比较
在500mL容量三角烧瓶中分别制成各100ml的以达到制成的表1的培养基条件1中记载的终浓度的方式调整的培养基，进行高压反应釜灭菌(葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合)。从在普通琼脂平板培养基上生长的枯草芽孢杆菌MBI-600的菌落取1铂耳，无菌地接种到所的培养基中，在30℃以150rpm震荡培养1晚，得到前培养液。
使用5L容量培养槽，以达到表1的培养基条件2中记载的终浓度的方式制成2瓶2L培养基，进行高压反应釜灭菌(全部培养基成分预先混合后进行高压反应釜灭菌)。
使用500mL容量杜兰瓶，以达到表1的培养基条件4中记载的终浓度的方式制成1瓶0.4L的培养基。以能够将其补料到加入了培养基条件2的培养基的5L容量培养槽的方式预先用管连接，进行高压反应釜灭菌(全部培养基成分预先混合后进行高压反应釜灭菌)。
从所得到的前培养液中各取100ml无菌地接种到包含上述培养基条件2的培养基2L的5L容量培养槽，在30℃的条件下开始培养。从培养开始经过5小时后，将培养基条件4的培养基以每2小时100mL、分成4次地添加到5L容量培养槽中的一方，继续培养。此时，以使培养液中的溶存氧浓度不低于10％的方式控制转速、调整氧供给量。氧消耗速度在培养开始约12小时后达到最大。
54小时培养后，对于所得到的培养液用灭菌水稀释后，涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定菌体数。另外，将预先制备的稀释液在80℃加热30分钟后，同样地涂布于普通肉汤琼脂培养基，在37℃静置培养1晚，计测所形成的菌落数，测定耐热菌数，由这些结果算出芽孢形成率。其结果示出于表7。
另外，对于所得到的培养液，使用冷却离心机(公司TOMYSEIKO MX-307)，进行10,000rpm、20℃、30分钟的离心分离，回收上清。
向固相提取柱(日本Waters公司Oasis HLB 3cc(400mg)LP ExtractionCartridge)加入含有0.1％TFA的乙腈6mL，使其过柱后加入含有0.1％TFA的蒸馏水6mL，并使其过柱。加入回收的培养液离心上清2mL，使其过柱，依次过柱含有0.1％TFA的蒸馏水6mL、含有0.1％TFA的乙腈/蒸馏水(20∶80，v/v)6mL，从而进行清洗。接着，过柱含有0.1％TFA的乙腈/蒸馏水(90∶10，v/v)5mL，回收洗脱液。以使回收液达到5mL的方式加入含有0.1％TFA的乙腈/蒸馏水(90∶10，v/v)，利用以下的条件进行HPLC分析。
HPLC：Agilent Technologies公司1260Infinity
柱：日本Waters公司XBridge C18 5μm 4.6x250mm
移动相：A：含有0.1％TFA的蒸馏水；B：含有0.1％TFA的乙腈
0～3分钟A 80％/B 20％
3～12分钟A 80％/B 20％→B 100％
12～23分钟B 100％
23～27分钟B 100％→A 80％/B 20％
27～30分钟A 80％/B 20％
流量：1mL/分钟
温度：40℃
检测：UV205nm
注入量：10μL
标样：来自枯草芽孢杆菌的伊枯草菌素A(Merck)
浓度：30ppm、120ppm
溶剂：含有0.1％TFA的乙腈/蒸馏水(90∶10，v/v)
对于在洗脱时间12.1分钟和12.7分钟检测到的峰面积，根据与标样的比较算出培养液中的伊枯草菌素浓度。
结果示出于表7。
【表7】
表7试验结果
培养基条件 2 2+4
菌体数(cfu/ml) 1.23E+10 1.18E+10
耐热菌数(cfu/ml) 0.87E+10 1.21E+10
芽孢形成率 78.5％ 101.8％
伊枯草菌素浓度(ppm) 149.5 319.8
在本培养试验中确认，进行了补料培养的枯草芽孢杆菌的菌浓度与未进行补料培养的情况相比，菌浓度大致增加到1.8倍，伊枯草菌素浓度大致增加到2.1倍，耐热芽孢也增加了。

Claims (18)

1.一种芽孢杆菌属细菌的培养方法，其特征在于，
在培养开始时的糖或糖源原料的浓度为50.1g/L～100g/L的液体培养基中培养芽孢杆菌属细菌，在培养过程中向所述液体培养基供给包含糖或糖源原料和含氮化合物、且碳原子与氮原子的重量比即C/N比为5.5～13.5的补料培养基并进行培养。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其特征在于，
向所述液体培养基供给碳原子与氮原子的重量比即C/N比为5.5～12的补料培养基并进行培养。
3.根据权利要求1或2所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
直至培养结束时之前由补料培养基供给的糖或糖源原料的总量相对于补料前的培养基1L为100g以下。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
在芽孢杆菌属细菌的氧消耗速度达到最大的时刻的前后7小时之间进行所述补料培养基的供给。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
