CN108208335A - 一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，集成现代混菌微生物发酵技术、酶技术等，研制开发出高蛋白、高氨基酸含量、低游离棉酚含量、高饲料报酬率的棉粕蛋白饲料，具体工艺为混菌好氧发酵和混菌厌氧发酵二步工序，其中好氧发酵菌群包括黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌；厌氧发酵菌群包括酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌。该工艺采用多菌混菌发酵，通过不同代谢能力的组合,完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用，通过微生物之间协同发酵对各种原料的有效转化、蛋白饲料的品质提高起到了重要的积极作用，具有产品功效好、工艺简单高效、发酵周期短，生产成本低等优势，易于工业化规模生产。

Description

一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺
技术领域
本发明涉及一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，尤其是一种利用多种益生菌协同发酵制备高蛋白含量、高饲料报酬率发酵棉粕的生产工艺，属于生物工程领域。
背景技术
饲料资源短缺，尤其蛋白质类饲料是制约我国畜牧业发展的瓶颈之一，如何有效缓解我国蛋白饲料资源短缺是函待解决的一大问题。蛋白质原料是饲料工业发展的基础，我国蛋白质原料的紧缺和价格高涨已经成为制约畜牧业发展的瓶颈。目前随着人们生活水平的提高和对生活质量的重视，对肉、蛋、奶、水产品的需求日益增多，粮食和饲料生产面临严峻考验，饲料蛋白资源将日益匮乏，因此提高粮食向畜牧产品的转化效率和饲料的利用率，拓展饲料资源，开发非常规饲料已迫在眉睫。而缓解矛盾的重要策略就是针对现有蛋白源，提高其利用率，尽可能地挖掘饲料的可利用营养成分，从根本上缓解饲料原料供应紧张的局面。
我国是一个产棉大国，每年平均产棉籽近1000万吨，棉粕600多万吨。棉粕中粗蛋白含量约为44%，消费量约占蛋白饲料的8%，是重要的蛋白质饲料资源。但是棉粕含有毒物质棉酚，会对动物生长、发育和繁殖等产生明显的不良影响；且含有纤维素、低聚糖( 棉子糖、水苏糖) 、植酸等抗营养因子；粗蛋白含量高，但蛋白质品质较差，蛋氨酸等必需氨基酸含量低且不平衡，上述因素限制了棉粕在饲养业中的广泛应用。一直以来，为了提高棉粕在饲料中的应用，研究人员进行了棉酚高效脱毒菌株的筛选及其脱毒效果等的研究工作，但对棉粕营养价值提升缺乏显著的应用效果。高效开发利用棉粕，实现棉粕蛋白营养价值和饲用价值的提升，对农副产品加工产业和畜牧业的发展具有十分重要的促进作用，意义重大。
现有研究表明，利用有益微生物发酵饲料，不仅能改善饲料的适口性，提高饲料消化吸收率，促进畜禽的健康生长，而且能预防肠道疾病的发生，减少抗生素的使用，为人们提供健康安全的动物产品。将含有较多抗营养因子的农谷产品及其加工副产物转化为高效能的生物饲料，代替部分粮食饲料，可降低养殖成本，缩短饲养周期，减少环境污染，具有广阔的应用前景。目前，已公开了系列利用微生物发酵工艺制备发酵豆粕的专利，如专利201510232514.4公开了一种固态发酵棉粕的方法，以枯草芽孢杆菌、酵母菌、植物乳杆菌对棉粕进行固态发酵，混菌发酵后游离棉酚降解率≥60%棉粕蛋白降解效果好；专利CN201511022133.2公开了一种棉粕发酵饲料及用于其生产发酵的复合菌，复合菌包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酿酒酵母菌，可提高棉粕粗蛋白质、小分子肽及乳酸含量；专利CN201710646207.X公开了一种棉粕蛋白饲料的制备方法，将粉碎后的棉粕蒸煮形成发酵物料，利用黑曲霉和酒用活性干酵母、枯草芽孢杆菌、黄色短杆菌分段式发酵以制备棉粕蛋白饲料，不仅大幅降低了棉粕中游离棉酚的含量，而且提高了棉粕中的蛋白含量。综合分析现有研究结果，尽管目前在利用微生物发酵制备棉粕蛋白饲料方面取得了一系列研究成果，但仍存在发酵工艺复杂、发酵周期较长、工业化转化能力较弱、生产成本较高、产品营养指标可进一步提升等技术弊端。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，满足市场对高蛋白、高饲料报酬率棉粕蛋白饲料的需求，本发明提供一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，集成现代混菌微生物发酵技术、酶技术等，研制开发出高蛋白、高氨基酸含量、低游离棉酚含量、高饲料报酬率的棉粕蛋白饲料，该工艺技术发酵工艺简单高效、发酵周期短，生产成本低，易于工业化规模生产。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，具体包括混菌好氧发酵和混菌厌氧发酵二步工序，其中好氧发酵菌群包括黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌；厌氧发酵菌群包括酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌。
