CN107189968B - 一种粪肠球菌及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种粪肠球菌及其制备方法，涉及微生物发酵技术领域。本发明公开的粪肠球菌制品的制备方法采用包括有麸皮6.5‑7.5份、豆粕2‑4份、沸石粉1.5‑2.5份、水14‑16份、碳酸钙0.1‑0.2份以及磷酸氢二钾0.05‑0.1份的固体发酵培养基对粪肠球菌种子液进行发酵培养，培养后的发酵产物经干燥、粉碎后即可粪肠球菌制品，该制备方法采用固体发酵工艺，固体发酵培养基的组分配比进行合理科学地搭配，确保所制备得到粪肠球菌制品单位活菌含量高、可经长时间存放，保存半年后活菌数仍可达80亿CFU/g。

Description

一种粪肠球菌及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体而言，涉及一种粪肠球菌及其制备方法。
背景技术
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)菌形圆或椭圆，可顺链的方向延长，直径0.5-1.0微米，大多数成双或短链状排列，通常不运动。粪肠球菌(E.faecalis)是革兰氏阳性，过氧化氢阴性球菌，是人和动物肠道内主要菌群之一，其能产生天然抗生素，有利于机体健康；同时还能产生细菌素等抑菌物质，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，改善肠道微环境；还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降。另外，粪肠球菌为消化道内正常存在的一类微生物，在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力，并且是一种兼性厌氧的乳酸菌，适合于生产和应用，是一种很好的饲用微生物，在水产，畜禽上的应用广泛。
但是，现有的粪肠球菌制品的发酵方法所制备的粪肠球菌制品随着保存时间的延长，其活菌数也降低明显，不耐保存。
发明内容
本发明的目的在于提供一种粪肠球菌制品的制备方法，该制备方法所制备的粪肠球菌制品活菌数含量高、存放时间久。
本发明的另一目的在于提供一种粪肠球菌制品，其由上述的制备方法制备得到，其具有活菌数含量高、存放时间久等特点。
本发明是这样实现的：
一种粪肠球菌制品的制备方法，其包括：
将活化的粪肠球菌种子液接种至固体发酵培养基进行发酵培养，置于35-37℃条件下，培养36-48h；
其中，固体发酵培养基按重量份计包括：麸皮6.5-7.5份、豆粕2-4份、沸石粉1.5-2.5份、水14-16份、碳酸钙0.1-0.2份以及磷酸氢二钾0.05-0.1份。
一种粪肠球菌制品，其通过上述的粪肠球菌制品的制备方法所制备而成。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的粪肠球菌制品的制备方法，采用包括有麸皮6.5-7.5份、豆粕2-4份、沸石粉1.5-2.5份、水14-16份、碳酸钙0.1-0.2份以及磷酸氢二钾0.05-0.1份的固体发酵培养基对粪肠球菌种子液进行发酵培养，培养后的发酵产物经干燥、粉碎后即可粪肠球菌制品，该制备方法采用固体发酵工艺，固体发酵培养基的组分配比进行合理科学地搭配，确保所制备得到粪肠球菌制品单位活菌含量高、可经长时间存放，保存半年后活菌数仍可达80亿CFU/g。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种粪肠球菌及其制备方法进行具体说明。
一方面，本发明实施例提供了一种粪肠球菌制品的制备方法，其包括：
将活化的粪肠球菌种子液接种至固体发酵培养基进行发酵培养，置于35-37℃条件下，培养36-48h；
其中，固体发酵培养基按重量份计包括：麸皮6.5-7.5份、豆粕2-4份、沸石粉1.5-2.5份、水14-16份、碳酸钙0.1-0.2份以及磷酸氢二钾0.05-0.1份。
