CN106103697B - 速效乳杆菌菌株及其在改善青贮饲料的有氧稳定性方面的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于处理青贮饲料以增强有氧稳定性的方法，所述方法通过抑制选自酵母、霉菌和孢子形成细菌的微生物的生长提高青贮饲料的发酵和稳定性，并且允许较早的有氧暴露。所述方法包括用组合物处理青贮饲料或饲料，所述组合物包含布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)菌株LN7125、或短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株LB5328、或短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株LB7123、以及它们的混合物或突变体(所述突变体保留LN7125、LB5328、或LB7123的青贮饲料防腐活性)、或由它们产生的抗微生物组分。在本发明中公开的布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的所述菌株已经经纯化和分离，并且已经发现改善青贮饲料的有氧稳定性，允许比目前的操作更早的青贮后有氧暴露。

Description

速效乳杆菌菌株及其在改善青贮饲料的有氧稳定性方面的 用途
技术领域
本发明涉及处理动物饲料和保存青贮饲料以增强有氧稳定性的组合物和方法。
背景技术
青贮处理是一种湿草料保存的方法并且在全世界范围内使用。仅在西欧和美国每年储存的干物质中青贮饲料占超过2亿吨。该处理涉及天然发酵，其中乳酸菌使水溶性碳水化合物在无氧条件下发酵而形成有机酸。这引起pH降低，pH降低则可抑制有害微生物使得湿草料得以保存。
有氧不稳定性是青贮饲料生产中的主要问题。传统上，已经推荐使青贮饲料在饲喂前发酵至少三十(30)天以帮助提高青贮饲料的消化性。即使是在打开存储单元进行饲喂之前，青贮饲料可因为管理问题(即差的包装或密封)而暴露于氧气。在这些类型的有氧条件下，酵母和霉菌的快速生长引起青贮饲料发热和腐败，从而降低其营养价值。饲喂尚未进行正确发酵的作物可能降低干物质采食量(DMI)、减少产奶量、并且引起消化紊乱。充足的发酵时间产生更可口的和更易消化的饲料，具有最佳的DMI和产奶量。
即使是在已经经历传统上将被视为“好的”发酵(快速pH下降和低的终末pH)的接种青贮饲料中有氧不稳定性也可能是个问题。然而在这些条件下促成不稳定性的酵母生物可能是耐受酸性条件并且可代谢在发酵过程中由乳酸菌产生的乳酸的那些酵母。
有可能将化学和生物添加剂二者用于制备青贮饲料以尤其是在次优条件下促进充分的发酵模式。典型的化学添加剂最常见的是有机酸，并且生物添加剂包含细菌接种物和酶。细菌接种物优于化学添加剂，因为它们安全、易于使用、不腐蚀农用机械，它们不污染环境并且被认为是天然产物。
青贮饲料接种菌株的生产以及青贮处理是复杂的并且涉及多种化学和微生物过程的相互作用。甚至相同物种的不同菌株都不具有相同的性质并且它们的发酵和生产特性方面有差别。另外，不同的青贮饲料和不同的青贮方法体现了各种不同需求。在本领域一直需要改善的组合物和方法来改善青贮饲料的有氧稳定性并提高青贮动物饲料的生产效率。
本发明提供用作青贮饲料接种物的布氏乳杆菌(L.buchneri)和短乳杆菌(L.brevis)的新型菌株以及它们的优异组合。
发明内容
本发明的实施方案包括用作青贮饲料接种物的组合物，该组合物包含青贮饲料质保量的异型发酵乳酸菌菌种及其混合物或突变体、以及合适的载体。分离并纯化的异型发酵乳酸菌组合物改善青贮草料的有氧稳定性、提高青贮饲料的发酵和稳定性以允许较早的有氧暴露。此类组合物可包括但不限于具有专利保藏号NRRL B-50733的布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)菌株LN7125(在下文中为LN7125)或具有专利保藏号NRRL B-50731的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株LB5328(在下文中为LB5328)、或具有专利保藏号NRRL B-50732的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株LB7123(在下文中为LB7123)、以及它们的混合物或突变体(该突变体保留LN7125、LB5328、或LB7123的青贮饲料防腐活性)、以及载体。此类组合物可包含约101至约1011个活生物体/克青贮饲料湿重，任选地约102至约107个活生物体/克青贮饲料湿重，例如约103至约106个活生物体/克青贮饲料湿重。在该实施方案的组合物中的载体可为液体或固体，诸如但不限于碳酸钙、淀粉、和纤维素。
具体实施方式
下文将结合附表更详细地描述本发明，附表中只显示了本发明的一些实施方案，而非全部实施方案。实际上，这些发明可体现在本文示出的发明内容的不同修改形式和其它实施方案中，借助前文的描述和随附的附图中给出的教导内容，本发明所属领域的技术人员将会想到它们。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，并且旨在将修改形式和其它实施方案包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用，而并非用于限制目的。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的含义。与本文所述方法和材料类似的、经修饰的或等价的许多方法和材料可用于实践本发明的实施方案而无需过度实验，本文描述了优选的材料和方法。在对本发明的实施方案进行描述和要求进行权利保护时，如下术语将根据下面列出的定义使用。
