CN102687792A - 一种基于啤酒糟和米糠粕的饲用微生态制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用啤酒糟和米糠粕经益生菌三期发酵，生产一种高效、极低成本的饲用微生态制剂，或者叫微生物饲料添加剂。其特征是：啤酒糟和米糠粕经过脉孢菌一期初步发酵预处理，充分降解木质素、纤维素等，再添加部分米糠粕和少量豆粕经芽孢杆菌和酵母菌二期发酵，吸收霉菌降解废弃物产生的营养物质及霉菌本身解体的营养物质。然后加部分米糠粕和少量豆粕，经乳酸菌、双歧杆菌等最后在单向膜厌氧袋中经三期厌氧发酵成成品。本发明固体原料不需高温灭菌，成品不需要干燥处理，保质期一年以上，添加量达5-30%，活性益生菌数极高，酶量丰富，杂菌极少，饲养效果明显，具有明显的生态和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于饲用微生态制剂领域，特别是涉及基于纤维质的酿造废弃物的高效低成本的新型微生物饲料添加剂。
背景技术
中国已是世界第一啤酒大国，年产啤酒糟1千万吨以上，啤酒糟含有丰富蛋白质（25-35%）、纤维素（14-25%）、脂类（6—10%）、维生素等营养成分，但其水分含量高，不易贮存，一旦滞销很容易霉烂、腐败而影响环境。目前国内一些啤酒生产企业将啤酒糟直接干燥处理，用于饲料出售，不仅能耗大，这种饲料中的非蛋白氮和无机氮不能被饲养动物有效利用，纤维素也阻碍了营养成分的吸收。因此合理的开发和利用啤酒糟不仅能变废为宝，而且能给企业带来一定的经济效益。公开专利CN1745647A以废酵母和黑曲霉接种啤酒糟发酵，公开专利CN101779749A以黑曲霉和产朊假丝酵母接种啤酒糟发酵，这些菌种对纤维素降解都不彻底，霉菌发酵后霉味明显，降低饲料的适口，产品需要干燥处理，能耗大，特别是益生菌种类少，存活率低，益生效果很小。公开专利CN101139560A以乳酸杆菌，枯草杆菌和奇异酵母接种啤酒糟发酵，这些菌种对纤维素降解都不彻底，发酵只有一步，需氧和厌氧发酵没有分开，发酵效果不好，啤酒糟需要风干后再配料，重新加蒸馏水，过程烦长，不适合产业化。公开专利CN101584376A和CN101139560A以粗糙脉孢菌为纤维素降解菌，有不错的降解能力，但啤酒糟先烘干，能耗太大，粗糙脉孢菌作为产品成份给畜禽吃，适口性不好，菌本身不是农业部批准的益生菌，虽然后者有乳酸菌加入，但一步发酵，需氧和厌氧矛盾，乳酸菌菌体生长不好，加上这些产品都要干燥处理，菌体一般已死，益生菌效果不明显。
对于啤酒糟含水分较多，最好用其它含水分很少的工农业副产物调节水分为好，如米糠，糠是稻谷加工过程中所产生的副产品，由种皮、果皮、外胚乳和糊粉层组成。米糠营养丰富，其中富含水分、粗蛋白质（12-15%）、粗脂肪（6-18%）、粗纤维（6-16%），水溶性多糖、维生素、还含有油酸、亚油酸、磷脂等脂肪酸以及各种矿物质。中国是稻谷产量最大的国家，年产米糠也在千万吨以上，米糠饲用时，一般是直接投料饲喂，但是由于米糠粗纤维过高，糠质干燥，难以消化，会吸收肠道内过多的水分，如果饲喂过多再加上饮水不足和管理不善，极易引起猪便秘。再者，米糠含有其它一些抗营养因子，例如含有胰蛋白酶抑制因子（trypsininhibitor，TI）。因此，米糠经过适当处理后，饲用效果可能更好，公开专利CN102334611A接入纳豆芽孢杆菌和酵母菌，公开专利CN102356815A接入酵素菌、枯草杆菌、酵母菌和嗜乳酸杆菌，这些菌对米糠的木质纤维素降解能力有限，而且后者需氧菌和厌氧菌一步发酵，效果不好。这些发酵产品都要干燥处理，能耗大，益生菌菌酶保存率低，饲用效果不佳，不利于产业化推广。
发明内容
本发明的目的在于生产一种基于啤酒糟、米糠粕的高效极低成本的饲用微生态制剂，添加量大，可达5-30%，综合营养丰富，也称微生物饲料蛋白，成品中益生菌主要有芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、双歧杆菌，活菌数60亿以上cfu/g，功能酶、营养物质丰富，必需氨基酸匀恒，饲养效果显著，价廉物美，保存期长，市场容量大，环境友好，社会和经济效益明显。
