CN114672437A - 一株产有机酸的枯草芽孢杆菌g-1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产有机酸的枯草芽孢杆菌G‑1及其应用。本发明从自然青贮3～5天的全株玉米中筛选到1株产有机酸能力较强的枯草芽孢杆菌G‑1，已进行生物保藏，保藏编号为CGMCC No.21706，该菌株在10℃、pH4.0、0.30％胆盐的条件下仍生长良好，可以产生乳酸和乙酸，且产酸速率高，对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌具有强的抑菌活性，同时对引起饲料变质的酵母菌和霉菌也具有较强的抑菌活性。

Description

一株产有机酸的枯草芽孢杆菌G-1及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产有机酸的枯草芽孢杆菌G-1及其应用。
背景技术
随着近年来畜牧业的快速发展，青贮饲料的应用也越来越广泛，同时对青贮饲料的质量要求也越来越高。为了促进青贮发酵，提高青贮饲料发酵品质与稳定性，往往需要加入一些青贮添加剂。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因其产酸、产抑菌物质等特点，对人畜无毒无害，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，故可将其作为青贮添加剂。同时因其具有生产容易、价格低廉、保存时间长、容易运输等特点，将其作为青贮添加剂还可以有效降低生产成本，减少损失。具有产酸能力的芽孢杆菌在青贮饲料发酵的过程中，能有效抑制不利微生物的生长，防止青贮饲料腐败变质，同时提高青贮饲料的有氧稳定性。
近年来，抗生素的滥用现象十分严重，滥用抗生素不仅会使细菌产生抗药性，畜禽机体免疫下降，引起畜禽内源性感染和二重感染，还会在畜产品和环境中造成残留。因此，筛选一株可以抑制病原菌生长，并且可以产酸的枯草芽孢杆菌至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产有机酸的枯草芽孢杆菌G-1及其应用，所述枯草芽孢杆菌G-1具有较高的产酸能力和抑菌效果，在青贮过程中添加该菌株，能够有效抑制不利微生物的生长，防止青贮饲料腐败变质，同时提高青贮饲料的有氧稳定性。
本发明提供了一株产有机酸的枯草芽孢杆菌G-1，所述枯草芽孢杆菌G-1已进行生物保藏，保藏编号为CGMCC No.21706。
优选的，所述有机酸包括乳酸和乙酸。
本发明还提供了上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-1在产有机酸方面的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-1在制备抑菌产品中的应用。
优选的，所述菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、酵母菌和霉菌中的一种或多种。
本发明还提供了上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-1在制备青贮饲料中的应用。
本发明还提供了一种青贮发酵剂，包括上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-1。
本发明还提供了一种青贮饲料，利用上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-1或所述的青贮发酵剂制得。
本发明还提供了一种产有机酸的方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-1接种至发酵培养基内，培养至OD600值为1.0～1.2，得发酵液；所述发酵液中含有所述有机酸；
每1L所述发酵培养基中包括如下组分：葡萄糖9.3～11.2g，酵母膏1.35～1.65g，蛋白胨0.45～0.55g，MgSO4 0.045～0.056g和CaCO3 5.3～6.7g。
优选的，所述发酵培养基的pH为7.2～7.4。
本发明提供了一株产有机酸的枯草芽孢杆菌G-1，已进行生物保藏，保藏编号为CGMCC No.21706。本发明从自然青贮3～5天的全株玉米中筛选到1株产有机酸能力较强的枯草芽孢杆菌G-1，该菌株可以产生乳酸和乙酸，且产酸速率高。该菌株在10℃、pH4.0、0.30％胆盐的条件下仍生长良好，对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌具有强的抑菌活性，同时对引起饲料变质的酵母菌和霉菌也具有较强的抑菌活性。实施例结果表明，添加枯草芽孢杆菌G-1的全株玉米相比未添加枯草芽孢杆菌G-1的全株玉米，乳酸的含量提高41.70％，乙酸的含量提高23.52％，有氧稳定性提高210h。本发明所述枯草芽孢杆菌G-1可作为青贮发酵启动及提高有氧稳定性的备选菌株。
生物保藏信息
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G-1，于2021年1月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21706。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为枯草芽孢杆菌G-1的系统进化树；
图2为枯草芽孢杆菌G-1产有机酸效果图；
