CN106148212A - 一种饲用粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵方法 - Google Patents

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王劲松
张魁
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Abstract

本发明属于粪肠球菌培养技术领域，涉及一种饲用粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵方法。本发明采用pH反馈控制补加蔗糖策略，同时降低发酵液中乳酸的浓度，从而解除乳酸的反馈抑制作用，使用本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法发酵的粪肠球菌，菌体密度较普通发酵显著提高，活菌数不低于1010cfu/mL，较普通MRS培养基培养活菌数提高40倍以上，实现了粪肠球菌的高密度发酵；从而可以减小生物量的分离费用，缩短生产周期，降低生产成本、提高生产效率。

Description

一种饲用粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵方法
技术领域
本发明属于粪肠球菌培养技术领域，涉及一种饲用粪肠球菌高密度发酵培养基及其发酵方法。
背景技术
粪肠球菌，是革兰氏阳性，人和动物肠道内主要菌群之一，其能产生天然抗生素，有利于机体健康；同时还能产生细菌素等抑菌物质，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，改善肠道微环境；还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降。另外，肠球菌为消化道内正常存在的一类微生物，在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力，并且是一种兼性厌氧的乳酸菌，与厌氧、培养保存条件苛刻的双歧杆菌相比，更适合于生产和应用。
传统的静置发酵法得到的发酵液中菌体的发酵密度较低，粪肠球菌活菌数在5-10亿左右，为了得到更多的活菌数，就需要增加生物反应器的体积或增加发酵次数等，从而增加生物量的分离费用，延长生产周期，从而提高生产成本、降低生产效率。
粪肠球菌目前仍难以实现高密度发酵，难以实现的主要问题是发酵培养基及其发酵方法，发酵后期营养物质不足和代谢产物(主要是乳酸)积累抑制菌体生长，导致高密度发酵难以实现。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种饲用粪肠球菌高密度发酵培养基。
本发明的另一目的是提供该高密度发酵培养基的发酵方法。
(二)技术方案
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种饲用粪肠球菌高密度发酵培养基，所述的粪肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，高密度发酵培养基的主要组分及其含量如下：蔗糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L、酵母粉10～25g/L，K2HPO4 2～3g/L，柠檬酸钠2～4g/L，Mg2+水溶性化合物0.2～0.4g/L，Fe2+水溶性化合物0.1～0.2g/L和Mn2+水溶性化合物20～80mg/L。
其中，所述的Mg2+水溶性化合物为MgSO4，MgCl2中的任一种；所述的Fe2+水溶性化合物为FeSO4，FeCl2，中的任一种；所述的Mn2+水溶性化合物为MnSO4。
本发明的饲用粪肠球菌高密度发酵培养基的配制方法如下：
(1)按含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中蔗糖单独溶解；
(2)蔗糖115℃单独灭菌30分钟，其他组分装入发酵罐中121℃灭菌30分钟；
(3)接种前通过无菌操作将蔗糖加入发酵罐中，搅拌混匀，即得。
本发明还提供了该饲用粪肠球菌高密度发酵培养基的发酵方法，主要步骤如下：(1)将冷冻保存的粪肠球菌在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养8～10小时
后作为种子液；
(2)配制发酵培养基，培养基降至所需温度；
(3)以0.5％的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养基中；
(4)发酵，发酵过程中维持发酵液pH值为6.0～6.5，当pH超过设定值时，补加50％蔗糖液：当pH低于设定值时，自动流加氨水、KOH或NaOH中的任一种；在温度37～39℃、转速50rpm条件下发酵8～12小时，发酵过程不通气或通入N2，维持溶氧小于1％；
(5)当补加50％蔗糖液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增加时，终止发酵，即得粪肠球菌活菌数达1010cfu/mL以上的发酵液。
