PL209677B1

PL209677B1 - Nowy szczep bakterii Lactobacillus buchner

Info

Publication number: PL209677B1
Application number: PL380359A
Authority: PL
Inventors: Krystyna Zielińska; Krystyna Stecka; Antoni Miecznikowski; Alina Suterska; Marta Kupryś
Original assignee: Inst Biotechnologii Przemysłu Rolno Spożywczego
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2011-10-31
Also published as: PL380359A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii Lactobacillus buchneri o zdolności do hamowania rozwoju drożdży i pleśni, który zastosowany jako kultura starterowa poprawia stabilność tlenową kiszonych roślin.

Degradacja tlenowa kiszonek roślinnych obniża ich wartość pokarmową i stan higieny, poprzez rozwój mikroorganizmów tlenowych w tym potencjalnych patogenów.

Większość znanych heterofermentatywnych szczepów z gatunku Lactobacillus buchneri fermentuje następujące węglowodany: glukozę, arabinozę, maltozę, melicytozę, melibiozę, rybozę, fruktozę, nie fermentuje: amygdaliny, mannitolu, ramnozy, trehalozy i sorbitolu, a nieliczne szczepy z tego gatunku wykazują dodatkowo zdolności do fermentacji eskuliny lub rafinozy lub sacharozy lub ksylozy. Niektóre szczepy Lactobacillus buchneri, często modyfikowane genetycznie, wytwarzają metabolity hamujące rozwój drożdży i pleśni. Udział tych szczepów w procesach kiszenia pasz przyczynia się do wzrostu jakości, stabilności tlenowej i wartości pokarmowej kiszonek. Obecnie istnieje duże zapotrzebowanie na wzbogacanie kultur starterowych preparatów do kiszenia pasz, w nowe heterofermentatywne nie modyfikowane genetycznie bakterie fermentacji mlekowej, pochodzące z naturalnego środowiska.

Celem wynalazku było wyizolowanie ze środowiska roślinnego nowego szczepu z gatunku Lactobacillus buchneri, który bez modyfikacji genetycznych będzie charakteryzował się pożądaną zdolnością do wytwarzania metabolitów hamujących rozwój mikroorganizmów tlenowych.

Nowy szczep bakterii będący przedmiotem wynalazku określono jako Lactobacillus buchneri i zdeponowano w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie, pod numerem KKP/907/p.

Szczep według wynalazku został uzyskany na drodze wielokrotnej selekcji kolonii rosnących na stałych podłożach MRS, zawierających jako jedyne źródła węgla: sacharozę, ksylozę, rafinozę, z dodatkiem lub bez eskuliny. Do kolejnych selekcji wybierano monokultury, które nie wykorzystywały eskuliny.

Na podstawie uzyskanych wyników fermentacji mlekowej 49 węglowodanów zawartych w teście API i analizie komputerowej danych, stwierdzono, że nowy szczep należy do gatunku Lactobacillus buchneri. Identyfikację genetyczną wykonano metodą sekwencjonowania fragmentu genu 16S rRNA i porównania uzyskanych wyników z publikowanymi w bazach genetycznych klasyfikacji bakterii tego gatunku.

Nieoczekiwanie okazało się, że nowy szczep Lactobacillus buchneri KKP 907/p wykazuje zdolność do fermentacji sacharozy, ksylozy i rafinozy oraz wytwarzania znacznej ilości metabolitów hamujących rozwój mikroorganizmów tlenowych, w tym patogennych, a zwłaszcza kwasu octowego i 1,2-propandiolu na poziomie gwarantującym poprawę stabilności tlenowej pasz, kiszonych z jego udziałem, do 12 dni.

Nowy szczep Lactobacillus buchneri KKP 907/p charakteryzuje się następującymi cechami morfologicznymi:

kolonie bakterii rosnące w warunkach beztlenowych na specyficznej dla rodzaju Lactobacillus spp. pożywce MRS zestalonej agarem (wg Man, Rogosa), mają kształt owalny, są koloru białego, o wielkości około 0,5 mm. Komórki bakterii nie wytwarzają przetrwalników, są Gram +, mają postać krótkich pałeczek, występują pojedynczo, lub łączą się w łańcuszki, są charakterystyczne dla gatunku Lactobacillus buchneri. Optymalna temperatura wzrostu szczepu wynosi 35°C.

Wymienione właściwości szczepu według wynalazku gwarantują uzyskanie następujących pożądanych cech użytkowych:

- szybkiego rozwoju biomasy i zdolności do opanowania środowiska roślinnego w czasie pierwszej doby fermentacji mlekowej,

- zdolnoś ci do hamowania rozwoju bakterii tlenowych, droż d ż y i pleś ni,

- wysokiej dynamiki wytwarzania kwasu mlekowego i octowego oraz 1,2-propandiolu z cukrów powszechnie występujących w kiszonych roślinach: glukozy, sacharozy i ksylozy.

- zdolnoś ci do poprawy stabilno ś ci tlenowej kiszonych pasz.

Wyniki badań przedstawiono w tabeli 1 oraz na rysunku 1.