图3为枯草芽孢杆菌G-1对大肠杆菌、沙门氏菌和痢疾杆菌的抑制效果；
图4为枯草芽孢杆菌G-1对酵母菌和霉菌的抑制效果。
具体实施方式
本发明提供了一株产有机酸的枯草芽孢杆菌G-1，所述枯草芽孢杆菌G-1已进行生物保藏，保藏编号为CGMCC No.21706。
本发明所述枯草芽孢杆菌G-1是从河北省保定市莲池区饲料厂的全株玉米、全株谷草、串叶松香草打包密封发酵3～5天的青贮料中分离得到，所述枯草芽孢杆菌G-1的16SrDNA序列优选如SEQ ID NO.1所示：5’-CGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGC-3’。
本发明所述枯草芽孢杆菌G-1在NA培养基上生长，菌落外形不规则，乳白色，不透明，有较小褶皱，中间微有褶皱凸起。革兰氏染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌。本发明所述枯草芽孢杆菌G-1芽孢染色显示有芽孢，厌氧生长(-)、V-P反应(+)、硝酸盐还原(+)、淀粉水解(+)、明胶液化(+)、利用丙酸盐(-)、D-甘露醇(+)、D-木糖(+)、L-阿拉伯糖(+)，最低耐受温度为10℃，最低耐受pH为4.0，最高耐受胆盐浓度为0.30％。
本发明实施例中，所述枯草芽孢杆菌G-1产生乳酸和乙酸，发酵24小时产乳酸的量为2553.65μg/mL、产乙酸的量为2871.98μg/mL；该菌株对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌具有强的抑菌活性，同时对引起饲料变质的酵母菌和霉菌也具有较强的抑菌活性。因此可将所述枯草芽孢杆菌G-1应用于生产有机酸和抑制病原菌。
根据本发明所述所述枯草芽孢杆菌G-1的生理生化特性，以下内容均应在本发明保护范围之内：枯草芽孢杆菌G-1在产有机酸方面的应用；枯草芽孢杆菌G-1在制备抑菌产品中的应用；枯草芽孢杆菌G-1在制备青贮饲料中的应用。
本发明还提供了一种青贮发酵剂，包括上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-1。本发明所述青贮发酵剂中，所述的枯草芽孢杆菌G-1的活菌总浓度优选为2.0～2.5×109CFU/mL。利用本发明所述的青贮发酵剂制备青贮饲料能有效抑制不利微生物的生长，防止青贮饲料腐败变质，同时提高青贮饲料的有氧稳定性。如实施例结果显示，添加枯草芽孢杆菌G-1的全株玉米相比未添加枯草芽孢杆菌G-1的全株玉米，乳酸的含量提高41.70％，乙酸的含量提高23.52％，有氧稳定性提高210h。
利用本发明所述枯草芽孢杆菌G-1或所述青贮发酵剂制得的青贮饲料也属于本发明的保护范围。
本发明在制备青贮饲料的过程中，优选按照0.5～1.0×109CFU/kg青贮原料的添加量将所述枯草芽孢杆菌G-1与青贮原料混合，进一步优选为1.0×109CFU/kg青贮原料，将混合料的水份控制在60％-70％之间，然后压实厌氧发酵。本发明所述青贮原料优选包括全株玉米。
本发明还提供了一种产有机酸的方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌G-1接种至发酵培养基内，培养至OD600值为1.0～1.2，得发酵液；所述发酵液中含有所述有机酸；
每1L所述发酵培养基中包括如下组分：葡萄糖9.3～11.2g，酵母膏1.35～1.65g，蛋白胨0.45～0.55g，MgSO4 0.045～0.056g和CaCO3 5.3～6.7g。
本发明将所述的枯草芽孢杆菌G-1接种至发酵培养基前，优选将枯草芽孢杆菌G-1接种到NA固体培养基上进行活化，得到活化后的枯草芽孢杆菌G-1。本发明对所述NA固体培养基的来源不做严格要求，可常规购买或者自行配制，优选的每1L所述NA固体培养基优选包括蛋白胨9.1～11.3g，牛肉膏2.7～3.3g，氯化钠4.4～5.5g和琼脂15.0～20.0g。
本发明优选将所述活化后的枯草芽孢杆菌G-1接种于种子培养基中，于37℃，150r/min培养至OD600值为0.4～0.6，得枯草芽孢杆菌G-1种子液。本发明进行所述接种时，所述枯草芽孢杆菌G-1的接种量优选为5.0wt.％～6.0wt.％。
在本发明中，每1L所述种子培养基优选包括葡萄糖5.4～6.6g，酵母膏0.8～1.2g，蛋白胨0.8～1.2g，MgSO4 0.045～0.055g和CaCO3 0.8～1.2g。
得枯草芽孢杆菌G-1种子液后，本发明优选以6％的接种量将枯草芽孢杆菌G-1种子液接种于发酵培养基中，得到含有有机酸的发酵液，优选接种至发酵培养基。本发明所述枯草芽孢杆菌G-1在10℃、pH4.0、0.30％胆盐的条件下仍生长良好，因此对培养的条件不做严格要求，保证枯草芽孢杆菌G-1正常生长至发酵液OD600值为1.0～1.2即可。
在本发明中，每1L所述发酵培养基中优选包括9.3～11.2g葡萄糖、1.35～1.65g酵母膏、0.45～0.55g蛋白胨、0.045～0.056gMgSO4和5.3～6.7gCaCO3；本发明所述的发酵培养基还可优选为MRS培养基，所述MRS培养基优选包括9.8～11.1g/L蛋白胨、9.9～11.2g/L牛肉膏、4.5～5.5g/L酵母膏、1.8～2.2g/L柠檬酸氢二铵、18.9～22.1g/L葡萄糖、0.9～1.1ml/L吐温80、4.5～5.6g/L乙酸钠、1.8～2.4g/L磷酸氢二钾、0.54～0.62g/L硫酸镁和0.20～0.32g/L硫酸锰。
