CN109880754A - 一种芽孢杆菌液发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芽孢杆菌液发酵培养方法，包括菌种斜面培养、种子液制备及发酵培养，其中种子液培养基，按质量分数计：红糖1‑3％，葡萄糖0.5‑2％，乙酸钠0.05‑0.3％，尿素0.05‑0.3％，磷酸氢二钾0.1‑0.4％，硫酸锰0.001‑0.005％，硫酸镁0.01‑0.05％，余量为水，pH7.0‑7.2。本发明采用凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌混合菌发酵培养，通过液态发酵的方法，菌株间的互利共栖协同作用，所制成的菌液活菌含量高，稳定性良好，保质期长，尤其适用于饲料生产、养殖中。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种芽孢杆菌液发酵培养方法。
背景技术
凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，在100℃高温下10min存活率达到96.4％。能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L-乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。凝结芽孢杆菌能够形成芽孢，与其他不产乳酸的芽孢杆菌相比有利于恢复胃肠道的微生态平衡。凝结芽孢杆菌芽孢在人体中约4-6h 便可萌发，其中85％的菌体可顺利通过消化系统，最终于肠道中萌发并繁殖。
枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。其能迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其它致病菌生长。芽孢状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60℃高温，在120℃温度下能存活20分钟；耐酸碱，在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，是微生物中可100％直达大小肠的活菌。
目前市面上的产品多为单一菌，即单一凝结芽孢杆菌或者单一枯草芽孢杆菌产品。生产技术复杂，要求高，导致产品价格较高，同时饲料加工制粒过程温度较高常见乳酸菌无法耐受而凝结芽孢杆菌则是特殊的乳酸菌能克服这一缺陷。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种操作简单、能高密度富集凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的混合发酵液培养方法，所制成的菌液活菌含量高，稳定性良好，保质期长，尤其适用于饲料生产、养殖中。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种芽孢杆菌液发酵培养方法，包括如下步骤：
(1)菌种斜面培养：将凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，于25-30℃培养10-24h，得活化的混合菌种；
(2)种子液制备：将活化的混合菌种接种于种子液培养基中培养，得到种子液；
所述种子液培养基，按质量分数计：红糖1-3％，葡萄糖0.5-2％，乙酸钠0.05-0.3％，尿素0.05-0.3％，磷酸氢二钾0.1-0.4％，硫酸锰 0.001-0.005％，硫酸镁0.01-0.05％，余量为水，pH7.0-7.2；
(3)发酵培养：将种子液按3-8％的接种量接种于发酵培养基中，于35-38℃恒温培养，即可；
所述发酵培养基，按质量分数计：红糖1-3％，葡萄糖0.5-2％，乙酸钠0.05-0.3％，尿素0.05-0.3％，磷酸氢二钾0.1-0.4％，硫酸锰 0.001-0.005％，硫酸镁0.01-0.05％，余量为水，pH7.0-7.2。
较佳地，在步骤(1)，所述凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的质量比为1-5：3-1。
较佳地，在步骤(2)的种子液制备中，包括将活化的混合菌种进行一级摇床培养16-18h，然后接种二级，二级培养16-20h后再接种发酵罐进行发酵培养。
较佳地，所述种子液培养基，按质量分数计：红糖2％，葡萄糖 1％，乙酸钠0.1％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0-7.2。
较佳地，所述发酵培养基，按质量分数计：红糖2％，葡萄糖1％，乙酸钠0.1％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0-7.2。
较佳地，所述种子液培养基分装于500mL三角瓶中，每瓶装 250mL，0.1Mpa×121℃高压蒸汽灭菌20min。