PL 209 677 B1

T a b e l a 1

Dynamika przyrostu biomasy bakterii, syntezy kwasu mlekowego i octowego przez szczep Lactobacillus buchneri KKP/907/p hodowany w podłożu MRS z sacharozą lub ksylozą jako jedynymi źródłami węgla, od 24 do 72 godzin, w temperaturze 35°C

Badane parametry	Sacharoza	Ksyloza
24 h	48 h	72 h	24 h	48 h	72 h
Zawartość kwasu mlekowego (L+D), g/100 ml	1,2	2,0	1,8	0,8	1,3	1,5
Zawartość kwasu octowego, g/100 ml	0,1	0,2	0,5	0,1	0,2	0,3
Przyrost biomasy bakterii, j.t.k./ml	4,3 x 10⁸	2,2 x 10⁹	2,4 x 10⁹	2,4 x 10⁸	2,8 x 10⁹	6,4 x 10⁹

Nowy szczep Lactobacillus buchneri, hodowany w pożywce zawierającej ksylozę jako jedyne źródło węgla, wyróżnia się wyższą intensywnością przyrostu biomasy (6,2 x 10⁹) w stosunku do przyrostu biomasy bakterii hodowanych w pożywce zawierającej sacharozę (2,4 x 10⁹). Między 48 a 72 h hodowli zarówno przy zastosowaniu ksylozy jak i sacharozy, wzrasta w podłożu hodowlanym zawartość kwasu octowego, a maleje zawartość kwasu mlekowego. Bakterie Lactobacillus buchneri KKP/907/p charakteryzują się zdolnością metabolizowania wytworzonego kwasu mlekowego do octowego, a następnie do 1,2-propandiolu.

Rysunek 1 przedstawia dynamikę biosyntezy 1,2-propandiolu przez nowy szczep Lactobacillus buchneri (pożywka MRS, temperatura hodowli 35°C).

Na rysunku uwidoczniono, że w czasie dziesięciodniowej hodowli nowego szczepu zawartość 1,2-propandiolu systematycznie rośnie, osiągając wartość przekraczającą 100 mg/100 ml podłoża, zawierającego sacharozę jako jedyne źródło węgla.

Warunki namnażania biomasy nowego szczepu według wynalazku.

Składniki pożywki w gramach/l wody: sacharoza - 20, ekstrakt drożdżowy - 10, namok kukurydziany - 5, fosforan dwuamonowy - 0,2, siarczan magnezowy - 0,08, siarczan amonowy - 0,35, siarczan manganowy - 0,01.

Hodowle bakterii prowadzono w fermentorach o pojemności 150 I, w temperaturze 35°C, przy pH regulowanym wodą amoniakalną do wartości 5,8. Otrzymaną biomasę bakterii o zawartości suchej masy 30%, po wymieszaniu z nośnikami jak rozpuszczalna skrobia ziemniaczana, laktoza, glukoza i sacharoza, suszono fluidalnie w temperaturze nie przekraczają cej 40°C. Suchy preparat bakterii o zawartoś ci suchej masy okoł o 9 % zawierał w 1 g 1 x 10⁹ jednostek tworzą cych kolonie bakterii.

Suchy preparat nowego szczepu zastosowano jako kulturę starterową do kiszenia traw.

Porównano stopień zanieczyszczenia mikrobiologicznego kiszonek (drożdże i pleśnie), jakość kiszonek ocenianą na podstawie ilości kwasów organicznych oraz stabilność tlenową wyrażoną zmianami temperatury i pH, po otwarciu kiszonek wytworzonych bez i z dodatkiem bakterii Lactobacillus buchneri KKP/907/p. Wyniki badań przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2

Wpływ Lactobacillus buchneri KKP/907/p na obniżenie liczby drożdży i pleśni, zawartość kwasów organicznych i stabilność tlenową kiszonek z traw.

Rodzaj kiszonki z traw	s.m.,%	pH	Liczba j.t.k./g kiszonki	Zawartość kwasów organicznych h,%
drożdży	pleśni	bakterii kwaszących	mlekowego	octowego	masłowego
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Kontrolna bez dodatku bakterii	32,2	5,5	3,4 x 10²	2,5 x 10⁴	4,2 x 10⁴	1,1	0,25	0,10
Stabilność tlenowa po otwarciu bel do 4 dni
Kiszonka nr 1 z dodatkiem bakterii 0,5 g/t	33,0	4,6	brak	2,1 x 10¹	3,5 x 10⁶	1,7	0,45	brak
Stabilność tlenowa po otwarciu bel przez 10 dni

PL 209 677 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8	9
Kiszonka nr 2 z dodatkiem bakterii 1,0 g/t	32,8	4,4	brak	1,5 x 10¹	7,0 x 10⁶	1,7	0,60	brak
Stabilność tlenowa po otwarciu bel przez 12 dni

Pod wpływem kultury starterowej nowego szczepu bakterii Lactobacillus buchneri znacznie poprawia się czystość mikrobiologiczna kiszonek, w wyniku ograniczenia rozwoju drożdży i pleśni. W przypadku stosowania preparatu Lactobacillus buchneri w iloś ci 0,5 g/t liczba pleś ni spada o dwa rzędy wielkości, natomiast dawka 1,0 g/t powoduje dalszy spadek liczby pleśni do 5 kolonii w 1 g kiszonki, przy pełnym zahamowaniu rozwoju drożdży. Wysoka zawartość kwasu mlekowego i octowego w kiszonkach z dodatkiem bakterii, wynoszą ca odpowiednio 1,7% i 0,45-0,60% zapewnił a wysoką jakość tych pasz. Dodatek Lactobacillus buchneri wpłynął na znaczną poprawę stabilności tlenowej kiszonek. Kiszonka z dodatkiem preparatu nowego szczepu w ilości 1,0 g/t wykazała stabilność tlenową przez 12 dni po otwarciu bel, co jest czasem wystarczającym do jej wykorzystania do żywienia zwierząt.

Claims

Nowy szczep bakterii Lactobacillus buchneri zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie, pod numerem