单位、前缀和符号可以以其国际单位制(SI)接受的形式表示。在本说明书内叙述的数值范围包括限定该范围的数字并且包括所限定范围内的每个整数。
本文所用的冠词“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意指一个或多个要素。
如本文所用，“动物性能”是指肉、奶、蛋、子代或产品的收率。
如本文所用，“青贮”或“青贮的”是指一种厌氧发酵处理，其用于保存草料、未成熟的谷物作物、和用于饲料与生物燃料的其它生物质。在一些实施方案中，青贮处理包括使草料接触微生物接种物并在厌氧条件下储存该混合物的步骤。在某些实施方案中，青贮处理包括以排除空气的方式在厌氧条件下储存草料的步骤。已经用如本文其它部分所述的微生物接种物接种过的草料也以排除空气的方式堆积并储存。根据储存方式、压缩量、和储存期间预期的水分损失，草料的含水量可为约50％至约80％。青贮可发生在筒仓、青贮饲料堆、青贮饲料窖、青贮饲料捆、或适于所选植物材料青贮的任何其它方法中。带有本文其它部分所述的微生物接种物的植物材料可青贮适于在所需成熟阶段制备青贮饲料的任意长度的时间。在一些实施方案中，青贮发生约7天、约15天、约20天、约25天、约30天、约35天、约40天、约41天、约42天、约43天、约44天、约45天、约46天、约47天、约48天、约49天、约50天、约55天、约60天、约65天、约70天、约4个月、约8个月、约12个月、约18个月、或约24个月、或实施者认为合适的任意时间段。青贮处理可在任何环境温度下发生，例如在0-45℃的环境温度下。然而，青贮植物材料的温度可升至高于45℃。成熟的青贮饲料可用于动物饲料、冷冻并储存以待后用、或加到沼气发生器中以生产沼气。
如本文所用，“功能突变体”是指通过对参考菌株的基因修饰或利用参考菌株直接或间接获得的细菌菌株，并且其保留至少50％的参考菌株活性。基因修饰可通过任何方法实现，诸如但不限于化学诱变、电离辐射、基于转座的诱变、或经由利用参考菌株作为遗传物质受体或供体的接合、转导、或转化。
如本文所用，术语“异型发酵乳酸菌菌种”应理解为包括但不限于明串珠菌属(leuconostocs)、一些乳杆菌、酒球菌属(oenococci)、和魏斯氏菌属(weissella)菌种。异型发酵菌产生乳酸、乙醇、乙酸和二氧化碳，其比例取决于可利用的底物。
如本文所用，术语“同型发酵乳酸菌菌种”应理解为包括但不限于一些乳杆菌和通过Embden-Meyerhof(E-M)途径发酵己糖的肠球菌属(enterococci)、乳球菌属(lactococci)、片球菌属(pediococci)、链球菌属(streptococci)、四联球菌属(tetragenococci)、和漫游球菌属(vagococci)中的大多数菌种。同型发酵是指乳酸是主要代谢物，不产生二氧化碳。对于每个六碳糖分子，同型发酵乳酸菌将产生两分子乳酸。
如本文所用，“分离的”意指从天然来源，包括但不限于从未接种的青贮饲料或其它植物材料去除。
如本文所用，“微生物接种物”是指包含至少一种细菌培养物和合适载体的组合物。“组合微生物接种物”包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、或更多种细菌培养物和合适载体。细菌培养物包含至少一种细菌菌株并且可包含多种细菌菌株，包括例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、或更多种细菌菌株。可用于本文所公开的方法和组合物的细菌培养物包括但不限于LN7125、LB5328、或LB7123。
如本文所用，“青贮前植物材料”包括但不限于在发酵之前的草、玉米、苜蓿、小麦、黑麦草、谷类、油料种子、高粱、向日葵、大麦、以及它们的混合物。所有以上植物材料可用本发明实施方案的接种物成功处理。本发明实施方案的接种物也可用于处理高水分玉米(HMC)。
如本文所用，“油料种子”包括但不限于向日葵、卡诺拉、大豆、以及它们的混合物。
如本文所用，“纯化的”意指细菌菌种或菌株实质上与该菌株从其分离的来源中存在的酵母、霉菌、和/或其它细菌菌种或菌株分离，并且相对于这些物质富集。
如本文所用，术语“青贮饲料”旨在包括所有类型的发酵农产品，包括但不限于草青贮饲料、苜蓿青贮饲料、小麦青贮饲料、豆类青贮饲料、向日葵青贮饲料、大麦青贮饲料、全株玉米青贮饲料(WPCS)、高粱青贮饲料、发酵的谷物和草混合物等等。
如本文所用，术语“(一种或多种)菌株”应理解为包括但不限于本文所公开的各种细菌菌株的任何突变体或衍生物，例如布氏乳杆菌(L.buchneri)菌株LN7125(专利保藏号NRRL B-50733)、或短乳杆菌(L.brevis)菌株LB5328(专利保藏号NRRL B-50731)、或短乳杆菌(L.brevis)菌株LB7123(专利保藏号NRRL B-50732)，其保留如本文所公开的方法和实施例所述并定义的改善草料有氧稳定性的功能活性。
已经分离并纯化了多种微生物，它们改善青贮草料的有氧稳定性、提高青贮饲料的发酵和稳定性以允许较早的有氧暴露。菌种布氏乳杆菌(L.buchneri)或短乳杆菌(L.brevis)的特定菌株已经显示不仅通过降低乳酸含量而且还通过产生对有助于引起青贮饲料的有氧不稳定性的微生物抑制的物质而增加青贮饲料的有氧稳定性。不受理论的束缚，可能是代谢物的组合是这种效果的原因。此外，布氏乳杆菌(L.buchneri)或短乳杆菌(L.brevis)的代谢据信产生乙酸和丙酸两者，这二者均已知抑制酵母和霉菌的生长。
青贮草料的主要目标是为了保存作物中最大量的初始干物质、营养物质和能量，随后用于饲喂。该处理的特征可在于四个青贮饲料发酵的一般阶段。
密封于储存单元中时，第一个阶段为有氧的，这时氧气仍存在于植物颗粒之间并且pH为6.0至6.5。这些条件允许继续的植物呼吸、蛋白酶活性和需氧和兼性需氧微生物的活性。