采用上述配比的固体发酵培养基，营养均衡，菌体生长所需的碳源，氮源都很充足，沸石粉的多孔性结构能够作为载体提高菌体存活率，同时，沸石粉成本较低，可以降低生产成本。此水分比例为菌体生长提供了足够的自由水，水的活性aw较高，利于菌体生长繁殖。碳酸钙和磷酸氢二钾均能够调节PH，利于菌体繁殖。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵培养结束后，上述制备方法还包括：干燥发酵产物至含水量为8％-10％。在该水分含量范围内最利于菌种保存。此时菌体不至于烘干过度脱水而亡，也不至于产品水分过高影响品质。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在35℃～40℃条件下，采用循环风干燥上述发酵产物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在烘干后，上述制备方法还包括：粉碎烘干后的上述发酵产物。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述发酵产物粉碎至40-60目。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述粪肠球菌种子液按1.8-2.2％的接种量接种至上述固体发酵培养基。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵培养前，上述制备方法还包括：活化步骤；
活化菌种是为了是菌种处于生长的对数时期，此时菌体代谢活性最强，生长旺盛，代时最短，菌体数量呈对数增加。菌体个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，转接后能最快适应新的环境，并增殖生长。
该活化步骤包括：
将粪肠球菌菌种接种至固体MRS培养基中，置于35-37℃条件下培养24-36h，挑取单菌落转入液体MRS培养基中，置于35-37℃条件下培养10-16h，得到一级种子液；
将上述一级种子液按1.8-2.2％的接种量接种至液体MRS培养基中，置于35-37℃条件下培养8-12h，得到上述活化的粪肠球菌种子液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述液体MRS培养基的配方按1L计含有：蛋白胨9.8-10.2g、酵母粉3.8-4.2g、牛肉膏7.8-8.2g、葡萄糖18-22g、磷酸氢二钾1.8-2.2g、七水硫酸镁0.55-0.61g、无水硫酸锰0.018-0.022g、柠檬酸氢二胺1.8-2.2g以及无水乙酸钠4.8-5.2g，pH6.2-6.6。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述固体MRS培养基的配方按1L计含有：蛋白胨9.8-10.2g、酵母粉3.8-4.2g、牛肉膏7.8-8.2g、葡萄糖18-22g、磷酸氢二钾1.8-2.2g、七水硫酸镁0.55-0.61g、无水硫酸锰0.018-0.022g、柠檬酸氢二胺1.8-2.2g、无水乙酸钠4.8-5.2g以及琼脂9-11g，pH6.2-6.6。
另一方面，本发明实施例提供了一种粪肠球菌制品，其由上述的制备方法所制备而成。
本发明提供的制备方法采用固体发酵工艺进行发酵培养，固体发酵培养基的组分配比进行合理科学地搭配，确保所制备得到粪肠球菌制品单位活菌含量高、可经长时间存放。
例如，采用本发明实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法在培养结束时，检测到的活菌数有80-120亿CFU/g，40℃烘干后，粪肠球菌的活菌数可达285-375亿CFU/g，粉碎后的活菌数在130-165亿CFU/g；
此外，本发明提供的粪肠球菌制品在阴凉干燥的地方保存半年后活菌数仍可达到80亿CFU/g以上，而现有的液体发酵制得的粪肠球菌初始值120亿CFU/g，保存半年后剩余的活菌数不到1亿CFU/g。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法包括如下步骤：
1.活化菌种
(1)将粪肠球菌菌种(Enterococcus faecalis，华中农业大学微生物农药与国家工程中心保存)在无菌条件下接种于固体MRS培养基中，置于37℃条件下培养36h，挑取单菌落转入装置2/3体积的液体MRS培养基的30ml玻璃瓶中，置于37℃条件下培养16h，得到一级种子液。
(2)将一级种子液按2％的接种量接种至液体MRS培养基中，置于37℃条件下培养12h，得到二级种子液，作为活化的粪肠球菌种子液，备用。
其中，1L的固体MRS培养基通过如下方法制备：
取蛋白胨10g、酵母粉4g、牛肉膏8g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.58g、无水硫酸锰0.02g、柠檬酸氢二胺2g、无水乙酸钠5g以及琼脂10g，用蒸馏水定容至1L，调pH至6.2-6.6；121℃灭菌20min，冷却后即可。
