CN101792726A - 一株能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌及其在吸附霉菌毒素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌，菌种命名为Enterococcus faecalis SRG，已与2010年03月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010046。本发明的粪肠球菌能够吸附霉菌毒素，吸附能力较强，可以单独或与水合硅铝酸盐复配作为饲料的脱霉剂应用。本发明的粪肠球菌在脱霉的同时，还具有其基本的生物保健功能。将其与具有较强霉菌吸附能力的水合硅铝酸盐复配起来，不仅通过物理吸附性作用达到脱霉的效果，还能通过粪肠球菌的生物活性起到防霉、脱霉、保健的功效。

Description

一株能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌及其在吸附霉菌毒素中的应用

技术领域

本发明涉及一株能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌及其在吸附霉菌毒素中的应用。

背景技术

饲料原料或配合饲料，在生产、加工、贮存、运输过程中极易污染各种霉菌，在适宜的条件下霉菌大量繁殖引起霉变。目前全世界饲料谷物中污染霉菌毒素的比例高达25％以上，除了对畜牧产业造成显著的经济损失外，部分霉菌毒素还具有致癌性或致畸胎性，可经由食用肉乳汁传至人类。在中国，对饲料及饲料原料进行了采样调查霉菌毒素的污染情况，结果发现检测的6种霉菌毒素(黄曲霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素)在被检饲料和饲料原料中均普遍存在。全价料中霉菌毒素的检出率明显高于单一能量饲料和蛋白饲料，检出率均在90％以上，黄曲霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的检出率高达100％。从农业及健康角度出发，目前认为污染最严重，分布最广，危害最大的真菌毒素是黄曲霉毒素(简称AF)，主要污染玉米、花生、坚果等。黄曲霉素是一种高度致癌性物质，它不但危害畜禽的生长、健康和生育，而且还可以通过动物性食品进入人体内，影响人的健康。黄曲霉毒素通常分为4种，即B1，B2，G1和G2，天然污染的黄曲霉毒素以AFB1为主，AFB1危害最大，具有致癌性、致畸性、诱变性，抑制免疫和引起肝部损伤等危害。

黄曲霉是一种真菌，早在60年代初期人们分离得到了第一株黄曲霉。黄曲霉在一定条件下产生AF，它是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物。研究结果表明，AF有17种化学结构，每种化学结构都含有二呋喃氧杂萘邻酮结构，分子直径一般在10埃左右，这17种AF中AFB1毒性最大，它的毒性是敌敌畏的100倍，是砒霜的68倍，比剧毒的氰化钾毒性还大10倍之多。AFB1不但毒性大而且耐热，即使在270℃高温下也不能完全被破坏。动物试验表明，AFB1能诱发动物肝癌，也能诱发胃、肾、直肠、乳腺、卵巢和小肠癌。AFB1中毒的主要症状是引起肝癌，它诱发肝癌的强度是二甲基亚硝胺75倍，是3，4苯并芘4000倍，是世界公认的强致癌物之一。它广泛分布在花生、玉米、粮食及其制品、豆类以及发酵食品中，这类农业收获物由于收获过程和贮藏期间的温、湿条件适于黄曲霉菌繁殖，因而存在黄曲霉毒素的污染问题，这种致命的危害物也往往在随后的运输、加工中扩散到人类的日常生活，进入食物链，对人畜的健康造成很大危害。

饲喂家畜霉变的饲料不仅影响动物生长发育及生产性能，还降低动物繁殖性能、干扰动物免疫系统，防控霉菌及霉菌毒素危害最关键的便是做好饲料的防霉和脱毒两个环节。对于轻度霉变的饲料与原料，可根据具体情况，采用不同的方法进行脱毒处理，脱毒方法一般有物理脱毒法、化学脱毒法、酶解法、吸附法。物理脱毒法如：萃取法、热处理法和辐射法。萃取法主要是用一些有机溶剂如：95％(v/v)乙醇溶液，80％(v/v)2-丙醇，90％(v/v)丙醇及多种乙烷和乙醇混合物从样品中萃取AFB1，该方法用于如花生粉，棉籽等固态食品的毒素去除，效率可达93～98％，能保持产品中蛋白质的数量和质量，但在萃取溶剂回收和处理时花费昂贵，无推广应用价值；热处理法是在高温高压下使AFB1分子分解，由于需要温度很高，对设备要求高，费用高；辐射法是利用红外辐射，紫外照射等破坏黄曲霉毒素的分子结构，但强射线也会破坏营养物质的结构。这些方法是可行的，局限性是广泛应用受到限制。