得发酵液后，本发明优选对所述发酵液进行提取，得有机酸。本发明对所述提取的方式没有严格要求，采用常规方式将有机酸和其余发酵液组分分离即可，例如4℃、5000r/min离心10min。
在本发明一个实施例中，枯草芽孢杆菌G-1能够有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、酵母菌和霉菌，在大肠杆菌平板上产生1.05cm的抑菌圈、在沙门氏菌平板上产生1.13cm的抑菌圈、在痢疾杆菌平板上产生1.03cm抑菌圈，在酵母菌平板上产生0.85cm的抑菌圈、在霉菌平板上产生1.05cm抑菌圈。本发明含有有机酸的发酵液(即所述枯草芽孢杆菌G-1的发酵液)对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、酵母菌和霉菌均具有较强的拮抗作用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所用培养基如下：
NA固体培养基：蛋白胨9.1～11.3g，牛肉膏2.7～3.3g，氯化钠4.4～5.5g，琼脂15.0～20.0g，蒸馏水溶解至1000mL，pH7.2～7.4，121℃灭菌20分钟后使用；
种子培养基：葡萄糖5.4～6.6g，酵母膏0.8～1.2g，蛋白胨0.8～1.2g，MgSO40.045～0.055g，CaCO3 0.8～1.2g，蒸馏水溶解至1000mL，pH7.2～7.4，115℃灭菌30分钟后使用；
发酵培养基：葡萄糖9.3～11.2g，酵母膏1.35～1.65g，蛋白胨0.45～0.55g，MgSO40.045～0.056g和CaCO3 5.3～6.7g，115℃灭菌30分钟后使用。
MRS培养基：9.8～11.1g/L蛋白胨、9.9～11.2g/L牛肉膏、4.5～5.5g/L酵母膏、1.8～2.2g/L柠檬酸氢二铵、18.9～22.1g/L葡萄糖、0.9～1.1ml/L吐温80、4.5～5.6g/L乙酸钠、1.8～2.4g/L磷酸氢二钾、0.54～0.62g/L硫酸镁、0.20～0.32g/L硫酸锰，115℃灭菌30分钟后使用。
实施例1
1.1菌株的分离与纯化
采集河北省保定市莲池区饲料厂的全株玉米、全株谷草、串叶松香草打包密封发酵3～5d，取10g发酵后的样品，加入到100mL的无菌水中，置于37℃、150r/min摇床震荡1～2h，在从其中取出1mL加入无菌试管稀释后涂板置于37℃培养，得到分离菌株，最后将分离得到的的菌株进行纯化，得到纯化菌株。
1.2菌株G-1的鉴定
对上述分离纯化得到的菌株命名为G-1，涂布于NA培养基上进行菌落形态观察，该菌株在固态培养基上形成外形不规则，乳白色，不透明，有较小褶皱，中间微有褶皱凸起的菌落，革兰氏染色为紫色，是革兰氏阳性菌；芽孢染色显示有芽孢；厌氧生长(-)、V-P反应(+)、硝酸盐还原(+)、淀粉水解(+)、明胶液化(+)、利用丙酸盐(-)、D-甘露醇(+)、D-木糖(+)、L-阿拉伯糖(+)。
使用基因组提取试剂盒提取该菌株基因组DNA，并利用PCR技术测定16S rDNA基因序列全长为1500bp，具体如SEQ ID NO.1所示，通过使用Blast进行比对，根据GenBank提供的最高相似性序列构建如图1所示的系统发育树，结合生理生化特性，鉴定菌株G-1为枯草芽孢杆菌。
实施例2
2.1菌株G-1生长特性研究
将菌株G-1从斜面培养基接种到NA固体培养基上活化，将活化的单菌落接种于100mL种子培养基中，在37℃、150r/min条件下振荡培养6～12h；培养至OD600值为0.4～0.6，为菌株对数生长期，得种子液。
2.1.1不同温度对菌株G-1生长影响
将活化的菌株种子液以6.0％的接种量接入到发酵培养基中，各设3个重复，分别在10、15、20、25、30、35、40℃下培养，观察菌株的生长情况，结果见表1。
表1菌株G-1在不同温度条件下的生长特性
Figure BDA0003597482490000071
注：“-”不生长，“w”微弱生长，“+”生长，“++”生长较好，“+++”生长良好。
根据表1记载的内容可以看出，菌株G-1在25～40℃生长良好，在10℃生长较好，具有低温耐受性。
2.1.2不同pH对菌株G-1生长影响
把所用发酵培养基分别用HCl调至pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，将活化的菌株种子液以6.0％的接种量接入到相应pH培养基中，各设3个重复，置于37℃恒温培养箱培养24h后，观察菌株的生长情况，结果见表2。
表2菌株G-1在不同pH条件下的生长特性
Figure BDA0003597482490000072
注：“-”不生长，“w”微弱生长，“+”生长，“++”生长较好，“+++”生长良好。
根据表2记载的内容可以看出，菌株G-1在pH5.0～6.0生长良好，在pH4.0生长较好，在pH3.5微弱生长，具有良好的耐酸性。
2.1.3不同胆盐浓度对菌株G-1生长影响
配制含猪胆盐浓度分别为0.00％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％的发酵培养基，将活化的菌株种子液以6.0％的接种量接入到相应胆盐浓度的发酵培养基中，各设3个重复，置于37℃恒温培养箱培养24h后，观察菌株的生长情况，结果见表3。
表3菌株G-1在不同胆盐浓度下的生长特性
Figure BDA0003597482490000081
注：“-”不生长，“w”微弱生长，“+”生长，“++”生长较好，“+++”生长良好。
根据表3记载的内容可以看出，菌株G-1在0.30％的猪胆盐下生长较好，具有胆盐耐受性。