1L的固体MRS培养基通过如下方法制备：取蛋白胨10g、酵母粉4g、牛肉膏8g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.58g、无水硫酸锰0.02g、柠檬酸氢二胺2g以及无水乙酸钠5g，用蒸馏水定容至1L，调pH至6.5；121℃灭菌20min。
2.固体发酵培养
将活化的粪肠球菌种子液(即二级种子液)按2％的接种量接种至固体发酵培养基进行发酵培养，置于37℃条件下，培48h，得发酵产物，备用，并检测其活菌数，结果为120亿CFU/g。
其中，固体发酵培养基通过以下方法制备得到：取麸皮7kg、豆粕3kg、沸石粉2kg、水15kg、碳酸钙0.1kg以及磷酸氢二钾0.05kg，混合后，于121℃灭菌20min。
3.干燥
发酵结束后，将发酵产物35℃～40℃条件下，采用循环风将发酵产物烘干至含水量为9％，得到干燥的发酵产物，备用，并检测其活菌数，结果为75亿CFU/g。
4.粉碎
将烘干后的发酵产物粉碎至40目，即得粪肠球菌制品，检测其活菌数，结果为165亿CFU/g。
本实施例还提供了采用上述方法制备得到的粪肠球菌制品。
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法操作简单、原料少且容易获取，成本低，该制备方法采用固体发酵工艺，通过将活化的粪肠球菌种子液经过固体发酵、烘干、粉碎步骤后，即可制得成品的粪肠球菌制品，所制备的粪肠球菌制品活菌含量高，存放时间久。
实施例2
不同存放时间后，实施例1提供的粪肠球菌制品活菌数含量检测。
检测方法：待测样品依次10倍梯度稀释，直至合适的稀释倍数，向添加好菌液的灭菌平板中注入约15ml固体MRS培养基(温度控制在45℃左右)，震荡平板，使培养基与菌液充分混匀，培养基凝固后倒置培养48h后计数。
取步骤4得到的粪肠球菌制品以及买的市面上液体发酵制得的某粪肠球菌制品，置于在阴凉干燥的地方保存半年后检测其活菌数含量。结果见表1。
表1实施例1提供的粪肠球菌制品保存半年后的活菌数含量
Figure BDA0001357242160000081
Figure BDA0001357242160000091
由表1数据可看出，经过半年的存放时间后，本发明实施例1提供的粪肠球菌制品的活菌数含量明显高于普通的粪肠球菌制品，且本实施例提供的粪肠球菌制品的活菌数的降低比例(46.67％)明显低于普通的粪肠球菌制品(99.17％)，由此表明，本发明实施例提供的粪肠球菌制品更耐存放，可长时间存放。
实施例3
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法与实施例1基本相同，不同的是：本实施例中在发酵培养的步骤所用的固体发酵培养基的组分用量与实施例1不同。
在本实施例中，所用的固体发酵培养基通过以下方法制备得到：取麸皮6.5kg、豆粕2kg、沸石粉1.5kg、水14kg、碳酸钙0.1kg以及磷酸氢二钾0.05kg，混合后，于121℃灭菌20min。
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法的效果与实施例1相同。
实施例4
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法与实施例1基本相同，不同的是：本实施例中在发酵培养的步骤中所用的固体发酵培养基的组分用量与实施例1不同。
在本实施例中，所用的固体发酵培养基通过以下方法制备得到：取麸皮7.5kg、豆粕4kg、沸石粉2.5kg、水16kg、碳酸钙0.2kg以及磷酸氢二钾0.1kg，混合后，于121℃灭菌20min。
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法的效果与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法与实施例1基本相同，不同的是：本实施例中在干燥的步骤中，发酵产物在35℃条件下采用循环风进行烘干至发酵产物含水量为10％。
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法的效果与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法与实施例1基本相同，不同的是：本实施例中在干燥的步骤中，发酵产物在35℃条件下采用循环风进行烘干至发酵产物含水量为8％。
本实施例提供的粪肠球菌制品的制备方法的效果与实施例1相同。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种粪肠球菌制品的制备方法，其特征在于，其包括：