化学防霉剂种类繁多，广泛用于食品保鲜和防霉的山梨酸、苯甲酸及其盐类、丙酸及其盐类、二氧化硫与亚硫酸盐可抑制或延缓微生物的生长。如NaOH法(曾用于植物油除去毒素)，用强碱把毒素变成盐，再用水洗。由于设备投资大、油耗大、成本高的缺点，现已被淘汰；氨化法(是美国专利方法)，该法用于含水饲料的毒素去除，有效率达98％，但因处理后食品中含有大量的氨，美国FDA规定此法不能用于食品加工；超滤-渗滤法，用该法处理的全奶AFM1含量可由最初的2.5μg/L下降到0.5μg/L，但经处理后的牛奶、脂肪、乳糖以及灰分和总固形物最高可损失23％，且该法对均相化或酸化的牛奶无效。化学脱毒法对食品的色、香、味及营养成分如纤维素或蛋白质等均有不同程度的破坏和不良影响，成本较高，很难在工业化水平制备高活性AF解毒活性物质。

目前，生物脱霉剂的研究越来越受到社会的关注，它安全无副作用，通过某些微生物的生物转化作用，能破坏霉菌毒素的化学结构或降低霉菌毒素的毒性。如橙色黄杆菌法，该法是将该菌与饲料原料共培养，通过毒素与黄杆菌细胞壁之间的物理结合，达到降解AF的目的；还可以采用酵母菌细胞壁吸收AF；啤酒酵母菌培养物结合AF的方法。生物法进行脱毒，脱毒率高，方法简单，且不会带来新的有毒残余，是一种非常可靠且有效的方法。试验证实微生物酶、米根酶、黑曲酶、枯草杆菌等对除去黄曲霉素有较好的效果；大量的研究表明，通过形成有机酸或者产生抗菌物质，乳酸菌可以控制其他微生物的生长，抑制腐败菌和病原微生物的生长。关于乳酸菌对真菌毒素的抑制机制目前集中在3个方面：一是乳酸菌的代谢产物对真菌菌株的抑制；二是乳酸菌在生长过程中产生了抑制复合物，可抑制毒素的合成，同时降解已产生的毒素；三是真菌毒素与乳酸菌细胞壁之间的物理结合效果。以乳酸作为主要代谢产物的微生物种类，广泛应用于发酵食品的生产和保存中，不仅可降低饲料中霉菌毒素的毒性，还可增加饲料营养菌体蛋白，改善适口性。另外，霉菌毒素吸附剂如：沸石、高岭土、硅藻土、伊利五、绿泥石等，它们都有很强的吸附作用，而且性质稳定，一般不溶于水，加入饲料后会在肠道内与霉菌毒素分子结合生成络合物，该络合物不能被消化分解，只能通过消化道与粪便一起排出体外。将它们作为吸附剂添加到饲料中，可吸附饲料中的霉菌毒素，减少动物消化道对霉菌毒素的吸收。无机吸附剂水合铝硅酸钠钙(HSCAS)可吸附黄曲霉毒素，并且在水溶液中与黄曲霉毒素的亲和力和吸附能力很高，粘土型吸附剂(如膨润土、沸石、HSCAS)的优点是成本低廉，遗憾的是这些产品在日粮内的添加率必须较高才能产生作用。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一株具有较强霉菌毒素吸附能力的乳酸菌菌株，其吸附能力强，添加量无需太多。将其配以具有AFB1吸附能力的水合铝硅酸盐类，效果更佳。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌，菌种命名为Enterococcus faecalis SRG，已与2010年03月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010046。