2.1.4菌株G-1产有机酸性能
(1)将种子液以6.0％的接种量接入到150mL发酵培养基的摇瓶中，各设3个重复，置于15℃、180r/min摇床上培养，分别于培养6、9、12、15、18、21、24h时各取500μL发酵液，4℃、8000r/min离心5min，取上清液加入到筛选平板(溴甲酚紫平板)打孔中，每个时间点的发酵液依次加到同一平板上，最后观察黄色圈的直径，结果如图2所示。
图2中间位置对应菌株G-1的24h发酵液，中间位置左侧从上到下依次为菌株G-1的6h发酵液、菌株G-1的9h发酵液和菌株G-1的12h发酵液、中间位置右侧从上到下依次为菌株G-1的21h发酵液、菌株G-1的18h发酵液和菌株G-1的15h发酵液。根据图2可以看出，菌株G-1在6h时产生黄色圈，直径为1.02cm，随时间增长，黄色圈平均直径逐渐变大，24h时黄色圈直径最大，直径为2.45cm，说明本发明菌株G-1具有较好产有机酸性能。
(2)在流动相配比是甲醇(V)：磷酸二氢钾水溶液(V)＝3：97，流速为0.6mL/min，室温，进样量20μL，波长为210nm的条件下，检测菌株G-1的24h发酵液得到的乳酸和乙酸的含量，检测结果如下表4。
表4菌株G-1不同时间发酵液乳酸和乙酸的含量
Figure BDA0003597482490000082
Figure BDA0003597482490000091
根据表4记载的内容可以看出，菌株G-1发酵24h后产乳酸的量为2553.65μg/mL，产乙酸的量为2871.98μg/mL，说明本发明菌株G-1具有较高的产有机酸性能。
2.1.5菌株G-1抑菌性能
(1)将菌株G-1种子液以6％的接种量接种于发酵培养基中，培养至稳定期，即此时OD600值为1.0～1.2，为发酵液。取发酵液500μL于离心管中，4℃、5000r/min下离心10min，上清液分别注入已打孔的大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella enterica)和痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)病原菌平板中，37℃下培养，观察其对各病原菌菌株的拮抗情况，结果如图3所示，从左到右依次为对大肠杆菌、沙门氏菌和痢疾杆菌的拮抗结果。
根据图3可以看出，菌株G-1对3种病原菌均产生抑制作用，在大肠杆菌平板上产生1.05cm的抑菌圈、在沙门氏菌平板上产生1.13cm的抑菌圈、在痢疾杆菌平板上产生1.03cm抑菌圈，本发明菌株G-1能抑制大肠杆菌、沙门氏菌和痢疾杆菌的生长。
(2)将菌株G-1种子液以6％的接种量接种于发酵培养基中，培养至稳定期，即此时OD600值为1.0～1.2，为发酵液。取发酵液500μL于离心管中，4℃、5000r/min下离心10min，上清液注入已打孔的酵母菌(Saccharomyces)、霉菌病原菌平板中，28℃下培养，观察其对各病原菌菌株的拮抗情况，结果如图4所示，从左到右依次为对酵母菌和霉菌的拮抗结果。
根据图4可以看出，菌株G-1对2种真菌病原菌均产生抑制作用。在酵母菌平板上产生0.85cm的抑菌圈、在霉菌平板上产生1.05cm抑菌圈，本发明菌株G-1能抑制酵母菌和霉菌的生长。
实施例3
菌株G-1对全株玉米青贮的影响
将河北农业大学实验农场种植的全株玉米(郑丹958)在蜡熟期进行刈割，运至河北省饲用微生物技术创新中心饲草加工基地，晾晒半天，用揉丝机进行粉碎。在粉碎的全株玉米中添加复合青贮菌剂，总含菌G-1量达到1.0×109CFU/kg(鲜重)，作为试验组(T)，使用30cm×40cm规格的塑料袋进行青贮，压实厌氧发酵45天。
对比例1
同实施例3，区别在于不添加菌株G-1，作为对照组(C)。
测试例1
检测实施例3和对比例1全株玉米青贮(厌氧发酵)45d后pH、有机酸含量和有氧稳定性，结果如下表5。
表5菌株G-1对全株玉米青贮的影响
Figure BDA0003597482490000101
根据表5记载的内容可以看出，添加枯草芽孢杆菌G-1的全株玉米相比未添加枯草芽孢杆菌G-1的全株玉米，乳酸的含量提高41.70％，乙酸的含量提高23.52％，有氧稳定性提高210h。本发明所述枯草芽孢杆菌G-1可作为青贮发酵启动及提高有氧稳定性的备选菌株。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 河北谷旺金莱生物科技有限公司
河北农业大学
<120> 一株产有机酸的枯草芽孢杆菌G-1及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1415
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggctggctc ctaaaaggtt acctcaccga cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga 60
cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120
agcgattcca gcttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag aacagatttg 180
tgggattggc ttaacctcgc ggtttcgctg ccctttgttc tgtccattgt agcacgtgtg 240
tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300