将活化的粪肠球菌种子液接种至固体发酵培养基进行发酵培养，置于35-37℃条件下，培养36-48h；
其中，固体发酵培养基按重量份计由如下原料制成：麸皮6.5-7.5份、豆粕2-4份、沸石粉1.5-2.5份、水14-16份、碳酸钙0.1-0.2份以及磷酸氢二钾0.05-0.1份；
在发酵培养结束后，所述制备方法还包括：干燥发酵产物至含水量为8％-10％，在低于40℃条件下，采用循环风干燥所述发酵产物。
2.根据权利要求1所述的粪肠球菌制品的制备方法，其特征在于，在烘干后，所述制备方法还包括：粉碎烘干后的所述发酵产物。
3.根据权利要求2所述的粪肠球菌制品的制备方法，其特征在于，所述发酵产物粉碎至40-60目。
4.根据权利要求1所述的粪肠球菌制品的制备方法，其特征在于，所述粪肠球菌种子液按1.8-2.2％的接种量接种至所述固体发酵培养基。
5.根据权利要求1所述的粪肠球菌制品的制备方法，其特征在于，在发酵培养前，所述制备方法还包括：活化步骤；
所述活化步骤包括：
将粪肠球菌菌种接种至固体MRS培养基中，置于35-37℃条件下培养24-36h，挑取单菌落转入液体MRS培养基中，置于35-37℃条件下培养10-16h，得到一级种子液；
将所述一级种子液按1.8-2.2％的接种量接种至液体MRS培养基中，置于35-37℃条件下培养8-12h，得到所述活化的粪肠球菌种子液。
6.根据权利要求5所述的粪肠球菌制品的制备方法，其特征在于，所述液体MRS培养基的配方按1L计含有：蛋白胨9.8-10.2g、酵母粉3.8-4.2g、牛肉膏7.8-8.2g、葡萄糖18-22g、磷酸氢二钾1.8-2.2g、七水硫酸镁0.55-0.61g、无水硫酸锰0.018-0.022g、柠檬酸氢二胺1.8-2.2g以及无水乙酸钠4.8-5.2g，pH6.2-6.6。
7.根据权利要求5所述的粪肠球菌制品的制备方法，其特征在于，所述固体MRS培养基的配方按1L计含有：蛋白胨9.8-10.2g、酵母粉3.8-4.2g、牛肉膏7.8-8.2g、葡萄糖18-22g、磷酸氢二钾1.8-2.2g、七水硫酸镁0.55-0.61g、无水硫酸锰0.018-0.022g、柠檬酸氢二胺1.8-2.2g、无水乙酸钠4.8-5.2g以及琼脂9-11g，pH6.2-6.6。
8.一种粪肠球菌制品，其特征在于，其通过权利要求1-7中任一项所述的粪肠球菌制品的制备方法所制备而成。
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CP01 Change in the name or title of a patent holder
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Address after: 434000 Gong Jiahuan, Sanhu management zone, Jiangling County, Jingzhou City, Hubei Province

Patentee after: Hubei Chutian Aike Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 434000 Gong Jiahuan, Sanhu management zone, Jiangling County, Jingzhou City, Hubei Province

Patentee before: HUBEI XINXINGDI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right
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Effective date of registration: 20210809

Address after: 430070 No. 517, Luoshi South Road, Hongshan District, Wuhan City, Hubei Province (office only)

Patentee after: Wuhan Chutian Aike Biotechnology Group Co.,Ltd.

Address before: 434000 Gong Jiahuan, Sanhu management zone, Jiangling County, Jingzhou City, Hubei Province

Patentee before: Hubei Chutian Aike Biotechnology Co.,Ltd.