第二个阶段是发酵，在青贮饲料变为无氧后其持续数天至数周。乳酸菌生长并且成为主要的微生物群体，由此产生乳酸和其它有机酸，从而将pH降低至3.8至5.0。
第三个阶段是稳定的，只要防止空气进入储存单元草料的特性就发生很少变化。
最后的阶段为饲料移出，这时青贮饲料最终被卸出并暴露于空气。这导致可引起腐败的需氧微生物(主要是酵母、霉菌、杆菌和醋酸菌)重新活化。
可用于帮助预防该情况的管理技术包括但不限于在青贮处理过程中小心将青贮饲料包好、压实、密封、快速填充、管理朝向以及小心移出青贮饲料来饲喂以使剩余的青贮饲料的曝气最少。
青贮饲料对有氧变质的易感性由物理、化学、和微生物因素决定。管理(压实、卸出速率)很大程度上影响氧气进入青贮饲料的运动。在饲喂期间，空气可能渗入到青贮饲料表面后最多1米处，使得暴露于氧气的时间延长。发酵酸和pH抑制微生物的生长速率，但是腐败速率也受到微生物数量和好氧微生物在可利用底物上的生长速率的影响。
乳酸菌(LAB)在生长的植物上作为正常微生物区系的一部分而存在。根据它们的初级代谢最终产物，LAB可归类为两种类型之一：同型发酵，其从葡萄糖代谢中仅产生乳酸，以及异型发酵，其产生乳酸、乙醇、乙酸和CO2。这些类型的发生率在类型与数量、不同作物之间以及不同位置之间具有相当大的可变性。
主要含有同型发酵乳酸菌的青贮饲料接种物已成为世界许多部分的主流添加剂。它们的功能是促进作物的水溶性碳水化合物的快速有效的利用，导致大量产生乳酸和pH快速降低，从而最小化干物质损失。接种物也可改善动物性能。然而，同型发酵接种物常常对有氧稳定性具有负面效应，这是由于保存有对于腐败生物容易利用的底物。
接种物中的异型发酵乳酸菌的理念已获得了最近的欢迎。该想法是增加的不解离挥发性脂肪酸诸如乙酸的水平可抑制引发有氧变质的其它微生物。异型发酵菌产生乳酸、乙醇、乙酸和二氧化碳，其比例取决于可利用的底物。产生的乙酸可抑制青贮饲料中的有害生物体。另外，异型发酵菌如布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)能够在厌氧条件下将乳酸代谢成乙酸和1，2丙二醇。利用此类机制，六分之一的碳在葡萄糖发酵期间损失成二氧化碳，并且三分之一的乳酸碳在厌氧转化期间损失成乙酸。然而，1％或者最多2％的干物质的少量损失容易地抵消由有氧微生物的腐败作用引起的大得多的损失。对异型发酵乳酸菌的担忧包括但不限于对动物性能的影响以及可用于该程序的适当菌株的鉴别。甚至相同物种的不同菌株都不具有相同的性质并且它们的发酵特性方面有差别。
Nilson(Arch Microbiol.(1956)24：396-411)发现青贮饲料中的主要LAB为链球菌(Streptococci)和乳杆菌(Lactobacilli)，并且植物乳杆菌(L.plantarum)是最常见的菌种。Gibson等人(J.Gen.Micro.(1958)24：60-70)报道了植物乳杆菌(L.plantarum)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)是同型发酵菌群中的主要菌种。Beck(LandwirtschaftlicheForschung.(1972)27：55-63)表明甚至在其中附生菌群主要是异型发酵LAB的草青贮饲料中，在四天的青贮处理后，85％的存在生物体是同型发酵菌。Langston等人(USDATechnical Bulletin No.1187(1958))已经表明在成熟青贮饲料中的69％的分离物是同型发酵菌。有时注意到在成熟青贮饲料中朝着异型发酵LAB的偏移，这归因于它们对低pH和高乙酸浓度的耐受性。Szigeti(Acta Almentaria.(1979)8：25-40)发现在极低pH下的LAB菌群主要由植物乳杆菌(L.plantarum)和短乳杆菌(L.brevis)构成。Grazia和Suzzi(J.Appl.Bacteriol.(1984)56：373-379)已经表明在异型发酵LAB中观察到对pH3.6的强敏感性。
对青贮饲料处理和接种物利用的回顾可见于Weinberg，ZNG.和Muck，RE.(1996)FMS Microbiology Rev.19：53-68，Wilkinson，J.M.和Davies，D.R.(2012)Grass andForage Science 68：1-19，以及Muck，Richard E.(2013)Agricultural and Food Science22：3-15中，其公开内容以引用方式并入本文。
在本发明的实施方案中，对导致腐败的生物体的抑制通过用生物体处理青贮饲料来完成，该生物体是布氏乳杆菌(L.buchneri)或短乳杆菌(L.brevis)菌种、尤其是菌株LN7125、LB5328、或LB7123或者包含LN7125、LB5328、或LB7123的组合物、或者紧密相关的生物体，以及通过用LN7125、LB5328、或LB7123以及包含它们的组合物的有效突变体或等同物处理青贮饲料来完成。
本发明的一个实施方案是包含乳杆菌菌种的微生物接种物，其将改变青贮饲料的发酵并提高其稳定性以允许比目前的操作更早的青贮后有氧暴露。当前的工业标准推荐接种过的青贮饲料在厌氧条件下保持最少三十(30)天并且优选六十(60)天以实现接种物能够保持并提高储存草料的有氧稳定性的最大有益效果。生产者经常不能使他们的青贮饲料在密封状态下保持推荐的时长，这是由于他们用于饲喂的可用青贮饲料的个体限制。本发明的一个实施方案为在密封的青贮饲料结构中的厌氧发酵设置少于三十(30)天的目标，其中带有具有或不具有乳酸菌(LAB)组合的乳杆菌菌株。密封的青贮饲料结构可具有至少29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、或7天的厌氧发酵目标时长。