本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法适用于其它肠球菌。本发明所用粪肠球菌保藏于中国工业微生物保藏中心，编号为CICC 23215。
(三)有益效果
本发明采用pH反馈控制补加蔗糖策略，同时降低发酵液中乳酸的浓度，从而解除乳酸的反馈抑制作用，使用本发明的高密度发酵培养基及其发酵方法发酵的粪肠球菌，菌体密度较普通发酵显著提高，活菌数不低于1010cfu/ml，这是现有的技术难以达到的发酵标准，较普通MRS培养基培养活菌数5.1×108cfu/ml，提高40倍，实现了粪肠球菌的高密度发酵；可以减小生物量的分离费用，缩短生产周期，从而降低生产成本、提高生产效率。
具体实施方式
通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例1 发酵培养基的配制及发酵比较
1、粪肠球菌高密度发酵培养基组分及其含量为：
蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸钠2g/L，MgSO4：0.2g/L，FeSO4：0.1g/L，MnSO4：55mg/L。
2、培养基配制方法：
(1)按上述含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中蔗糖单独溶解；
(2)蔗糖115℃单独灭菌20分钟，其他组分装入发酵罐中121℃，灭菌30分钟；
(3)接种前通过无菌操作将蔗糖加入发酵罐中，搅拌混匀，即得。
3高密度发酵与现有技术发酵的比较
(1)将冷冻保存的粪肠球菌在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液；
(2)配制发酵培养基，培养基降至所需温度；
(3)以0.5％的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养纂中；
(4)发酵，发酵过程中维持发酵液pH值为6.0，当pH超过6.0时，补加50％蔗糖
液；当pH低于6.0时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37′C、转速50rpm条件下
发酵10小时，发酵过程不通气，维持溶氧小于1％；
(5)当补加50％蔗糖液pH不再降低时，终止发酵，即得粪肠球菌活菌数达1.2×1010cfu/ml的发酵液。
3.2对照实验
(1)粪肠球菌发酵培养基(MRS培养基)其组分与含量为：
蔗糖：20g/L、蛋白胨：10g/L、牛肉膏：5g/L，酵母粉；4g/L，K2HPO4：2g/L，CH3COONa：5g/L、柠檬酸钠：2g/L，MgSO4：0.2g/L，MnSO4：50mg/L、吐温80：1ml。
(2)发酵
将冷冻保存的粪肠球菌在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养10小时后。以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液，以0.5％接种量接种发酵培养基。37℃静置培养10小时，终止发酵，
得到粪肠球菌活菌数为4.1×108cfu/ml
3.3结果分析
应用本发明的培养基及其发酵方法，可以得到粪肠球菌活菌数达1.2×1010cfu/ml的发酵液，而应用现行发酵培养基(MRS培养基)及其发酵方法，得到的粪肠球菌活菌数仅为4.1×108cfu/ml。实验证明本发明的培养基及其发酵方法得到的粪肠球菌活菌数为现有技术的近30倍，实现了高密度发酵。
实施例2 发酵培养基的配制及发酵比较
1、粪肠球菌高密度发酵培养基组分及其含量为：
蔗糖20g/L，蛋白胨15g/L、酵母粉15g/L，K2HPO4 3g/L，柠檬酸钠4g/L， MgSO4：0.2g/L，FeSO4：0.1g/L，MnSO4：80mg/L。
2、培养基配制方法：
(1)按上述含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中蔗糖单独溶解；
(2)蔗糖115℃单独灭菌20分钟，其他组分装入发酵罐中121℃，灭菌30分钟；
(3)接种前通过无菌操作将蔗糖加入发酵罐中，搅拌混匀，即得。
3高密度发酵与现有技术发酵的比较
(1)将冷冻保存的粪肠球菌在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液；
(2)配制发酵培养基，培养基降至所需温度；
(3)以0.5％的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养纂中；
(4)发酵，发酵过程中维持发酵液pH值为6.0，当pH超过6.0时，补加50％蔗糖
液；当pH低于6.0时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37′C、转速50rpm条件下
发酵10小时，发酵过程不通气，维持溶氧小于1％；
(5)当补加50％蔗糖液pH不再降低时，终止发酵，即得粪肠球菌活菌数达1.8×1010cfu/ml的发酵液。
3.2对照实验