上述好氧发酵菌群中黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌的用量比为1.2:0.8:1:4。
上述酵母菌可以是产朊假丝酵母、啤酒酵母、酿酒酵母、脆壁克鲁维酵母中一种或几种的混合菌；
优选的，酵母菌的最佳菌种为产朊假丝酵母与脆壁克鲁维酵母的混合菌，其用量比为7:3。
上述黑曲霉的种子液制备方法为：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮：水＝1：1.0～1.3比例加入水，拌匀至无干粉又无结团现象。拌匀后，分装入2000mL三角瓶中，每只2000mL三角瓶装湿麸皮约100g，在0.1MPa表压下灭菌40～60min，冷却至35℃，每一个三角瓶中接入1-2环已活化好的斜面米曲霉cv-8、黑曲霉sp-1孢子，培养基品温控制在(35±1)℃．每隔12-24h摇瓶一次，孢子长出后停止制备孢子悬浮液；然后按照上述方法接种至种子罐进行扩大培养，制备成二级种子液。
上述酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，6000r/min条件下离心15min收集菌体，并用质量浓度0.85%的无菌生理盐水洗涤酵母菌体两次，最后用无菌的生理盐水洗下酵母菌，制成酵母菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用。
上述枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用。
上述酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌的种子液制备方法为：将斜面或甘油管保藏菌种截至相应的种子培养基，其中酪酸梭状芽孢杆菌接种至LB培养基，乳酸菌菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液。
上述乳酸菌可以是嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌中的一种或几种的混合。
本发明还提供了一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其具体工艺步骤包括：
（1）预处理：选取无霉变的棉粕，粉碎过40目筛，调整棉粕含水量40～60%；
（2）配制固体培养基：向棉粕中加入3～5wt%糖蜜、2～3wt %玉米浆、1.5～2wt%尿素、1～1.5wt%硫酸铵、0.1～0.2wt%磷酸二氢钾，并加入0.5～1wt%非淀粉多糖酶，调整初始pH为6.5～7.0；
（3）好氧发酵：将黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌接种至培养基，总接种量为固体培养基的2～3%，拌匀后控温35～40℃培养，通风培养24～30h；
（4）厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌，接种量分别为固体培养基的1.5～2%、1～1.5%，厌氧发酵12～16h;
（5）干燥：发酵结束后低温通风干燥；
（6）粉碎：将干燥后的发酵棉粕粉碎即得棉粕蛋白饲料。
上述步骤（2）中固体培养基无需灭菌。
本发明提供了一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，所得棉粕饲料蛋白影响价值显著提升，通过微生物的发酵作用不但提升了棉粕中蛋白和氨基酸含量，而且产品中富含益生菌、维生素、酶及氨基酸、短肽、优质蛋白质等营养成分，棉粕中游离棉酚、纤维素、木聚糖、植酸等抗营养因子被有效降解，产品营养、安全、绿色，具有促进生长发育、提高饲料利用率、增强免疫力、改进肠道微生态、防止疾病、减少环境污染等优点。动物实验结果表明，发酵后的棉粕安全、无毒副作用。