本发明所述的基于啤酒糟和米糠的微生态制剂是以啤酒糟为主要氮源兼部分碳源，以米糠为主要碳源兼氮源，经食品级脉孢霉一期发酵预处理，充分降解稻壳来源的米糠中木质素和纤维素及啤酒糟中的粗纤维，再以芽孢杆菌和酵母菌为发酵菌种同时补料添加部分米糠粕和少量豆粕进行二期发酵，最后再添加部分米糠粕和少量豆粕作为氮源兼碳源，接种乳酸菌和耐酸双歧杆菌并充分混匀后，分装在单向膜厌氧袋中密封保存，即三期发酵获得成品。
本发明所有菌种
这里的脉孢霉为：粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)，好食脉孢霉(Neurospora sitophila). 中间脉孢霉(Neurospora intermedia)的任意一种或多种。酵母菌为：热带假丝酵母(Candida tropicalis)，产朊假丝酵母（Candida utilis），啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的任意一种或多种。双歧杆菌为：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)等。乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) 等的任意一种或多种。芽孢杆菌为：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆杆菌（Bacillus natto）的任意一种或多种。上述菌种为普通菌株，在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）或市场上都能购买到。
本发明产品的具体生产过程如下：
1第一期生物预处理发酵
（1） 脉孢霉的种子和生产培养基。
斜面培养基和平板培养基：马铃薯200 g，蔗糖 20 g，琼脂 20 g，定容1L中，pH 5.0， 110℃灭菌30min。接种30℃培养4-10 天。
种子液体培养基：KH2PO4 2g，MgSO4 0.3g，CaCl2 0.3g，蛋白胨 5g，酵母浸膏3 g，麦芽汁3g，FeSO4·7H2O 0.005g，ZnSO4 0.0014g，MnSO4.4H2O 0.0016g，CoCl20.002 g，定容于1 L中，pH 5.0。500 ml 三角瓶中加100 ml 培养基，110℃灭菌30min。
固态发酵生产种子培养基和生产培养基：粉碎后的湿啤酒糟占培养基总质量40-90%，米糠粕占10-60%，硝酸氨占0.1-3%，尿素占0.1-3%，碳酸钙占0.1-5%，磷酸二氢钾0.1-3%，硫酸镁0.01-1%，培养基最终含水量为55-70%。
(2) 培养方法
将脉孢菌各在斜面培养基上划单菌落复壮，再各挑选强壮的单菌落，各接种在新的斜面培养基25-38℃生长，斜面培养基菌种中的孢子用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中，装液量100-250ml /L三角瓶，150-220 r/min，25-38℃，培养24-48h，再各以1-5%（V/V）接种量，混合转接到200L的种子罐中，于25-38℃，150-220 r /min培养24-48h，活菌总数为1×107 cfu/ml以上，再各以1-10%接种量转接到上述固态发酵培养基，充分搅拌后，25-38℃，发酵24-72h，作为固态发酵生产种子，以1-15%接种量接种到上述固态发酵培养基，充分搅拌后，25-38℃，发酵24-72h，完成一期预处理发酵。进入连续生产阶段，一期固态发酵接种生产种子为上次发酵预处理的固态培养基菌剂，按1-20%接种量接种。
第二期发酵
（1）芽孢杆菌培养基
芽孢杆菌斜面和平板菌种培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，琼脂15g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000ml，最终pH7.0±0.2。110-121℃灭菌20-30min.