本发明的能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌的生物学特性如下：细胞球形或卵圆形，0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，在液体培养基中呈成对或短链；不生芽孢；革兰氏阳性；有时以鞭毛运动；没有明显的荚膜；兼性厌氧；化能异养，发酵代谢；可发酵的碳水化合物范围广泛，主要产L(+)-乳酸，但不产气，最终pH 4.2～4.6，营养需要复杂；接触酶阴性；通常在10～45℃能生长，最适37℃，在pH 9.6、6.5％NaCl中和40％胆碱中也能生长；很少还原硝酸盐；通常发酵乳糖；通常为Lancefield血清D群。培养基可以为MRS培养基，配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，调节pH 5.5～6.7，115℃条件下灭菌20分钟；其中，金属离子混合液的配方是：乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，pH 5.5～6.7，固体加琼脂粉1.5～2.0％。培养条件为：pH 5.5～6.7，温度30～42℃。

本发明的粪肠球菌能够吸附霉菌毒素，吸附能力较强，可以单独或与水合硅铝酸盐复配作为饲料的脱霉剂应用。

具体应用方法如下：

(1)发酵：选用粪肠球菌Enterococcus faecalis SRG CCTCC M 2010046，发酵，发酵培养基MRS培养基，培养条件为：pH 5.5～6.7，温度30～42℃；得发酵液；

(2)取水合硅铝酸盐，与步骤(1)中得到的发酵液混合，得复配液，混合后，水合硅铝酸盐的质量浓度为0.05～0.10％；

(3)将步骤(2)中得到的复配液加入到霉变饲料中，混合均匀，预防饲料霉变时，其添加量为饲料重量的0.05～0.10％，清除霉菌毒素时，其添加量为饲料重量的0.10～0.20％。

按照0.10％的比例添加可以吸附饲料中不容易被肉眼察觉的微量霉菌毒素，达到预防霉菌毒素中毒的目的；而对于轻度霉变的饲料，添加0.15％的生物脱霉剂，可以达到防霉脱毒的效果，预防家畜食用霉变饲料后中毒；中度以上能够用肉眼发觉霉变严重的饲料，应当先将霉变饲料分散，降低霉菌毒素的浓度，再添加0.20％的生物脱霉剂进行脱毒。

所述发酵的具体步骤如下：

(i)菌种：选用粪肠球菌Enterococcus faecalis SRG CCTCC M 2010046；

(ii)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在30～42℃培养20～28h；

(iii)一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接1～3环于50mL～100mL种子液体培养基中，在30～42℃条件下，静置培养10～14h，制得一级种子液；

(iv)扩大培养：以5％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在30～42℃条件下，静置培养5～12h，制得二级种子液；

(v)发酵罐培养：以5％(v/v)的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于30～42℃条件下，静置培养12～20h；

(vi)收集发酵产物：待步骤(v)之发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液。

上述步骤(iii)、(iv)所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，调节pH 5.5～6.7，115℃条件下灭菌20分钟；步骤(ii)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉；步骤(v)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，调节pH 5.5～6.7；其中，金属离子混合液的配方是：乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，pH 5.5～6.7。

本发明的粪肠球菌在脱霉的同时，还具有其基本的生物保健功能。将其与具有较强霉菌吸附能力的水合硅铝酸盐复配起来，不仅通过物理吸附性作用达到脱霉的效果，还能通过粪肠球菌的生物活性起到脱霉、保健的功效。本发明与现有技术中常用的乳酸菌相比，其突出的有益效果为吸附能力强，对AFB1的吸附作用迅速，在1小时内就能充分发挥吸附作用。

附图说明

本发明涉及的一株能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌，菌种命名为Enterococcus faecalis SRG，已与2010年03月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010046。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌Enterococcus faecalis SRG CCTCC M 2010046的筛选、培养及对霉菌毒素吸附作用的检测：

1.主要仪器试剂

试剂：MRS培养基，苯，己腈，次氯酸钠溶液，AFB1检测试剂盒，水合硅铝酸盐；

仪器与主要耗材：10mL离心管，大、中、小枪头，酶标仪(Thermo)。

2.试验菌株

①实验室原有的菌株：LP，7340，RDH，FLQ，ZYRLQ，SRG，RS1XL。

②鸡肠道以及牛粪中分离的菌株：无菌取鸡肠内容物/新鲜牛粪5g，加入装有50mL灭菌生理盐水的带玻璃珠的三角瓶中，混匀后再添加2％CaCO₃的MRS培养基平板划线分离，37℃培养24h，挑取有Ca²⁺圈的菌落，继续在平板中划线纯化，然后进行菌体形态的观察和属的鉴定，将纯化后的乳酸菌接种于相应的试管斜面中，挑取乳酸菌属的菌株备用，挑选出来的菌株的特性如表1所示。由表1可知，R1、R2、R5均为球菌，平板上培养为乳白色或白色圆形菌落；R3、R4为杆菌，平板上培养为乳白色或白色圆形菌落。