本发明提供一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）本申请利用好氧菌（黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌）和厌氧菌（酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌）共同发酵制备棉粕蛋白饲料，充分利用微生物菌种间的协同作用，显著提升棉粕的饲用营养价值，其中：黑曲霉同化淀粉和纤维素的能力强，可将棉粕的结构性碳水化合物降解为酵母可利用的单糖、双糖等单糖类物质，使酵母、芽孢杆菌、乳酸菌等得以良好的生长；酵母菌的存在可以促进黑霉菌的降解作用，且酵母的大量繁殖增加了产品中的菌体蛋白，对发酵产品产生良好的发酵香味也有很大作用；枯草芽孢杆菌是目前已报道的降解棉粕中游离棉酚最有效的益生菌，并具有较强的产蛋白酶能力，可以将棉粕中大分子蛋白质降解为动物更易吸收的小分子量蛋白质、肽及氨基酸；冷解糖芽孢杆菌的存在不仅可以通过其生理代谢产生功能性细菌多糖，而且显著提升混合菌发酵棉粕作用效果，其机理有待进一步研究；酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌产生乳酸等则可改善发酵棉粕的适口性，提高产品中的益生菌含量，进入动物肠道后，对促进双歧杆菌等肠道益生菌的生产，抑制病害菌生长，恢复肠道菌群平衡，增强肠道免疫功能和生理功能具有重要作用；
（2）采用多菌混菌发酵，组合菌株发酵增加了发酵中的许多基因功能,通过不同代谢能力的组合,完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用，通过微生物之间的互惠和偏利生提高生产效率，协同发酵形式对各种原料的有效转化、蛋白饲料的品质提高起到了重要的积极作用；产品质量指标显著高于技术水平,经测定产品赖氨酸含量由发酵前的1.32%提升到发酵后的4.88%，蛋氨酸由发酵前的0.32%提升到发酵后的0.71%，异亮氨酸由发酵前的1.58%提升到发酵后的2.03%，精氨酸由发酵前的5.09%提升到发酵后8.43%；本申请技术方案有效降解了棉粕中游离棉酚、纤维素、木聚糖、植酸等抗营养因子：游离棉酚由发酵前的845mg/Kg降到发酵后的15mg/Kg，脱毒率达到98.22%；棉子糖含量由发酵前的3.75%降低到发酵后的完全降解；粗纤维由发酵前的12.23%降低到发酵后的0.47%；植酸含量由发酵前的1.93%降低到发酵后的0.12%，降解率达到93.78%；
（3）采用分段发酵，发酵菌株对温度、pH、通氧等要求不同，不同的反应控制条件，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率，在本技术方案下，最长发酵时间为48h，显著低于行业内现有技术的发酵时间；
（4）发酵工艺条件温和，生产成本低，采用固体发酵，且发酵周期较短，本技术方案生产成本仅为目前已报道技术水平的1/2，对提升行业经济效益及规模化推广应用具有重要作用；
（5）采用固态发酵，生产工艺简单，能耗低、无环境污染、投资小、易于规模化生产。
具体实施方式
实施例1
一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）预处理：选取无霉变的棉粕，粉碎过40目筛，调整棉粕含水量40～60%；
（2）种子液制备：
本技术方案下，酵母菌为产朊假丝酵母与脆壁克鲁维酵母的混合菌，其用量比为7:3，乳酸菌为嗜酸乳杆菌；
①黑曲霉的种子液制备方法为：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮：水＝1：1.0～1.3比例加入水，拌匀至无干粉又无结团现象。拌匀后，分装入2000mL三角瓶中，每只2000mL三角瓶装湿麸皮约100g，在0.1MPa表压下灭菌40～60min，冷却至35℃，每一个三角瓶中接入1-2环已活化好的斜面米曲霉cv-8、黑曲霉sp-1孢子，培养基品温控制在(35±1)℃．每隔12-24h摇瓶一次，孢子长出后停止制备孢子悬浮液；然后按照上述方法接种至种子罐进行扩大培养，制备成二级种子液
②酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，6000r/min条件下离心15min收集菌体，并用质量浓度0.85%的无菌生理盐水洗涤酵母菌体两次，最后用无菌的生理盐水洗下酵母菌，制成酵母菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用；
③枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用；
④酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌的种子液制备方法为：将斜面或甘油管保藏菌种截至相应的种子培养基，其中酪酸梭状芽孢杆菌接种至LB培养基，乳酸菌菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液；
（3）配制固体培养基：向棉粕中加入4wt%糖蜜、2.5wt %玉米浆、1.8wt%尿素、1.2wt%硫酸铵、0.15wt%磷酸二氢钾，并加入0.75wt%非淀粉多糖酶，调整初始pH为6.5～7.0；
（4）好氧发酵：将黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌接种至培养基，总接种量为固体培养基的2.5%，其中黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌的用量比为1.2:0.8:1:4；拌匀后控温35～40℃培养，通风培养27h；