accggcagtc accttagagt gcccaactga atgctggcaa ctaagatcaa gggttgcgct 360
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420
tcactctgcc cccgaagggg acgtcctatc tctaggattg tcagaggatg tcaagacctg 480
gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 540
gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt 600
tagctgcagc actaaggggc ggaaaccccc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg 660
gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagttac 720
agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt tcctccacat ctctacgcat ttcaccgcta 780
cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac tcaagttccc cagtttccaa tgaccctccc 840
cggttgagcc gggggctttc acatcagact taagaaaccg cctgcgagcc ctttacgccc 900
aataattccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960
cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt accgccctat tcgaacggta cttgttcttc 1020
cctaacaaca gagctttacg atccgaaaac cttcatcact cacgcggcgt tgctccgtca 1080
gactttcgtc cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt 1140
ctcagtccca gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta cgcatcgttg ccttggtgag 1200
ccgttacctc accaactagc taatgcgccg cgggtccatc tgtaagtggt agccgaagcc 1260
accttttatg tttgaaccat gcggttcaaa caaccatccg gtattagccc cggtttcccg 1320
gagttatccc agtcttacag gcaggttacc cacgtgttac tcacccgtcc gccgctaaca 1380
tcagggagca agctcccatc tgtccgctcg actgc 1415

Claims (10)

1.一株产有机酸的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G-1，所述枯草芽孢杆菌G-1已进行生物保藏，保藏编号为CGMCC No.21706。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G-1，其特征在于，所述有机酸包括乳酸和乙酸。
3.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌G-1在产有机酸方面的应用。
4.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌G-1在制备抑菌产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、酵母菌和霉菌中的一种或多种。
6.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌G-1在制备青贮饲料中的应用。
7.一种青贮发酵剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌G-1。
8.一种青贮饲料，其特征在于，利用权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌G-1或权利要求所述的青贮发酵剂制得。
9.一种产有机酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌G-1接种至发酵培养基内，培养至OD600值为1.0～1.2，得发酵液；所述发酵液中含有所述有机酸；
每1L所述发酵培养基中包括如下组分：葡萄糖9.3～11.2g，酵母膏1.35～1.65g，蛋白胨0.45～0.55g，MgSO40.045～0.056g和CaCO35.3～6.7g。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH为7.2～7.4。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604741A (zh) * 2012-03-14 2012-07-25 东南大学 乳白香青挥发油的制备方法及其应用