表1乳酸菌的形状特征

③黑龙江八一农垦大学惠赠的乳酸菌菌株：NK1、NK5、GLRSG。

3.初筛

3.1乳酸菌发酵液pH值的测定：测定结果见表2。

由表2可知，在发酵过程中乳杆菌比乳球菌的终pH值低，在这几株乳酸菌中以7340发酵液的pH最低为3.42，其次为GLSRG、LP、RSG0131和SRG的pH值较低，分别为3.58、3.63、4.08、4.13。

表2乳酸菌发酵液的pH值

3.2乳酸菌菌株吸附AFB1性能的测定

3.2.1吸附时间(1h、2h)对乳酸菌吸附率的影响

分别将乳酸菌接种到MRS(pH 6.5)液体培养基中，37℃厌氧培养24h，分别取5mL乳酸菌培养液于无菌的离心管中，4℃、5000rpm离心5min，弃上清液，在沉淀的乳酸菌细胞中加入生理盐水，轻轻吹打，重复离心1次，加入10μL黄曲霉毒素B1苯-乙晴溶液(AFB1浓度为100μg/mL)。将混有AFB1的乳酸菌细胞悬液在37℃，180rpm振荡条件下培养1h和2h。在4℃以10000rpm离心10min，弃上清液，并向沉淀中加入5mL生理盐水并重复离心1次，用试剂盒2次离心所得上清液中黄曲霉毒素B1的量。按下列公式计算乳酸菌吸附AFB1的强度：

乳酸菌吸附黄曲霉毒素B1的强度(％)＝(1-上清液中AFB1的量/实验前加入标准的AFB1量)×100％。结果见表3。

表3吸附时间(1h、2h)对乳酸菌吸附率的影响

由表3可知，乳酸菌与黄曲霉毒素B1混合1h与2h，对乳酸菌的吸附能力差异无显著性(P＞0.05)。同时可以得出，不同的乳酸菌菌株吸附AFB1的能力存在差异。

3.2.2不同乳酸菌菌株吸附AFB1性能的比较

试验选取15株性能优良的乳酸菌菌株，测定其对AFB1的吸附能力，乳酸菌与黄曲霉毒素B1混合时间为1h。方法同3.2.1，结果见表4。

表415株不同乳酸菌菌株吸附AFB1性能的比较

由表4可知，不同菌株对AFB1的吸附能力差异显著，其中GLRSG和SRG对AFB1的去除能力较强，分别为67.67％和41.95％，可以选作备用菌株。

3.3灭活处理对乳酸菌黏附性能的影响

无菌取5mL乳酸菌发酵液，100℃煮沸10min灭活处理。检测方法同3.2.1，结果见表5。

表5灭活处理对乳酸菌黏附性能的影响

由表5可以看出，灭活处理对乳酸菌吸附能力有一定的影响，灭活处理对不同菌株吸附AFB1的能力具有差异性。SRG经过灭活之后其对AFB1的吸附能力由41.46％上升至57.54％，而GLRSG经过灭活之后其对AFB1的吸附能力减弱。

3.4胆盐对筛选菌株存活的影响

试验选取pH较低的SRG和GLRSG菌株，菌液按5％(v/v)接种于胆盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％(w/v)的PBS中，以不加胆盐的PBS缓冲液为对照，在37℃条件下培养10min后，取样进行平板菌落计数。筛选菌株存活率计算公式：a₁/a₀×100％。a₁：各处理的活菌数。

表6胆盐MRS培养基中乳酸菌的存活率(％)

从表6可以看出，在MRS胆盐培养基中，SRG对胆盐的耐受性比GLRSG耐受胆盐的能力强，在0.1％、0.2％的胆盐浓度中SRG的存活率在80％以上，在胆盐浓度高达5％时，仍然有1.15％的SRG存活下来，SRG在胆盐MRS中的存活率显著高于GLRSG的存活水平。