本发明的一个实施方案是具有专利保藏号NRRL B-50733的布氏乳杆菌(L.buchneri)菌株LN7125、或具有专利保藏号NRRL B-50731的短乳杆菌(L.brevis)菌株LB5328、或具有专利保藏号NRRL B-50732的短乳杆菌(L.brevis)菌株LB7123的生物纯培养物。
该实施方案的一个方法是处理动物饲料或青贮饲料的方法，该方法包括将包含LN7125、LB5328、或LB7123的青贮饲料接种物以约1×103至1×106CFU/g饲料或青贮饲料施用于饲料或青贮饲料。另外，该实施方案的另一个方法是改善动物性能的方法，该方法包括给动物饲喂已经用如其它实施方案所述的青贮饲料接种物接种过的动物饲料。
另一个实施方案是青贮饲料接种物，其包含同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌的活培养物，参见例如美国专利6,403,084。另外的实施方案包括包含这种青贮饲料接种物的动物饲料或青贮饲料。
本发明的实施方案包括通过抑制选自酵母、霉菌和孢子形成细菌的腐败生物体在其上的生长来处理青贮饲料的方法，该方法包括：向青贮饲料加入腐败生物体抑制量的该实施方案组合物。用该实施方案的方法处理的青贮饲料可由多个植物来源制成，包括但不限于草、玉米、苜蓿、小麦、黑麦草、谷类、油料种子、高粱、向日葵和大麦。该实施方案的组合物也可在储存时被加入青贮饲料。青贮饲料可通过多种途径进行青贮，包括以捆、袋、青贮坑、桶状青贮塔、或堆的形式青贮。使用该实施方案的组合物处理青贮饲料的方法包括向青贮饲料加入青贮饲料质保量的LN7125、LB5328、或LB7123。
本发明的实施方案还包括青贮饲料，其包含青贮饲料质保量的LN7125、LB5328、或LB7123或它们青贮饲料质保量的突变体。
在该实施方案中包括的青贮饲料提供用本发明的青贮饲料接种物处理用于动物饲料的青贮饲料、以及经处理的动物饲料或青贮饲料自身的方法。动物饲料或青贮饲料将常常是全株玉米青贮饲料(WPCS)或高水分玉米(HMC)。该实施方案也提供通过饲喂接种过的青贮饲料改善动物性能的方法。也包括含有本发明的青贮饲料接种物的容器和载体。
本发明的实施方案是用于改善青贮饲料的有氧稳定性、同时也通过饲喂有效量的青贮饲料促进动物体内的植物纤维消化的方法，该青贮饲料已经用LN7125、LB5328、或LB7123与产生阿魏酸酯酶的细菌菌株或其功能突变体的组合以及合适载体接种过。利用此类产生阿魏酸酯酶的菌株的方法公开在美国专利7,799,551中，其以引用方式并入本文。该阿魏酸酯酶菌株可为例如乳杆菌菌株或其功能突变体，诸如选自布氏乳杆菌(L.buchneri)、植物乳杆菌(L.plantarum)、短乳杆菌(L.brevis)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、消化乳杆菌(L.alimentarius)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、和类消化乳杆菌(L.paralimentarius)的乳杆菌菌株。此类菌株可包括例如选自布氏乳杆菌(L.buchneri)菌株LN4017(专利保藏号PTA-6138)、植物乳杆菌(L.plantarum)菌株LP678(专利保藏号PTA-6134)、植物乳杆菌(L.plantarum)菌株LP3710(专利保藏号PTA-6136)、植物乳杆菌(L.plantarum)菌株LP3779(专利保藏号PTA-6137)、植物乳杆菌(L.plantarum)菌株LP7109(专利保藏号PTA-6139)、短乳杆菌(L.brevis)菌株LB1154(专利保藏号NRRL B-30865)、布氏乳杆菌(L.buchneri)菌株LN4888(专利保藏号NRRL B-30866)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)菌株LR4933(专利保藏号NRRL B-30867)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)LI2127(专利保藏号NRRL B-30868)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)菌株LI2350(专利保藏号NRRL B-30869)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)菌株L12366(专利保藏号NRRL B-30870)、乳杆菌未知菌种菌株UL3050(专利保藏号NRRL B-30871)、以及它们的混合物(参见美国专利7,799,551)的那些。此类组合物可包括约101至约1010个细菌菌株或其功能突变体的活生物体/克青贮前植物材料。任选地，它们可包括约102至约107个细菌菌株或其功能突变体的活生物体，例如约103至约106个细菌菌株或其功能突变体的活生物体/克青贮前植物材料。
饲喂给动物的组合物可用有效催化量的产生阿魏酸酯酶的细菌菌株或其功能突变体进行处理，该有效催化量是可容易地由畜牧领域的技术人员确定的。受益于本发明的实施方案的动物是哺乳动物和鸟类，包括但不限于反刍动物、马、牛、猪、山羊、绵羊和禽类物种例如家禽。
用于本发明的实施方案的组合物可为液体形式或干燥形式，并且可包含另外的细菌菌株。处于固体处理形式的组合物可包含混合细菌培养物，其包含LN7125、LB5328、或LB7123以及载体。
载体可为含水或不含水的液体或固体的性质。固体形式的组合物可包含固体载体、固体稀释剂或物理填料。此类固体载体、固体稀释剂或物理填料的示例包括麦芽糖糊精、淀粉、碳酸钙、纤维素、乳清、玉米芯粉、和二氧化硅。液体载体可为溶液，非限制地为可乳油、悬浮液、乳液(包括微乳液和/或悬乳剂)等形式，可任选地将其增稠为凝胶剂。简而言之，载体可为有机或无机物理填料。固体组合物可以轻粉尘的形式直接施用于草料，或者如果它分散在液体载体中，可成功地将其喷洒在草料上。