芽孢杆菌摇瓶种子培养基和种子罐培养基：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖5.0g/L，FeCl2·6H2O 0.07g/L，MnC12·7H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.15g/L，pH 6.5-7.0，110-121℃灭菌20-30min。
（2）酵母菌培养基
酵母菌斜面培养基和平板菌种培养基(100 ml)：葡萄糖2 g、酵母浸出物1 g、蛋白胨2 g、琼脂2 g，pH 值约6.0。
摇瓶种子培养基和种子罐培养基：成分同斜面培养基，不加琼脂。
（3）二期发酵培养基由一期发酵预处理的固态菌剂再加10-30%米糠粕和1-20%的豆粕组成，含水量为45-55%。首次启动二期发酵要制作混合酵母菌和混合芽孢杆菌液体种子液，再固态发酵产生固态种子，以1-15%接种量接到二期发酵培养基中。
（4）培养方法
芽孢杆菌液体菌种培养：无菌条件下分别将4 ℃保存的芽孢杆菌菌种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆杆菌（Bacillus natto）。各接一环至斜面培养基中，30-37 ℃培养16-36 h 复苏菌种。再在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述芽孢杆菌摇瓶种子培养基，装液量100-300ml /L三角瓶， 150-240 r/min，28-38℃，培养16-24h，再以1-10%的接种量混合接种到上述200L种子罐培养基扩大培养，150-240r/min，通气量为20-50L/min，培养16-24h后制得复合芽孢杆菌液体种子，活菌总数为2×107 cfu/ml以上。
酵母菌液体菌种培养：
无菌条件下分别将4 ℃保存的酵母菌菌种：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，产朊假丝酵母（Candida utilis）。分别接一环至斜面培养基中，28-38 ℃培养24-48 h 复苏菌种。再挑单菌落各在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述酵母菌摇瓶种子培养基，装液量100-300ml /L三角瓶, 150-240 r/min，28-38℃ ,培养24-48h，再以1-10%的接种量混合接种到上述200L种子罐培养基扩大培养，150-240r/min，通气量为20-50L/min，培养24-48h后制得复合酵母菌液体种子，活菌总数为2×107 cfu/ml以上。
二期固态发酵：
上述混合芽孢杆菌液体种子以1-10%接种量，混合酵母菌液体菌种以1-10%接种量，都接种到二期发酵培养基，充分搅拌，28-38℃通气发酵12-72h，得到第一批二期固态发酵完成后的半成品。进入连续生产阶段，种子为上次二期发酵的剩余固态菌剂，按1-20%接种量，接种到二期发酵培养基上，这样循环接种利用。
3 第三期发酵
（1）乳酸菌培养基
MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0 ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7 H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
摇瓶和种子罐乳酸菌种子培养基：大豆低聚糖2.25%、葡萄糖2.00%、蛋白胨1.25%、酵母粉1.25%、番茄汁6.50%、吐温 80.10%、磷酸氢二钾0.20%。pH 6.5，1L的三角瓶装液量200 ml。
以上培养基配好后均在115-120℃条件下高压灭菌20-30min。
（2）双歧杆菌的培养基
MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0 ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7 H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
厌氧瓶和种子罐双歧杆菌增殖培养基：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温-80 1.0ml，K2HPO4 2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，聚果糖5g和碳酸钙1g 番茄汁65ml。加蒸馏水至1000ml，调pH值为6.5。
以上培养基配好后均在115-120℃条件下高压灭菌15-30min。
（3） 三期发酵培养基
在二期固态发酵菌剂上，加1-40%米糠粕和1-30%豆粕，充分混匀，组成三期发酵培养基，含水量为30-35%。首次启动三期发酵要制作乳酸菌和双歧杆菌液体种子液，以1-15%接种量接到三期发酵培养基进行三期发酵。
（4）培养方法
乳酸菌种子培养