（5）厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌，接种量分别为固体培养基的1.8%、1.2%，厌氧发酵14h；
（6）干燥：发酵结束后低温通风干燥；
（7）粉碎：将干燥后的发酵棉粕粉碎即得棉粕蛋白饲料。
实施例2
一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）预处理：选取无霉变的棉粕，粉碎过40目筛，调整棉粕含水量40～60%；
（2）种子液制备：
本技术方案下，酵母菌为啤酒酵母，乳酸菌为保加利亚乳杆菌；
①黑曲霉的种子液制备方法为：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮：水＝1：1.0～1.3比例加入水，拌匀至无干粉又无结团现象。拌匀后，分装入2000mL三角瓶中，每只2000mL三角瓶装湿麸皮约100g，在0.1MPa表压下灭菌40～60min，冷却至35℃，每一个三角瓶中接入1-2环已活化好的斜面米曲霉cv-8、黑曲霉sp-1孢子，培养基品温控制在(35±1)℃．每隔12-24h摇瓶一次，孢子长出后停止制备孢子悬浮液；然后按照上述方法接种至种子罐进行扩大培养，制备成二级种子液
②酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，6000r/min条件下离心15min收集菌体，并用质量浓度0.85%的无菌生理盐水洗涤酵母菌体两次，最后用无菌的生理盐水洗下酵母菌，制成酵母菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用；
③枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用；
④酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌的种子液制备方法为：将斜面或甘油管保藏菌种截至相应的种子培养基，其中酪酸梭状芽孢杆菌接种至LB培养基，乳酸菌菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液；
（3）配制固体培养基：向棉粕中加入5wt%糖蜜、3wt %玉米浆、2wt%尿素、1.5wt%硫酸铵、0.2wt%磷酸二氢钾，并加入1wt%非淀粉多糖酶，调整初始pH为6.5～7.0；
（4）好氧发酵：将黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌接种至培养基，总接种量为固体培养基的3%，其中黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌的用量比为1.2:0.8:1:4；拌匀后控温35～40℃培养，通风培养24h；
（5）厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌，接种量分别为固体培养基的2%、1.5%，厌氧发酵12h；
（6）干燥：发酵结束后低温通风干燥；
（7）粉碎：将干燥后的发酵棉粕粉碎即得棉粕蛋白饲料。
实施例3
一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）预处理：选取无霉变的棉粕，粉碎过40目筛，调整棉粕含水量40～60%；
（2）种子液制备：
本技术方案下，酵母菌为酿酒酵母，乳酸菌为植物乳杆菌；
①黑曲霉的种子液制备方法为：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮：水＝1：1.0～1.3比例加入水，拌匀至无干粉又无结团现象。拌匀后，分装入2000mL三角瓶中，每只2000mL三角瓶装湿麸皮约100g，在0.1MPa表压下灭菌40～60min，冷却至35℃，每一个三角瓶中接入1-2环已活化好的斜面米曲霉cv-8、黑曲霉sp-1孢子，培养基品温控制在(35±1)℃．每隔12-24h摇瓶一次，孢子长出后停止制备孢子悬浮液；然后按照上述方法接种至种子罐进行扩大培养，制备成二级种子液
②酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，6000r/min条件下离心15min收集菌体，并用质量浓度0.85%的无菌生理盐水洗涤酵母菌体两次，最后用无菌的生理盐水洗下酵母菌，制成酵母菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用；
③枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用；
④酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌的种子液制备方法为：将斜面或甘油管保藏菌种截至相应的种子培养基，其中酪酸梭状芽孢杆菌接种至LB培养基，乳酸菌菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液；
（3）配制固体培养基：向棉粕中加入3wt%糖蜜、2wt %玉米浆、1.5wt%尿素、1wt%硫酸铵、0.1wt%磷酸二氢钾，并加入0.5wt%非淀粉多糖酶，调整初始pH为6.5～7.0；
（4）好氧发酵：将黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌接种至培养基，总接种量为固体培养基的2%，其中黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌的用量比为1.2:0.8:1:4；拌匀后控温35～40℃培养，通风培养30h；
（5）厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌，接种量分别为固体培养基的1.5%、1%，厌氧发酵16h；
（6）干燥：发酵结束后低温通风干燥；
（7）粉碎：将干燥后的发酵棉粕粉碎即得棉粕蛋白饲料。
实施例4 以下以试验数据说明本申请取得的技术效果
1、指标测定方法
（1）蛋白成分指标与测定方法
参照刘俊（2011）方法，称取3份过60目筛的发酵棉粕5g，各加70ml水于恒温振荡器上震荡3h，加入20mL10%的三氯乙酸（TCA），过滤并用10%（M:M）的三氯乙酸（TCA）定容至100ML，将滤液进行4000rpm离心10min，取上清液作为分析样品；
采用凯氏定氮法（GB5005.5-2010）测定发酵棉粕粗蛋白、酸溶蛋白总氮；
取20mL离心上清液用旋转蒸发仪蒸发浓缩至5mL左右，无损转移到氨基酸水解管，运用全自动分析仪根据AOAC氨基酸测定方法分析发酵棉粕的上清液总氨基酸（TAA）；
（2）乳酸含量测定：发酵棉粕中乳酸含量测定采用酸碱滴定法。样品中乳酸的提取方法：准确称取烘干后的发酵产物2g，置于100mL烧杯中，加入50mL超纯水，于4℃条件下静置24h后，过滤于150mL锥形瓶中，滴入2～3滴酚酞指示剂，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定至溶液微红即可。乳酸含量计算公式：
乳酸含量（%）=
式中：C为氢氧化钠浓度，V为样液消耗氢氧化钠体积，V0为空白消耗氢氧化钠体积，M为乳酸摩尔质量，m为样品称取质量。
2、试验分组
试验分为实施例1试验组、空白对照组（重蒸水代替菌悬液，其余工艺同实施例1）、对照1组（好氧菌群不含冷解糖芽孢杆菌，其余菌种接种比例及生产工艺同实施例1）、对照2组（好氧菌群仅含冷解糖芽孢杆菌，厌氧菌群及其余生产工艺同实施例1）、对照3组（好氧菌群中冷解糖芽孢杆菌的接种量增加0.2倍，其余菌种接种比例及生产工艺同实施例1）、对照4组（厌氧菌群中乳酸菌由酪酸梭状芽孢杆菌代替，其余生产工艺均同实施例1）、对照5组（厌氧菌群中酪酸梭状芽孢杆菌由乳酸菌代替，其余生产工艺均同实施例1）。
3、数据分析统计
数据运用SPSS11.5软件的随机单因素分析，并采用LSD多重比较法，用“平均值±标准差（SD）”表示。
4、试验结果
试验结果如下表所示:
表1 不同工艺条件对发酵棉粕营养指标的影响
测定指标 粗蛋白（%） 酸溶蛋白（%） 总氨基酸（mg/g） 乳酸（%）
空白对照组 43.96±2.11 29.81±1.79 1.91±0.09 /
实施例1试验组 56.08±1.65 55.14±1.83 18.98±1.05 7.48±0.54
对照1组 52.07±1.98 47.17±1.59 9.69±0.86 6.69±0.61
对照2组 45.85±2.05 31.05±1.72 4.56±0.41 4.89±0.36
对照3组 52.98±2.47 48.38±2.06 15.27±1.59 7.02±0.42
对照4组 54.73±1.99 50.47±1.87 15.38±1.17 1.42±0.18
对照5组 53.21±2.06 51.24±2.32 13.04±0.79 5.74±0.62
上述试验结果表明，好氧发酵菌群中冷解糖芽孢杆菌对产品粗蛋白、酸溶蛋白、总氨基酸含量有着显著影响，并取得了“1+1>2”的技术效果，但增加冷解糖芽孢杆菌的接种量反而不利于提升产品营养价值；厌氧菌群对粗蛋白、酸溶蛋白和氨基酸含量的变化影响不显著，但对产品乳酸含量影响显著，并取得了“1+1>2”的技术效果。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其他证在于具体包括混菌好氧发酵和混菌厌氧发酵二步工序，其中好氧发酵菌群包括黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌；厌氧发酵菌群包括酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌。