本领域普通技术人员将了解其它合适的载体和剂型，或将能够使用惯常的实验确定这些。另外，可用本领域普通技术人员通用的标准技术进行各种组合物的施用。
本发明的另一个实施方案是LN7125、LB5328、或LB7123与其它特定细菌菌种以合适比率的组合，用于提高青贮饲料或动物饲料的发酵和稳定性，以及增强青贮饲料或饲料在暴露于空气时的有氧稳定性以允许早期的有氧暴露。青贮饲料接种物可为至少一种同型发酵乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的活菌株与异型发酵细菌LN7125、LB5328、或LB7123的分离纯化组合。在一些实施方案中，青贮饲料接种物将包含至少2至10种同型发酵菌和/或异型发酵菌的菌株。示例性的植物乳杆菌(L.plantarum)菌株包括LP286、LP287、LP329、LP346、LP347、或它们的功能突变体中的至少一种(参见例如美国专利6,403,084)。示例性的布氏乳杆菌(L.buchneri)菌株(其可与LN7125、LB5328、或LB7123组合)包括LN1391、LN4637、LN4750、或它们的功能突变体。青贮饲料接种物任选地包含至少一种屎肠球菌(Enterococcus faecium)的活菌株，诸如但不限于菌株EF301、EF202、或它们的功能突变体。接种物中的活体同型发酵细菌和异型发酵细菌的数量以约1∶5至约1∶15的比率存在。在一些实施方案中，比率为约：1∶6至1∶14、1∶7至1∶13、1∶8至1∶12、1∶9至1∶11、或1∶10。
使用混合的培养物来改善青贮饲料的发酵或有氧稳定性的方法公开于美国专利6,403,084中，该专利以引用方式并入本文。
本发明的实施方案是用作青贮饲料接种物的组合物，其包含LN7125、LB5328、或LB7123或它们的功能突变体以及合适载体。在本发明的一个实施方案中，组合物含有约101至约1010个细菌菌株或其功能突变体的活生物体/克青贮前植物材料。在本发明的另一个实施方案中，组合物含有约102至约107个细菌菌株或其功能突变体的活生物体/克青贮前植物材料。在另一个实施方案中，组合物含有约103至约106个细菌菌株或其功能突变体的活生物体/克青贮前植物材料。
根据本发明的方法适于青贮或储存的材料为任何易于有氧条件下腐败的材料。该材料将通常包含按重量计至少25％的干物质。此类材料包括但不限于裸麦或传统的草、玉米(包括高水分玉米)、全株玉米、苜蓿、小麦、豆类、谷类、油料种子、高粱、向日葵、大麦或其它全株谷类作物。青贮饲料储存管理包括但不限于捆(尤其易发生有氧腐败的形式)、限氧袋、青贮坑、竖式桶状青贮塔、限氧筒仓、袋、堆、或任何其它储存形式(可易于发生有氧腐败的形式)。
与本发明相关联的活性可存在于布氏乳杆菌(L.buchneri)的其它菌株中、乳杆菌的其它菌种中，例如高加索乳杆菌(L.kefir)、类高加索乳杆菌(L.parakefir)和类布氏乳杆菌(L.parabuchneri)、短乳杆菌(L.brevis)、清酒乳杆菌(L.sake)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、同型发酵乳酸菌的其它菌种，并且可能也存在于其它菌属中。这可基于本文信息，通过常规实验确定。
如本文所用，术语“(一种或多种)菌株”应理解为包括本文所公开的各种细菌菌株的任何突变体或衍生物，例如布氏乳杆菌(L.buchneri)菌株LN7125(专利保藏号NRRL B-50733)、或短乳杆菌(L.brevis)菌株LB5328(专利保藏号NRRL B-50731)、或短乳杆菌(L.brevis)菌株LB7123(专利保藏号NRRL B-50732)，其保留如本文所公开的方法和实施例所述并定义的改善草料有氧稳定性的功能活性。
该实施方案的LN7125、LB5328、或LB7123微生物纯化并分离自玉米或饲喂玉米的绵羊的粪便。在多次实验后，从一组分离物的测试中将其发现。
在纯化并分离特定菌株后，进行分类学研究以鉴定菌株。将其鉴定为布氏乳杆菌(L.buchneri)或短乳杆菌(L.brevis)并给予原型编号LN7125、LB5328、或LB7123。根据本发明，这些菌株、包含这些菌株的组合物、或由这些菌株产生的因子，用于处理草料材料。
本发明的实施方案在以下实施例中进一步限定。应当理解，这些实施例虽然表明了本发明的某些实施方案，但仅以举例说明的方式给出。通过以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的实质和范围的情况下，可对本发明的实施方案作出各种改变和修改以使之适应各种用法和条件。因此，除了本文显示和描述的那些实施方案之外，本发明实施方案的各种修改形式将因前面的描述而对本领域技术人员是显而易见的。此类修改形式也旨在落入所附权利要求的范围内。
本文列出的每个参考文献的公开内容以引用方式全文并入本文。
保藏物
布氏乳杆菌(L.buchneri)菌株LN7125、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株LB5328和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)菌株LB7123于2012年3月14日按布达佩斯条约规定保藏于美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service(ARS)CultureCollection)，该保藏中心在美国国家农业应用研究中心(National Center forAgricultural Utilization Research(NCAUR))的微生物遗传学和生物加工研究组(Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit)。分别给予菌株专利保藏号NRRL B-50733、专利保藏号NRRL B-50731、和专利保藏号NRRL B-50732。NCAUR的地址为1815N.University Street，Peoria，IL，61604。一旦专利授权，该保藏物将不可撤回地和无限制或者无条件地可供公众获取。但是，应当理解，保藏物的可获取性不构成许可在损害政府所授予的专利权的情况下实施本发明。