将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），干酪乳杆菌(Lactobacillus Paracasei) 等在MRS斜面培养基上划线活化，在33-38℃培养24-48h进行复壮，并形成单菌落，再各挑取单菌落，接种到乳酸菌种子培养基，33-38℃静置培养24-48h，通入氮气使溶氧维持为0，定时取样，测定生物量。再按1-10%接种量接种到种子罐乳酸菌种子培养基静置培养24-72h，通入氮气使溶氧维持为0，定时取样，测定生物量，活菌总数为5×107 cfu/ml以上。
双歧杆菌种子培养
首先是菌种活化，取保存的菌种，在厌氧操作台上，在装有MRS固体斜面培养基上划线复壮，置于33-38 ℃厌氧培养24 -48h，挑选强壮单菌落，接入装有10 ml液体MRS 培养基的充满氮气的厌氧管中，置于33-38℃厌氧培养24-48 h。再按0.1-1%接种量，接到1L厌氧瓶双歧杆菌增殖培养基中置于33-38℃厌氧培养24-48h，然后再按1-10%接种量接到种子罐双歧杆菌增殖培养基中，进行33-38 ℃厌氧培养，活菌总数为5×107 cfu/ml以上。
第三期固态发酵
在二期固态发酵菌剂上，加1-40%米糠粕和1-30%豆粕组成三期发酵培养基，含水量为30-35%，首次启动三期发酵要制作混合乳酸菌和双歧杆菌液体种子液，混合乳酸菌种子液和双歧杆菌种子液按1:(1-4)比例，活菌总数为5×107 cfu/ml以上，以1-15%接种量接种到三期固态发酵菌剂上，充分搅拌后，尽快装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵，含水量30-35%，产品保质期可达1到2年，保存二到三个月活菌数达到高峰，可达200亿cfu/g固体。
进入连续发酵阶段，三期发酵一个月后，以此成品为种子，按1-20%接种量，接到上述三期发酵培养基中，搅拌充分后，装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵，进入连续生产阶段，产品保质期可达1到3年，保存二个月活菌数达到高峰，可达200亿cfu/g。
本发明固体原料不需高温灭菌，成品不需要干燥处理，保质期一年以上，添加量达5-30%，活性益生菌数极高，酶量丰富，杂菌极少，饲养效果明显，具有明显的生态和社会效益。
具体实施方式
下述实施例中所用菌种仅为举例说明，不是对本发明的限制，本发明保护范围内的菌种均都实现发明目的。
实施例1
第一期生物预处理发酵
（1） 脉孢霉种子和生产培养基。
斜面培养基和平板培养基：马铃薯200 g，蔗糖 20 g，琼脂 20 g，定容1 L 中，pH 5.0, 110℃灭菌30min。接种30℃，培养7-10 天。
种子液体培养基：KH2PO4 2g，MgSO4 0.3g，CaCl2 0.3g，蛋白胨 5g，酵母浸膏3 g，麦芽汁3g，FeSO4·7H2O 0.005g，ZnSO4 0.0014g，MnSO4.4H2O 0.0016g，CoCl20.002 g，定容于1 L中，pH 5.0。500 ml 三角瓶中加100 ml 培养基，110℃灭菌30min。
固态发酵生产种子培养基和生产培养基：粉碎后的湿啤酒糟占培养基总质量67%，米糠粕占28%，硝酸氨占2%，尿素占1%，碳酸钙占1%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁0.1%，培养基最终含水量为59%。
（2） 培养方法
将粗糙脉孢霉(Neurospora crassa CGMCC3.1600)，好食脉孢霉(Neurospora sitophila, CGMCC3.1618). 中间脉孢霉(Neurospora intermedia, CGMCC 3.591)。各在斜面培养基上划单菌落复壮，再各挑选强壮的单菌落，接种在新的脉孢菌斜面培养基30℃生长，斜面培养基菌种中的孢子用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中, 装液量200ml /1L三角瓶, 180 r/min，30℃ ,条件下培养24h，再以1%接种量，混合转接到200L的种子罐中，于30℃ , 180 r /m in培养24h，活菌总数为5×108cfu/ml以上，再以10%（重量)接种量转接到上述固态发酵培养基，充分搅拌后，30℃，发酵48h，作为固态发酵生产种子，以10%接种量（重量)接种到上述固态发酵培养基，充分搅拌后，30℃，发酵48h，完成一期预处发酵。进入连续生产阶段，一期发酵接种生产种子为上次发酵的预处理的固态培养基，按10%（重量)接种量接种接到新的一期培养基中。
实施例2
第二期发酵
（1）芽孢杆菌培养基
芽孢杆菌斜面和平板菌种培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，琼脂15g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000ml，最终pH7.0±0.2。110℃灭菌30min.