3.5水合硅铝酸盐与乳酸菌的复配

取一定量的水合硅铝酸盐与乳酸菌发酵液(活菌数为20亿)按照不同的比例混合，本试验分为5个浓度梯度，每升乳酸菌菌液中加入水合硅铝酸盐的量分别为0.00mg，0.20mg，0.40mg，0.60mg，0.80mg，摇匀，加入100μL黄曲霉毒素B苯-乙晴溶液(AFB1浓度为100μg/mL)。混合液在37℃下，180rpm培养1h。4℃以10000rpm离心10min，将没有结合的霉菌毒素(仍在溶液中)与结合型霉菌毒素(在吸附剂中)分离，并向沉淀中加入5mL生理盐水并重复离心1次，弃上清液，用试剂盒2次离心所得上清液中黄曲霉毒素B1的量。试验结果见表7。

表7水合硅铝酸盐与乳酸菌的复配效果

由表7可知，SRG在没有加入水合硅铝酸盐的条件下，其去除AFB1的能力可达98.10％，而此时GLRSG对AFB1的去除能力低于90％。当水合硅铝酸盐的浓度为0.20‰时，SRG组对AFB1的吸附能力达99.24％，高于GLRSG组95.83％的吸附力，当水合硅铝酸盐的浓度为0.40‰时，SRG组与GLRSG组对AFB1的吸附能力差异不大，分别为98.05％和98.18％，当水合硅铝酸盐的浓度为0.60‰时，GLRSG组去除AFB1的能力为98.34％，而水合硅铝酸盐的浓度为0.60‰时SRG组以及水合硅铝酸盐的浓度为0.80‰时，SRG和GLRSG两组对AFB1的吸附力未能测出，这可能是由于试剂盒的灵敏度所造成的，其测定区间为5ng/g-1000ng/g，说明溶液中AFB1的浓度已低于5ng/g，基本上已经吸附干净。

4.试验结论

通过试验可以得出以下结论：

①乳酸菌对AFB1吸附能力的大小与乳酸菌的产酸能力没有明显的相关性；

②乳酸菌对AFB1的吸附作用迅速，在1h内就能充分发挥吸附作用；

③通过试验筛选出两株对AFB1吸附能力较强的乳酸菌菌株，分别为SRG和GLRSG，灭活菌也具有对AFB1的吸附能力，并且不同的菌株灭活后吸附AFB1能力的变化不同；

⑤SRG发酵液的活菌数高，对胆盐的耐受能力比GLRSG对胆盐的耐受能力强，综合灭活菌对AFB1的吸附性能与水合硅铝酸盐复配效果，是实际生产应用中最优良的菌株。

对筛选出来的最优良的菌株进行鉴定，确定其为乳酸菌家族中的粪肠球菌，对其进行保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌种命名为Enterococcus faecalis SRG，保藏日期为2010年03月02日，保藏编号为CCTCC M 2010046。该菌株的生物学特性为：细胞球形或卵圆形，0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，在液体培养基中呈成对或短链；不生芽孢；革兰氏阳性；有时以鞭毛运动；没有明显的荚膜；兼性厌氧；化能异养，发酵代谢；可发酵的碳水化合物范围广泛，主要产L(+)-乳酸，但不产气，最终pH 4.2～4.6，营养需要复杂；接触酶阴性；通常在10～45℃能生长，最适37℃，在pH 9.6、6.5％NaCl中和40％胆碱中也能生长；很少还原硝酸盐；通常发酵乳糖；通常为Lancefield血清D群。培养基可以为MRS培养基，配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，调节pH 5.5～6.7，115℃条件下灭菌20分钟；其中，金属离子混合液的配方是：乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，pH 5.5～6.7，固体加琼脂粉1.5～2.0％。培养条件为：pH 5.5～6.7，温度30～42℃。

实施例2粪肠球菌SRG特性的研究

1材料与方法

1.1试验材料

粪肠球菌：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010046；大肠杆菌O₁、鸡金黄色葡萄球菌-C56011：均购自中监所；

试验仪器：电子天平、水浴锅、微波炉、双目显微镜、干燥器、高速冷冻离心机、水平离心机、垂直净化工作台等。

1.2试验方法

1.2.1革兰氏染色法

蘸取稀释液于MRS琼脂平板划线接种，分别采用需氧、焦性没食子酸法及烛缸法，在37℃培养箱中恒温培养24h.每种方法均挑取5个典型菌落做革兰氏染色，镜检，并做纯培养。