CN103361296A (zh) * 2013-08-09 2013-10-23 天津大学 生产高纯度手性d-(-)-2,3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株及构建及应用
WO2015077752A1 (en) * 2013-11-25 2015-05-28 Genomatica, Inc. Methods for enhancing microbial production of specific length fatty alcohols in the presence of methanol
CN108251119A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 恩施硒图健康管理连锁有限公司 一种含枯草芽孢杆菌的土壤改良剂及其制备方法
CN109646340A (zh) * 2017-10-11 2019-04-19 谭友明 一种抗菌中草药提取液
CN109880754A (zh) * 2018-12-29 2019-06-14 广西康佳龙农牧集团有限公司 一种芽孢杆菌液发酵培养方法
CA3119639A1 (en) * 2018-11-13 2020-05-22 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Synergistic bacterial and yeast combinations
CN113549575A (zh) * 2021-07-20 2021-10-26 河北农业大学 一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌fm-20菌株及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604741A (zh) * 2012-03-14 2012-07-25 东南大学 乳白香青挥发油的制备方法及其应用
CN103361296A (zh) * 2013-08-09 2013-10-23 天津大学 生产高纯度手性d-(-)-2,3-丁二醇的枯草芽孢杆菌菌株及构建及应用
WO2015077752A1 (en) * 2013-11-25 2015-05-28 Genomatica, Inc. Methods for enhancing microbial production of specific length fatty alcohols in the presence of methanol
CN108251119A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 恩施硒图健康管理连锁有限公司 一种含枯草芽孢杆菌的土壤改良剂及其制备方法
CN109646340A (zh) * 2017-10-11 2019-04-19 谭友明 一种抗菌中草药提取液
CA3119639A1 (en) * 2018-11-13 2020-05-22 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Synergistic bacterial and yeast combinations
CN109880754A (zh) * 2018-12-29 2019-06-14 广西康佳龙农牧集团有限公司 一种芽孢杆菌液发酵培养方法
CN113549575A (zh) * 2021-07-20 2021-10-26 河北农业大学 一种高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌fm-20菌株及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIE KANG等: "Acetate Secretion Induces Bacteriocin Synthesis and Activates the Transcriptional Regulators rgg and rpoD", 《FERMENTATION》 *
RONGXUE SUN等: "Modeling the combined effect of temperature, pH, acetic and lactic acid concentrations on the growth/no growth interface of acid-tolerant Bacillus spores", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY》, pages 168 - 171 *
XIAOJUN GUO等: "Effect of Bacillus Additives on Fermentation Quality and Bacterial Community during the Ensiling Process of Whole-Plant Corn Silage", 《PROCESSES》 *
胡云云;高同国;张冬冬;李术娜;郭晓军;姜军坡;朱宝成;王灵敏;: "大豆根腐病拮抗菌枯草芽孢杆菌8-32抗菌物质性质的初步研究", 湖北农业科学, no. 04 *

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