芽孢杆菌摇瓶种子培养基和种子罐培养基：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖5.0g/L，FeCl2·6H2O 0.07g/L，MnC12·7H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.15g/L，pH 7.0，110℃灭菌30min。
（2）酵母菌培养基
酵母菌斜面培养基和平板菌种培养基(100 ml)：葡萄糖2 g、酵母浸出物1 g、蛋白胨2 g、琼脂2 g，pH 值约6.0。
摇瓶种子培养基和种子罐培养基：成分同斜面培养基,不加琼脂。
（3）二期发酵培养基由一期发酵预处理的固态菌剂再加15%米糠和5%豆粕组成，含水量为48%。首次启动二期发酵要制作酵母菌和芽孢杆菌液体种子液，再固态发酵产生固态种子，以10%接种量接到二期发酵培养基。
（4）培养方法
芽孢杆菌液体菌种培养：无菌条件下分别将4 ℃保存的芽孢杆菌菌种：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis, CGMCC 1.813）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, CGMCC 1.884）、纳豆杆菌（Bacillus natto, CGMCC 1.1086）。各接一环至斜面培养基中，37 ℃培养36 h 复苏菌种。再在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述芽孢杆菌摇瓶种子培养基，装液量200ml /1L三角瓶， 220 r/min，30℃培养16h，再各以2%的接种量接种到上述200L种子罐培养基扩大培养，220r/min，通气量为40L/min，培养24h后制得混合芽孢杆菌液体种子，活菌总数为1×109cfu/ml以上。
酵母菌液体菌种培养：
无菌条件下分别将4 ℃保存的酵母菌菌种：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, CGMCC 2.1527)，热带假丝酵母(Candida tropicalis, CGMCC 2.637)，产朊假丝酵母（Candida utilis, CGMCC 2.1180）。接一环至斜面培养基中，30 ℃培养24 h 复苏菌种。再分别在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述酵母菌摇瓶种子培养基，装液量200ml /1L三角瓶，220 r/min，30℃培养24h，再各以1%的接种量接种到上述200L种子罐培养基扩大培养，220r/min，通气量为40L/min，培养24h后制得混合酵母菌液体种子，活菌总数为1×109cfu/ml以上。
二期固态发酵：
上述混合芽孢杆菌液体种子以5%接种量，混合酵母菌液体菌种以5%接种量，接种到二期固体发酵培养基，充分搅拌，35℃通气发酵48h，得到第一批二期固态发酵完成后的半成品。进入连续生产阶段，固态发酵种子为上次二期发酵的剩余固态菌剂，按10%接种量，接种到新的二期固体发酵培养基上，这样循环接种利用。
实施例3
第三期发酵
(1)乳酸菌培养基
MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0 ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7 H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
摇瓶和种子罐乳酸菌种子培养基(g/L)：大豆低聚糖2.25%、葡萄糖2.00%、蛋白胨1.25%、酵母粉1.25%、番茄汁6.50%、吐温 80.10%、磷酸氢二钾0.20%。pH 6.5，1L的三角瓶装液量200 ml。
以上培养基配好后均在115℃条件下高压灭菌30min。
(2) 双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum，CGMCC 1.2477）的培养基
MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0 ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7 H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
厌氧瓶和种子罐双歧杆菌增殖培养基: 蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐温-80 1.0ml，K2HPO4 2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，ZnSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，聚果糖5g和碳酸钙1g 番茄汁65ml，加蒸馏水至1000ml，调pH值为6.5。