(1)粪肠球菌发酵培养基(MRS培养基)其组分与含量为：
蔗糖：20g/L、蛋白胨：10g/L、牛肉膏：5g/L，酵母粉；4g/L，K2HPO4：2g/L，CH3COONa：5g/L、柠檬酸钠：2g/L，MgSO4：0.2g/L，MnSO4：50mg/L、吐温80：1ml。
(2)发酵
将冷冻保存的粪肠球菌在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养10小时后。以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液，以0.5％接种量接种发酵培养基。37℃静置培养10小时， 终止发酵，
得到粪肠球菌活菌数为5.1×108cfu/ml
3.3结果分析
应用本发明的培养基及其发酵方法，可以得到粪肠球菌活菌数达1.8×1010cfu/ml的发酵液，而应用现行发酵培养基(MRS培养基)及其发酵方法，得到的粪肠球菌活菌数仅为5.1×108cfu/ml。实验证明本发明的培养基及其发酵方法得到的粪肠球菌活菌数为现有技术的35倍，实现了高密度发酵。
实施例3 发酵培养基的配制及发酵比较
1、粪肠球菌高密度发酵培养基组分及其含量为：
蔗糖30g/L，蛋白胨15g/L、酵母粉25g/L，K2HPO42g/L，柠檬酸钠4g/L，MgSO4：0.2g/L，FeSO4：0.1g/L，MnSO4：60mg/L。
2、培养基配制方法：
(1)按上述含量分别称取各组分，用蒸馏水溶解，其中蔗糖单独溶解；
(2)蔗糖115℃单独灭菌20分钟，其他组分装入发酵罐中121℃，灭菌30分钟；
(3)接种前通过无菌操作将蔗糖加入发酵罐中，搅拌混匀，即得。
3高密度发酵与现有技术发酵的比较
(1)将冷冻保存的粪肠球菌在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液；
(2)配制发酵培养基，培养基降至所需温度；
(3)以0.5％的接种量将步骤(1)所得的种子液接种于步骤(2)的发酵培养纂中；
(4)发酵，发酵过程中维持发酵液pH值为6.5，当pH超过6.0时，补加50％蔗糖
液；当pH低于6.5时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37′C、转速50rpm条件下
发酵10小时，发酵过程不通气，维持溶氧小于1％；
(5)当补加50％蔗糖液pH不再降低时，终止发酵，即得粪肠球菌活菌数达2.2×1010cfu/ml的发酵液。
3.2对照实验
(1)粪肠球菌发酵培养基(MRS培养基)其组分与含量为：
蔗糖：20g/L、蛋白胨：10g/L、牛肉膏：5g/L，酵母粉；4g/L，K2HPO4：2g/L，CH3COONa：5g/L、柠檬酸钠：2g/L，MgSO4：0.2g/L，MnSO4：50mg/L、吐温80：1ml。
(2)发酵
将冷冻保存的粪肠球菌在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于深层MRS液体试管，37℃培养10小时后。以1％接种量转接于MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液，以0.5％接种量接种发酵培养基。37℃静置培养10小时，终止发酵，
得到粪肠球菌活菌数为5.5×108cfu/ml
3.3结果分析
应用本发明的培养基及其发酵方法，可以得到粪肠球菌活菌数达2.2×1010cfu/ml的发酵液，而应用现行发酵培养基(MRS培养基)及其发酵方法，得到的粪肠球菌活菌数仅为5.5×108cfu/ml。实验证明本发明的培养基及其发酵方法得到的粪肠球菌活菌数为现有技术的40倍，实现了高密度发酵。
生产中，高密度发酵的实现可以减小生物量的分离费用，缩短生产周期，降低生产成本、提高生产效率等，这在高效节能的当代社会具有极其重要的意义。

Claims (3)

1.所述的粪肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其高密度发酵培养基的主要组分及其含量如下；蔗糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L、酵母粉10～25g/L，K2HPO42～3g/L，柠檬酸钠2～4g/L，Mg2+水溶性化合物0.2～0.4g/L，Fe2+水溶性化合物0.1～0.2g/L和Mn2+水溶性化合物20～80mg/L。
2.权1所述的饲用粪肠球菌高密度发酵培养基，其特征在于所述的Mg2+水溶性化合物为MgSO4，MgCl2中的任一种；所述的Fe2+水溶性化合物为FeSO4，FeCl2，中的任一种；所述的Mn2+水溶性化合物为MnSO4。
3.如权1，2项所述的饲用粪肠球菌高密度发酵培养基的发酵方法，其特征在于主要步骤：种子液通过MRS液体培养基37℃培养8～10小时后得到；发酵接种量0.5％-2％；发酵过程中维持发酵液pH值为6.0-6.5；转速50rpm；发酵过程不通气或通入N2，维持溶氧小于1％；发酵8-12小时。
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