2.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其特征在于所述好氧发酵菌群中黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌的用量比为1.2:0.8:1:4。
3.根据权利要求1和2所述的一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其特征在于所述酵母菌可以是产朊假丝酵母、啤酒酵母、酿酒酵母、脆壁克鲁维酵母中一种或几种的混合菌。
4.根据权利要求1-3所述的一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其特征在于所述酵母菌的最佳菌种为产朊假丝酵母与脆壁克鲁维酵母的混合菌，其用量比为7:3。
5.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其特征在于所述黑曲霉的种子液制备方法为：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮：水＝1：1.0～1.3比例加入水，拌匀至无干粉又无结团现象。拌匀后，分装入2000mL三角瓶中，每只2000mL三角瓶装湿麸皮约100g，在0.1MPa表压下灭菌40～60min，冷却至35℃，每一个三角瓶中接入1-2环已活化好的斜面米曲霉cv-8、黑曲霉sp-1孢子，培养基品温控制在(35±1)℃．每隔12-24h摇瓶一次，孢子长出后停止制备孢子悬浮液；然后按照上述方法接种至种子罐进行扩大培养，制备成二级种子液。
6.根据权利要求1-4所述的一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其特征在于所述酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，6000r/min条件下离心15min收集菌体，并用质量浓度0.85%的无菌生理盐水洗涤酵母菌体两次，最后用无菌的生理盐水洗下酵母菌，制成酵母菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用。
7.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其特征在于所述枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌菌悬液，用血球计数板计数，控制菌悬液浓度为1×108CFU/mL，冰箱保存待用。
8.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其特征在于所述酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌的种子液制备方法为：将斜面或甘油管保藏菌种截至相应的种子培养基，其中酪酸梭状芽孢杆菌接种至LB培养基，乳酸菌菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液。
9.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其特征在于所述乳酸菌可以是嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌中的一种或几种的混合。
10.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵法提高棉粕饲用营养价值的工艺，其特征在于所述工艺具体步骤包括：
（1）预处理：选取无霉变的棉粕，粉碎过40目筛，调整棉粕含水量40～60%；
（2）配制固体培养基：向棉粕中加入3～5wt%糖蜜、2～3wt %玉米浆、1.5～2wt%尿素、1～1.5wt%硫酸铵、0.1～0.2wt%磷酸二氢钾，并加入0.5～1wt%非淀粉多糖酶，调整初始pH为6.5～7.0；
（3）好氧发酵：将黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌、冷解糖芽孢杆菌接种至培养基，总接种量为固体培养基的2～3%，拌匀后控温35～40℃培养，通风培养24～30h；
（4）厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种酪酸梭状芽孢杆菌和乳酸菌，接种量分别为固体培养基的1.5～2%、1～1.5%，厌氧发酵12～16h;
（5）干燥：发酵结束后低温通风干燥；
（6）粉碎：将干燥后的发酵棉粕粉碎即得棉粕蛋白饲料；
上述步骤（2）中固体培养基无需灭菌。
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