以上培养基配好后均在115℃条件下高压灭菌30min。
（3）三期发酵培养基：
在二期固态发酵菌剂上，加35%米糠粕和5%豆粕，充分混匀，组成三期发酵培养基，含水量为32%。首次启动三期发酵要制作乳酸菌和双歧杆菌液体种子液，以10%接种量（重量）接到三期发酵培养基进行三期发酵。
（4）培养方法
乳酸菌种子培养
将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, CGMCC 1.557），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus, CGMCC 1.1482），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus, CGMCC 1.2467），乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis, CGMCC 1.2467），干酪乳杆菌(Lactobacillus casei, CGMCC 1.62) 等各在MRS斜面培养基上划线活化，在37℃培养28h进行复壮，并形成单菌落，再各挑取单菌落，接种到乳酸菌种子培养基，37℃静置培养24h，通入氮气使溶氧维持为0，定时取样，测定生物量。再各按2%接种量接种到种子罐乳酸菌种子培养基静置培养48h，通入氮气使溶氧维持为0，定时取样，测定生物量，活菌总数为1×109cfu/ml以上。
双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum，CGMCC 1.2477）种子培养
首先是菌种活化，取保存的菌种，在厌氧操作台上，在装有MRS固体斜面培养基上划线复壮，置于37 ℃厌氧培养48h，挑选强壮单菌落，接入装有10 ml液体MRS 培养基的充满氮气的厌氧管中，置于37 ℃厌氧培养24 h。再按1%接种量，接到1L厌氧瓶双歧杆菌增殖培养基中置于37 ℃厌氧培养48h，然后再按2%接种量接到种子罐双歧杆菌增殖培养基中，进行37 ℃厌氧培养，活菌总数为1×109cfu/ml以上。
第三期固态发酵
在二期固态发酵菌剂基础上，加35%米糠粕和5%豆粕组成，配成三期发酵培养基，含水量为32%，首次启动三期发酵要制作混合乳酸菌和双歧杆菌液体种子液，混合乳酸菌种子液和双歧杆菌种子液按1:2比例以10%接种（重量）到三期发酵培养基中，充分搅拌后，尽快装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵，含水量32%，产品保质期可达2年，保存二个月活菌数达到高峰，可达200亿cfu/g固体。
进入连续生产阶段，三期发酵一个月后，以此成品为种子，按10%接种量（重量），接到上述三期发酵培养基中，搅拌充分后，装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵，进行连续生产，产品保质期可达2年，保存二个月活菌数达到高峰，可达200亿cfu/g，产品检测结果如表1。
表1，三期发酵成品检测结果
| 检测项目 | 干基（%） | 标准 |
| 粗蛋白质（%） | 25.1 | ＞15 |
| 粗脂肪(g/kg) | 21.11 | ＞15 |
| 粗纤维 | 7.1 | ＜9 |
| 粗灰分(%) | 9.89 | ＜10 |
| 钙(%) | 0.75 | 0.4-0.8 |
| 水溶性氯化物(%) | 0.41 | 0.3-0.8 |
| 霉菌总数(cfu/g) | 2.17×104 | ＜4.5×104 |
| 沙门氏菌(cfu/25g) | 不得检出 | |
| 黄曲霉毒B1(μg/kg) | 1.11 | ＜20 |
实施例4
产品效果实验
试验点为江苏省镇江市京口区谏壁镇龙山村猪场，取30只断奶小猪（长白猪），20公斤左右，混合放养，随机组合成两组，每组15只，试验日粮配方如表2，饲养90天，试验结果如表3。
表2 试验猪日粮配方（%）
| 日粮组成 | 试验组 | 对照组 |
| 玉米 | 62 | 62 |
| 豆粕 | 18 | 28 |
| 麸皮 | 5 | 5 |
| 预混料 | 5 | 5 |
| 微生物饲料 | 10 | 0 |
| 合计 | 100 | 100 |
表3 微生物饲料试验结果
| 项目 组别 | 试验组 | 对照组 |
| 实验猪数量（头） | 15 | 15 |
| 平均始重（kg/头） | 20.1±0.95 | 20±1.11 |
| 平均末重（kg/头） | 96±1.11 | 85±1.82 |