较佳地，所述斜面培养基，按质量分数计：牛肉膏1-3％，葡萄糖0.5-4％，乙酸钠0.05-0.2％，蛋白胨0.05-0.2％，琼脂0.1-0.4％，磷酸氢二钾0.1-0.4％，余量为水。
较佳地，所述斜面培养基，按质量分数计：牛肉膏2％，葡萄糖 1％，乙酸钠0.1％，蛋白胨0.1％，琼脂0.2％，磷酸氢二钾0.2％，余量为水。
较佳地，所述发酵培养分两阶段进行，前期进行厌氧培养，后期进行好氧培养；所述厌氧培养的条件为：培养温度30-35℃，pH值控制为7.0-7.2，培养时间8-14h，搅拌转速120-200r/min。
较佳地，所述好氧培养的条件为：培养温度30-35℃，通气量 250L/min，pH值控制为7.0-7.2，培养时间24-36h，搅拌转速 120-200r/min。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌混合菌发酵培养，可以产生L-乳酸，能抑制有害菌，并赋予产品特有的酸香味、色泽和口感等感官特征的改善和多样化，发酵产品提高动物适口性，还具有α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，尤其适用于饲料生产、养殖中；通过液态发酵的方法，菌株间的互利共栖协同作用，对底物利用率高，省工节能，能提高产率和菌体浓度；
(2)本发明采用的斜面培养基、种子液培养基及发酵培养基成分简单，方便制备，其克服了成本高、不宜大规模生产、生产操作过于复杂的缺点，培养的活菌含量高，达到108cfu/mL，稳定性较好，保存时间不低于8个月。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
本发明活菌数的测定方法如下：
采用平板计数法，操作步骤为：称取培养好的凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌混合菌剂产品10g，置于90mL的无菌生理盐水中，放置到摇床上震荡30min，摇匀后用移液枪取1mL的菌液加进另一个9mL 的无菌生理盐水中，进行稀释，按照国标方法，依次做十倍梯度稀释。稀释完后，用移液枪分别取合适的稀释度1mL打进平板，倒入培养基混匀，依次做三个平行，置于培养箱中在37℃静置培养48h。
实施例1
一种芽孢杆菌液发酵培养方法，包括如下步骤：
(1)菌种斜面培养：将凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，于25℃培养20h，得活化的混合菌种；凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的质量比为2：1；斜面培养基，按质量分数计：牛肉膏 2％，葡萄糖1％，乙酸钠0.1％，蛋白胨0.1％，琼脂0.2％，磷酸氢二钾0.2％，余量为水；
(2)种子液制备：将活化的混合菌种接种于种子液培养基中培养，得到种子液；种子液培养基，按质量分数计：红糖2％，葡萄糖1％，乙酸钠0.1％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0-7.2；种子液培养基配制好后加热溶解，后降至40℃以下分装于500mL三角瓶中，每瓶装250mL，0.1Mpa× 121℃高压蒸汽灭菌20min；
(3)发酵培养：将种子液按5％的接种量接种于发酵培养基中，于35℃恒温培养，即可；所述发酵培养基，按质量分数计：红糖2％，葡萄糖1％，乙酸钠0.1％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰 0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0-7.2；发酵培养基配制好后加热溶解，后降至40℃以下再使用；发酵培养分两阶段进行，前期进行厌氧培养，后期进行好氧培养；所述厌氧培养的条件为：培养温度30℃，pH值控制为7.0，培养时间8h，搅拌转速120r/min；所述好氧培养的条件为：培养温度30℃，通气量250L/min，pH值控制为 7.0，培养时间24h，搅拌转速120r/min。
本实施例生产的混合菌剂产品：有效活菌数≥3×108cfu/mL，其中：凝结芽孢杆菌≥2.0×108cfu/mL，枯草芽孢杆菌≥1.0×108cfu/mL。
实施例2
一种芽孢杆菌液发酵培养方法，包括如下步骤：
(1)菌种斜面培养：将凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，于30℃培养10h，得活化的混合菌种；凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的质量比为1：3；斜面培养基，按质量分数计：牛肉膏 1％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.05％，蛋白胨0.05％，琼脂0.1％，磷酸氢二钾0.1％，余量为水；