申请人将满足37C.F.R.§§1.801-1.809的全部要求，包括提供样品在进行保藏时有活力的指示。每种保藏物将不受限制地在作为一家公共保藏单位的NRRL保藏单位维持30年时间，或在最近请求后5年，或持续至本专利的有效期限，选其长者，并且如果在这个时间期间它变得无活力的话将予以更换。一旦专利授权，该保藏物将不可撤回地和无限制或者无条件地可供公众获取。但是，应当理解，保藏物的可获取性不构成许可在损害政府法令所授予的专利权的情况下实施本发明。
本说明书中提到的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出以引用方式并入本文一样。
虽然为了理解清晰目的已经通过举例说明和实施例方式较详细地描述了本发明，但显然可以在所附权利要求书的范围内实施一些改变和修改。
实施例
实施例1：用于改善玉米青贮饲料的有氧稳定性的速效乳杆菌菌株
进行研究以开发包含乳杆菌菌种的微生物接种物，其能够提高全株玉米青贮饲料的发酵和稳定性以允许在青贮后不到三十(30)天时提早打开(有氧暴露)。
菌株选择：
取自Pioneer Hi-Bred的微生物培养物保藏中心的异型发酵乳酸菌培养物(252个分离物)在如制造商所述制备的De Man Rogosa Sharpe液体培养基(MRS液体培养基；DifcoTM Lactobacilli MRS；Becton Dickinson and Company，Sparks，MD 21152 USA)中生长24至48小时。将细胞悬浮液的等分试样转移到全株玉米草料液体培养基(干玉米草料粉在水中的1∶10混合物，经高压消毒，用0.2微米的过滤器除菌，然后加入0.5％的葡萄糖)的提取物中并在37℃下生长40小时。
在初始的筛选处理后，选择五个分离物用于在2011年的田间测试以评估它们增强青贮全株玉米草料的有氧稳定性的能力。从玉米或玉米饲喂的绵羊粪便中发现并鉴定菌株，样品在美国采集。在2012年，在全株玉米中与商业同型发酵菌株LP286和LP329的组合重复三个分离物。
田间测试：
测试菌株特性：
Figure BDA0001110226600000141
田间测试：
2011年玉米收获：在2011年9月1日，在Livestock Nutrition Center InSheldahl，IA分别收获全株玉米草料的三个杂交体(P1162、33M16、DeKalb 61669vt3)，干物质范围为33％-37％。
2012年玉米收获：在2012年9月21日，在Livestock Nutrition Center InSheldahl，IA分别收获全株玉米草料的三个杂交体(P90115XR、P1162XR、P1395XR)，干物质范围为33％-37％。
2011年玉米青贮饲料处理：
Figure BDA0001110226600000142
2012年玉米青贮饲料处理：
Figure BDA0001110226600000151
接种：
在2011年，培养各个实验测试菌株并将其以新生培养物形式供应。在2012年，培养各个实验测试菌株并在室内冻干，将其以干粉培养物形式供应。将商业和实验冻干产物悬浮在水中，随后将所有处理物调节至4.54×107的标准浓度。利用10-cc注射器，以1.0ml/lb草料的速率施用处理物悬浮液。所有处理物的施用剂量为1×105CFU/g草料。
筒仓：
PVC筒仓填充有160kg DM/m3的全株玉米草料并如下所述基于打开日注入空气24小时。
Figure BDA0001110226600000152
有氧稳定性：Honig的方法(Proc.Of the Eurobac.Conf.，P.Lingvall和S.Lindgren(ed.)(1986年8月12-16日)Swed.Univ.of Agric.Sci.Grass and ForageReport No.3-1990.第76-81页，Uppsala，Sweden.)用于测量有氧稳定性。如Honig所述，有氧干物质损失(DML)根据暴露于空气后的温度上升进行估计。
结果和讨论
有氧稳定性
用异型发酵乳杆菌处理减少有氧干物质损失并增加加热时间。随时间推移，在菌株之间观察到差异。
2011-玉米青贮饲料(表1)
在第7天和第14天打开导致在处理物LB5328、LB7123和LN7125与未接种的对照青贮饲料(其保持至第60天，此时观察到数量效应)之间的统计学差异。
当在较早的打开时间进行评估时，用LB5328、LB7123和LN7125处理与当前的商业接种物(11A44、11C33和11CFT)相比也产生统计学改善。这三个菌株与其它选择的异型发酵菌株(LB31和LB4616)相比显示明显的改善。
当在30天前(第7天和第14天)打开时，从这些研究中选择的两种短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(LB7123&LB5328)和一种布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)(LN7125)在改善全株玉米青贮饲料的有氧稳定性方面是有效的。注意到与对照和低效菌株相比的明显差异。三个菌株进一步包括在2012年的全株玉米青贮饲料试验中以进行单独测试以及与当前的商业同型发酵菌株LP286和LP329的组合测试。