| 全期净增重（kg/头） | 75.9 | 65 |
| 平均日增重（kg/头·日） | 0.843 | 0.722 |
| 平均耗料量（kg/头） | 174.57 | 175.5 |
| 日采食量（kg/头·日） | 1.94 | 1.95 |
| 料肉比 | 2.3:1 | 2.7:1 |
本发明的饲料成本价为1700-1800元/吨，售价为3400元每吨，和豆粕的价格差不多，所以以10%的本发明微生物饲料代替10%的豆粕，从日粮饲料成本上刚好差不多。但是使用本发明饲料的料肉比从2.7:1下降到2.3:1，日采食量基本不变，但是日增重更是从0.722上升到0.843.总体上讲，全期毛重相对于对照组增加10.9Kg，猪价以14元/Kg算，每头猪直接增加收入约152.6元，不包括用药减少，生病减少，猪价略高等增收因素，总体上讲，使用本发明饲料，饲用和经济效果非常明显。
Claims (6)
1. 一种基于啤酒糟和米糠的微生态制剂，其特征是以啤酒糟和米糠经食品级霉菌一期发酵预处理，再以芽孢杆菌和酵母菌为发酵菌种同时补料添加部分米糠和豆粕进行二期发酵，最后再添加部分米糠和少量豆粕作为氮源兼部分碳源，接种乳酸菌和耐酸双歧杆菌并充分混匀后，分装在单向膜厌氧袋中密封保存，即三期发酵获得成品。
2.根据权利要求1所述的微生态制剂，其特征是所述预处理中的发酵培养基配方为粉碎后的湿啤酒糟占培养基总质量40-90%，米糠粕占10-60%，硝酸氨占0.1-3%，尿素占0.1-3%，碳酸钙占0.1-5%，磷酸二氢钾0.1-3%，硫酸镁0.01-1%，培养基最终含水量为55-70%；
首次启动一期发酵要制作液体霉菌种子液，活菌总数为1×107 cfu/ml以上，以1-10%（重量）接种量接到一期发酵培养基中，再固态发酵产生固态霉菌种子，以1-15%接种量接到白酒糟培养基中，进行24-72h的一期发酵，进入连续生产阶段，接种种子为上次预处理的固态培养基，按1-20%接种量接种。
3.根据权利要求1所述的微生态制剂，其特征是所述二期发酵培养基由一期发酵预处理的固态菌剂再加10-30%米糠粕和1-20%的豆粕组成，含水量为45-55%；
首次启动二期发酵要制作酵母菌和芽孢杆菌液体种子液，酵母菌和芽孢杆菌比例为（1：1）～（1：4），活菌总数为2×107 cfu/ml以上，以1-10%（重量）接种量接到部分的二期发酵培养基中，再固态发酵产生固态种子，以1-15%接种量接到另外的二期发酵培养基中，进行12-48h二期发酵；进入连续生产阶段，种子为上次二期发酵的剩余固态菌剂，按1-20%接种量，接种二期发酵培养基上，这样循环利用。
4.根据权利要求1所述的微生物饲料，其特征是所述三期发酵培养基由二期发酵的固态菌剂再加1-40%米糠粕和1-30%豆粕组成，三期发酵培养基含水量为30-35%，首次启动三期发酵要制作乳酸菌和双歧杆菌液体种子液，乳酸菌和双歧杆菌活菌数之比为（1：1）～（1：4），乳酸菌和双歧杆菌液体种子液中的活菌总数为5×10-7 cfu/ml以上，以1-15%（重量）接种量接到三期发酵培养基中，搅拌充分后，装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵；发酵一个月后，以此成品为种子，按1-20%接种量，接到上述三期发酵培养基中，搅拌充分后，装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵，进入连续生产阶段。
5.根据权利要求2所述的微生态制剂，其特征是所述啤酒糟在潮湿状态下经过粉碎，大约20到100目左右。
6.根据权利要求1－5之一所述的微生态制剂，其特征是所述霉菌为：粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)，好食脉孢霉(Neurospora sitophila)，中间脉孢霉(Neurospora intermedia) 的任意一种或多种；酵母菌为：热带假丝酵母(Candida tropicalis)，产朊假丝酵母（Candida utilis），啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的任意一种或多种；双歧杆菌为：两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)；乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），干酪乳杆菌( Lactobacillus casei) 的任意一种或多种；芽孢杆菌为：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纳豆杆菌（Bacillus natto）的任意一种或多种。
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