(2)种子液制备：将活化的混合菌种接种于种子液培养基中培养，得到种子液；种子液培养基，按质量分数计：红糖1％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.05％，尿素0.05％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸锰0.005％，硫酸镁0.05％，余量为水，pH7.0；种子液培养基配制好后加热溶解，后降至40℃以下分装于500mL三角瓶中，每瓶装250mL，0.1Mpa× 121℃高压蒸汽灭菌20min；
(3)发酵培养：将种子液按3％的接种量接种于发酵培养基中，于38℃恒温培养，即可；所述发酵培养基，按质量分数计：红糖1％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.05％，尿素0.05％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸锰0.005％，硫酸镁0.05％，余量为水，pH7.0；发酵培养基配制好后加热溶解，后降至40℃以下再使用；发酵培养分两阶段进行，前期进行厌氧培养，后期进行好氧培养；所述厌氧培养的条件为：培养温度35℃，pH值控制为7.2，培养时间14h，搅拌转速200r/min；所述好氧培养的条件为：培养温度35℃，通气量250L/min，pH值控制为 7.2，培养时间36h，搅拌转速200r/min。
本实施例生产的混合菌剂产品：有效活菌数≥2.8×108cfu/mL，其中：凝结芽孢杆菌≥0.7×108cfu/mL，枯草芽孢杆菌≥2.1×108cfu/mL。
实施例3
一种芽孢杆菌液发酵培养方法，包括如下步骤：
(1)菌种斜面培养：将凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，于30℃培养24h，得活化的混合菌种；凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的质量比为5：3；斜面培养基，按质量分数计：牛肉膏 3％，葡萄糖4％，乙酸钠0.2％，蛋白胨0.2％，琼脂0.4％，磷酸氢二钾0.4％，余量为水；
(2)种子液制备：将活化的混合菌种接种于种子液培养基中培养，得到种子液；种子液培养基，按质量分数计：红糖3％，葡萄糖2％，乙酸钠0.3％，尿素0.3％，磷酸氢二钾0.4％，硫酸锰0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0；种子液培养基配制好后加热溶解，后降至40℃以下分装于500mL三角瓶中，每瓶装250mL，0.1Mpa× 121℃高压蒸汽灭菌20min；
(3)发酵培养：将种子液按3％的接种量接种于发酵培养基中，于38℃恒温培养，即可；所述发酵培养基，按质量分数计：红糖3％，葡萄糖2％，乙酸钠0.3％，尿素0.3％，磷酸氢二钾0.4％，硫酸锰 0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0；发酵培养基配制好后加热溶解，后降至40℃以下再使用；发酵培养分两阶段进行，前期进行厌氧培养，后期进行好氧培养；所述厌氧培养的条件为：培养温度 35℃，pH值控制为7.2，培养时间8h，搅拌转速120r/min；所述好氧培养的条件为：培养温度30℃，通气量250L/min，pH值控制为7.0，培养时间24h，搅拌转速120r/min。
本实施例生产的混合菌剂产品：有效活菌数≥2.4×108cfu/mL，其中：凝结芽孢杆菌≥1.48×108cfu/mL，枯草芽孢杆菌≥ 0.912×108cfu/mL。
实施例4
一种芽孢杆菌液发酵培养方法，包括如下步骤：
(1)菌种斜面培养：将凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，于25℃培养20h，得活化的混合菌种；凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的质量比为2：1；斜面培养基，按质量分数计：牛肉膏 3％，葡萄糖4％，乙酸钠0.2％，蛋白胨0.2％，琼脂0.4％，磷酸氢二钾0.4％，余量为水；
(2)种子液制备：将活化的混合菌种接种于种子液培养基中培养，包括先将活化的混合菌种进行一级摇床培养16h，然后接种二级，二级培养16h后得到种子液；种子液培养基，按质量分数计：红糖2％，葡萄糖1％，乙酸钠0.1％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰 0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0-7.2；种子液培养基配制好后加热溶解，后降至40℃以下分装于500mL三角瓶中，每瓶装250mL， 0.1Mpa×121℃高压蒸汽灭菌20min；