2012-玉米青贮饲料(表2)
在第7天和第14天打开导致在单个菌株处理物LB7123和未接种的对照青贮饲料之间的生物和统计学差异。LB7123和对照之间在第28&60天的差异在数字上更好，但是在统计学意义上并非如此。
LB5328+、LB7123+、和LN7125+的组合处理物在第7天和第14天有持续阳性响应的趋势。第7天打开导致有氧DML与对照相比的数字改善，而在第14天组合处理物相比于对照显著更好。所有三种组合处理物保持相比于对照的改善(30％-40％)。观察到11A44和11CFT的有氧干物质损失的相似改善。
商业产品在第7、14或28天似乎未有效改善DML；然而，11A44和11CFT对在第60天的有氧稳定性具有正面影响，这在以前的研究试验中观察到。
2011&2012组合玉米青贮饲料研究-(表3)
一般来讲，经两年的全株玉米青贮饲料试验(6个研究，24个筒仓/tmt)，在28天前打开时单菌株处理物LB5328、LB7123和LN7125在减少有氧干物质损失方面与未接种的对照青贮饲料和当前的商业产品相比相当。
处理物LB7123和LN7125在第7天和第14天相比于对照和商业处理物在统计学意义上更好。LN7123、LN7125和LN7125在第14天也展示与对照的统计学差异。到第28&60天，这三种单菌株处理物相比于对照在数字上更好，并且显示与商业产品11A44、11C33和11CFT相当的有氧稳定性。
总结
因为由这些菌株和与同型发酵菌的组合减少了有氧干物质损失，在早期打开青贮全株草料时观察到可重复的干物质损失改善，为使用特定选择的布氏乳杆菌(L.buchneri)或短乳杆菌(L.brevis)接种物的生产者提供经济上的优势。
表1：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)对青贮不同时长的全株玉米青贮饲料在暴露于空气时的干物质损失的效应。
Figure BDA0001110226600000171
表2：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis) 和与同型发酵菌的组合对青贮不同时长的全株玉米青贮饲料在暴露于空气时的干物质损 失的效应。
Figure BDA0001110226600000172
Figure BDA0001110226600000181
表3：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)对青贮不同时长的全株玉米青贮饲料在暴露于空气时的干物质损失的效应。
Figure BDA0001110226600000182
实施例2：用于改善草青贮饲料的有氧稳定性的速效乳杆菌菌株
菌株选择：
取自Pioneer Hi-Bred的微生物培养物保藏中心的异型发酵乳酸菌培养物(252个分离物)在如制造商所述制备的De Man Rogosa Sharpe液体培养基(MRS液体培养基；DifcoTM Lactobacilli MRS；Becton Dickinson and Company，Sparks，MD 21152USA)中生长24至48小时。将细胞悬浮液的等分试样转移到全株玉米草料液体培养基(干玉米草料粉在水中的1∶10混合物，经高压消毒，用0.2微米的过滤器除菌，然后加入0.5％的葡萄糖)的提取物中并在37℃下生长40小时。
从玉米或玉米饲喂的绵羊粪便中发现并鉴定菌株，样品在美国采集。在2012年测试欧洲黑麦草中的三个分离物，并且在2013年仅测试两个分离物，它们以单菌株和与当前的商业同型发酵菌株LP286和LP329的组合形式进行测试。
实验测试菌株特性：
Figure BDA0001110226600000191
田间测试：
2012年草收获：在2012年5月22、23、&24日，在Buxtehude(Germany)周边收获欧洲黑麦草，其干物质范围为33％-49％。
2013年草收获：在2013年6月3、4&6日，在Buxtehude(Germany)周边收获欧洲黑麦草，其干物质范围为36％-46％。
2012年欧洲黑麦草青贮饲料处理物：
Figure BDA0001110226600000192
2013年欧洲黑麦草青贮饲料处理物：
Figure BDA0001110226600000193
接种：
在2012&2013年，培养各个实验测试菌株并在室内冻干，将其以干粉培养物形式供应。将商业和实验冻干产物悬浮在水中，随后将所有处理物调节至4.54×107的标准浓度。利用10-cc注射器，以1.0ml/lb草料的速率施用处理物悬浮液。所有处理物的施用剂量为1×105CFU/g草料。
筒仓：
PVC筒仓填充有100kg DM/m3的草并如下所述基于打开日注入空气24小时。
Figure BDA0001110226600000201
有氧稳定性：Honig的方法(Proc.Of the Eurobac.Conf.，P.Lingvall和S.Lindgren(ed.)(1986年8月12-16日)Swed.Univ.of Agric.Sci.Grass and ForageReport No.3-1990.第76-81页，Uppsala，Sweden.)用于测量有氧稳定性。如Honig所述，有氧干物质损失(DML)根据暴露于空气后的温度上升进行估计。
结果和讨论：
有氧稳定性
用异型发酵乳杆菌处理减少有氧干物质损失并增加加热时间。随时间推移，在菌株之间观察到差异。
2012-草青贮饲料(表1)
在第14、28和60天打开草筒仓导致在单菌株处理物LB5328、LB7123和LN7125与未接种的对照青贮饲料之间的差异。这三种处理物在第7、14或28天相对于对照和商业产品在数字上更好。
商业产品在第7天或第14天似乎未减少有氧DML；然而，到第28天，11A44和11G22与对照相比显著改善。到第60天，除11GFT之外，所有处理物与对照相比具有统计学意义上的改善。