在培养开始后3小时～30小时之间进行所述补料培养基的供给。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
所述补料培养基通过将包含糖或糖源原料和含氮化合物的溶液加热灭菌而得到。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
糖或糖源原料为非还原糖。
8.根据权利要求7所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
非还原糖为选自蔗糖、海藻糖、蔗果三糖、松三糖、龙胆三糖、新果二糖、蔗果四糖、车前糖、棉子糖、水苏糖和果二糖中的至少一种。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
含氮化合物从由铵盐、氨组成的无机氮化合物组、以及
由氨基酸、肽、蛋白质、尿素、脱脂大豆粉、来源于大豆的成分、来源于酵母的成分、玉米浸渍液、玉米浸渍液干燥粉末、来源于玉米的成分、动植物蛋白质或其分解物组成的有机氮化合物组中选择至少一种。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其特征在于，
将液体培养基的溶存氧浓度保持为10％以上。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
将液体培养基的温度控制在20～60℃之间，并对芽孢杆菌属细菌的增殖进行控制。
12.根据权利要求11所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
在芽孢杆菌属细菌的对数增殖期在28℃～32℃进行培养，之后在35～39℃进行培养。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的芽孢杆菌属细菌的培养方法，其中，
芽孢杆菌属细菌选自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens、短小芽孢杆菌Bacillus pumilus、单纯芽孢杆菌Bacillus simplex、迟缓芽孢杆菌Bacillus lentus、侧孢芽孢杆菌Bacillus laterosporus、蜂房芽孢杆菌Bacillus alvei、日本甲虫芽孢杆菌Bacillus popilliae、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、短芽孢杆菌Bacillus brevis、嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus、嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus、凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans、环状芽孢杆菌Bacillus circulans、暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis、灿烂芽孢杆菌Bacillus lautus、克劳氏芽孢杆菌Bacillus clausii、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、坚强芽孢杆菌Bacillus firmus、贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis、皮氏芽孢杆菌Bacillus pichinotyi、嗜酸热芽孢杆菌Bacillus acidocaldarius、好碱芽孢杆菌Bacillus alkalicola、产氮芽孢杆菌Bacillus azotoformans、炭疽芽孢杆菌Bacillus anthracis、栗褐芽孢杆菌Bacillus badius、巴达维亚芽孢杆菌Bacillus bataviensis、环庚烷芽孢杆菌Bacillus cycloheptanicus、解硫胺素芽孢杆菌Bacillus aneurinilyticus、米氏芽孢杆菌Bacillus migulanus、深海芽孢杆菌Bacillus abyssalis、潮间带芽孢杆菌Bacillus aestuarii、多粘芽孢杆菌Bacillus polymyxa、或芽孢杆菌属Bacillus sp.中。
14.一种有用物质的制造方法，其特征在于，
使用权利要求1～13中任一项所述的培养方法，在所述液体培养基中生成有用物质。
15.根据权利要求14所述的有用物质的制造方法，其中，
所述有用物质为芽孢杆菌属细菌的芽孢。
16.根据权利要求14所述的有用物质的制造方法，其中，
所述有用物质为芽孢杆菌属细菌的代谢物。
17.根据权利要求16所述的有用物质的制造方法，其中，
所述代谢物为环状脂肽。
18.根据权利要求17所述的有用物质的制造方法，其中，
所述环状脂肽为选自伊枯草菌素、表面活性肽、制磷脂菌素、丰原素、杆菌霉素、地衣素、库尔斯塔克素、抗霉枯草菌素、粘杆菌素、杀镰孢菌素、类芽孢杆菌素、多粘菌素和短小酸素中的至少一种。
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