(3)发酵培养：将种子液按5％的接种量接种于发酵培养基中，于35℃恒温培养，即可；所述发酵培养基，按质量分数计：红糖2％，葡萄糖1％，乙酸钠0.1％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰 0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0-7.2；发酵培养基配制好后加热溶解，后降至40℃以下再使用；发酵培养分两阶段进行，前期进行厌氧培养，后期进行好氧培养；所述厌氧培养的条件为：培养温度30℃，pH值控制为7.0，培养时间8h，搅拌转速120r/min；所述好氧培养的条件为：培养温度30℃，通气量250L/min，pH值控制为 7.0，培养时间24h，搅拌转速120r/min。
本实施例生产的混合菌剂产品：有效活菌数≥3.2×108cfu/mL，其中：凝结芽孢杆菌≥2.13×108cfu/mL，枯草芽孢杆菌≥ 1.02×108cfu/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)菌种斜面培养：将凝结芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，于25-30℃培养10-24h，得活化的混合菌种；
(2)种子液制备：将活化的混合菌种接种于种子液培养基中培养，得到种子液；
所述种子液培养基，按质量分数计：红糖1-3％，葡萄糖0.5-2％，乙酸钠0.05-0.3％，尿素0.05-0.3％，磷酸氢二钾0.1-0.4％，硫酸锰0.001-0.005％，硫酸镁0.01-0.05％，余量为水，pH7.0-7.2；
(3)发酵培养：将种子液按3-8％的接种量接种于发酵培养基中，于35-38℃恒温培养，即可；
所述发酵培养基，按质量分数计：红糖1-3％，葡萄糖0.5-2％，乙酸钠0.05-0.3％，尿素0.05-0.3％，磷酸氢二钾0.1-0.4％，硫酸锰0.001-0.005％，硫酸镁0.01-0.05％，余量为水，pH7.0-7.2。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：在步骤(1)，所述凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的质量比为1-5：3-1。
3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：在步骤(2)的种子液制备中，包括将活化的混合菌种进行一级摇床培养16-18h，然后接种二级，二级培养16-20h后再接种发酵罐进行发酵培养。
4.根据权利要求3所述的芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：所述种子液培养基，按质量分数计：红糖2％，葡萄糖1％，乙酸钠0.1％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0-7.2。
5.根据权利要求1所述的芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：所述发酵培养基，按质量分数计：红糖2％，葡萄糖1％，乙酸钠0.1％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰0.001％，硫酸镁0.01％，余量为水，pH7.0-7.2。
6.根据权利要求1所述的芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：所述种子液培养基分装于500mL三角瓶中，每瓶装250mL，0.1Mpa×121℃高压蒸汽灭菌20min。
7.根据权利要求1所述的芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：所述斜面培养基，按质量分数计：牛肉膏1-3％，葡萄糖0.5-4％，乙酸钠0.05-0.2％，蛋白胨0.05-0.2％，琼脂0.1-0.4％，磷酸氢二钾0.1-0.4％，余量为水。
8.根据权利要求7所述的芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：所述斜面培养基，按质量分数计：牛肉膏2％，葡萄糖1％，乙酸钠0.1％，蛋白胨0.1％，琼脂0.2％，磷酸氢二钾0.2％，余量为水。
9.根据权利要求1所述的芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：所述发酵培养分两阶段进行，前期进行厌氧培养，后期进行好氧培养；所述厌氧培养的条件为：培养温度30-35℃，pH值控制为7.0-7.2，培养时间8-14h，搅拌转速120-200r/min。
10.根据权利要求9所述的芽孢杆菌液发酵培养方法，其特征在于：所述好氧培养的条件为：培养温度30-35℃，通气量250L/min，pH值控制为7.0-7.2，培养时间24-36h，搅拌转速120-200r/min。
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