2013-草青贮饲料(表2)
单菌株处理物LN7125和LB7123在与未接种的对照相比时在所有测试的打开天数具有显著减少的有氧干物质损失。LB7123与植物乳杆菌(L.plantarum)菌株的组合在所有天数对减少有氧干物质损失有效，而植物乳杆菌(L.plantarum)与LN7125的组合相比于未接种的对照无统计学差异。
直至青贮后90天，商业产品对有氧干物质损失具有微小效应。11A44处理物在减少干物质损失方面比组合产物11G22有效。
总结
因为由这些菌株和与同型发酵菌的组合减少了有氧干物质损失，在早期打开青贮草料时观察到可重复的干物质损失改善，为使用特定选择的布氏乳杆菌(L.buchneri)或短乳杆菌(L.brevis)接种物的生产者提供经济上的优势。
表1：2012年布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)对青贮不同时长的欧洲草青贮饲料在暴露于空气时的干物质损失的效应。
Figure BDA0001110226600000211
abc在一天内，具有不同上标的值的差异p≤0.05。
表2：2013年布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)单独及与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的组合对青贮不同时长的欧洲 草青贮饲料在暴露于空气时的干物质损失的效应。
Figure BDA0001110226600000212
Figure BDA0001110226600000221
abcd在一天内，具有不同上标的值的差异p≤0.05。
在阐明和描述了本发明实施方案的原理之后，将对本领域技术人员显而易见的是，本发明实施方案可以在排列和细节上进行修改而不脱离这些原理。因此，本发明涵盖字面上或等同地落入这些权利要求的范围内的所有另选实施方案。
应当理解，上文示出并描述了各个优选的实施方案以示出本发明的不同可能特征、以及其中可组合这些特征的不同方式。除了以各种方式组合上文实施方案的不同特征外，认为其它变型也在本发明的范围内。
本说明书中引用的全部出版物及公开的专利文件均以引用方式并入本文，就如同明确且单独地指明将每个单独的出版物或公开的专利文献以引用的方式并入一样。

Claims (13)

1.一种密封的储存单元，其包含发酵的青贮饲料组合物，所述组合物包含：青贮饲料质保量的细菌布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）LN7125、或短乳杆菌（Lactobacillus brevis）LB5328、或短乳杆菌（Lactobacillus brevis）LB7123、以及它们的混合物、青贮饲料、以及合适载体，其中所述组合物特征在于在制备组合物后7天内具有减少的青贮饲料干物质损失，并且其中在厌氧发酵7天后打开的所述密封的储存单元获得青贮饲料混合物，所述青贮饲料混合物相比不含所述细菌的青贮饲料具有增加的有氧稳定性，所述有氧稳定性是通过干重损失测量的。
2.根据权利要求1所述的密封的储存单元，其中所述组合物含有101至1011个活生物体/克青贮饲料湿重。
3.根据权利要求1所述的密封的储存单元，其中所述组合物含有102至107个活生物体/克青贮饲料湿重。
4.根据权利要求1所述的密封的储存单元，其中所述组合物含有103至106个活生物体/克青贮饲料湿重。
5.根据权利要求1所述的密封的储存单元，进一步包含碳酸钙、淀粉、或纤维素。
6.一种用于生产具有增加的有氧稳定性的发酵青贮饲料的方法，所述方法包括：
向青贮前植物材料添加青贮饲料保存量的细菌布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）LN7125、或短乳杆菌（Lactobacillus brevis）LB5328、或短乳杆菌（Lactobacillus brevis）LB7123，或它们的混合物；
将青贮前植物材料放入储存单元；
密封储存单元以实质性限制接触外界空气以产生密封的储存单元；
在密封的储存单元中厌氧发酵青贮饲料至少7天的时期；以及
在经过至少7天的时期后打开密封的储存单元；
其中增加的有氧稳定性是与不含所述细菌的青贮饲料的有氧稳定性相比，所述有氧稳定性是通过干重损失测量的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述植物材料为以下中的任一种：草、玉米、苜蓿、小麦、豆类、油料种子、或高粱。
8.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括将经处理的植物材料储存二十九（29）天。
9.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括将经处理的植物材料储存二十八（28）天。
10.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括将经处理的植物材料储存十四（14）天。
11.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括将经处理的植物材料储存七（7）天。
12.根据权利要求6所述的方法，其中处理方法为以下中的任一种：
a. 成捆青贮；
b. 在袋中青贮；
c. 在青贮坑中青贮；
d. 成堆青贮；
e.在桶状青贮塔中青贮；以及
f. 在青贮塔中青贮。
13.根据权利要求6所述的方法，所述方法包括向青贮饲料添加青贮饲料质保量的同型发酵乳酸菌菌种。
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