1.2.2产酸性能的测定

将试验菌株在MRS液体培养基中37℃厌氧培养24h，同时做空白，设3个重复，用无菌注射器取3mL发酵液于10mL离心管，用酸度计测其pH值。

1.2.3耐酸性试验。

取发酵24h的菌液10mL，3000rpmin离心15min，弃上清，将菌体用生理盐水洗涤3次，先加入生理盐水5mL，10mol/L的盐酸调节粪肠球菌的菌悬液的pH值分别为2.0、3.0、4.0，然后用生理盐水定容至10mL，于37℃处理2h。取菌悬液，在平皿上作菌落计数，从而计算出粪肠球菌的存活率，以pH 5.5～6.0的菌液为对照。存活率(％)＝待测pH的菌液活菌数/pH5.5～6.0的菌液活菌数×100％。

1.2.4体外抑菌试验

双碟的制备：取直径90mm的平底双碟，注入灭菌的营养琼脂(1.5％v/v)15mL，水平放置使之凝固，作为底层，另取营养琼脂(浓度为0.8％，冷至50℃左右)与37℃24h培养的指示菌液适量(50mL培养基加2mL左右)混匀，取6mL铺在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。

加样品：用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的粪肠球菌菌液(300μL)，每个样品三个重复。将加完样的双碟小心放入37℃恒温箱内，培养15h后(以金黄色葡萄球菌和鸡大肠杆菌O₁作指示菌)取出测量抑菌圈直径。

1.2.5胆盐对粪肠球菌存活的影响

菌液按5％(v/v)接种于胆盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％(w/v)的MRS培养基中，以不加胆盐的MRS培养基为对照，在37℃条件下培养10min后，取样进行平板菌落计数，计算粪肠球菌存活率。

1.2.6粪肠球菌粘附试验

粪肠球菌对胃肠道粘液黏附力的测定

粘液制备：打开动物腹腔，无菌取空肠回肠，分别用1mL无菌NSS液冲洗肠腔3次，剪开，每部分取1～2g粘液，-20℃保存备用。

粪肠球菌的粘附：取12孔或24孔细胞培养板，实验组各加0.5mL或0.25mL粘液，每种粘液平行3个孔，4℃过夜固定。然后每孔加1.0mL或0.5mLNSS液洗涤2次，除去未粘附的粘液，每孔加等量0.5mL或0.25mL标记菌悬液。另以0.5mL或0.25mL标记菌悬液作阳性对照，28℃孵育2h。除阳性对照外，再用1.0mL或0.5mL NSS洗去未粘附细菌。

计数：将吸出的悬液和每次的洗涤液都装入小离心管中，以备计数。菌体计数采用梯度稀释的方法，计算出未粘附的总菌量，最后计算出该菌粘附的百分率。

2结果

2.1菌株的形态学观察

3种方法经37℃培养24h，均生长出乳白色、隆起、湿润光亮、边缘整齐的小菌落，但需氧培养的菌落明显小于厌氧法及CO培养法。革兰氏染色为阳性，卵圆形球菌，端头，呈“枣核状”，菌体单个，2～3个存在，并有6～7个菌体短链状。

2.2菌株pH值的测定：结果见表8。

表8粪肠球菌发酵液的pH值

从表8可以得出，此株粪肠球菌的产酸性能是比较强的。

2.3耐酸性试验：结果见表9。

表9粪肠球菌耐酸性试验结果

由表9可以得出，所分离的粪肠球菌在pH 2.0、3.0、4.0时的存活率分别为51.0％、87.2％、98.4％，说明该菌具有较强的耐酸性。

2.4菌株的体外抑菌试验：结果见表10。

表10粪肠球菌原液的抑菌圈直径单位：mm

由表10可以得出，该菌株对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O₁都有较强的抑制作用，抑菌圈平均直径达到20mm和18mm左右。

2.5胆盐对粪肠球菌存活的影响：结果见表11。

表11胆盐对粪肠球菌的影响

从表11可以得出，在MRS培养基中，胆盐对粪肠球菌的影响比较小，胆盐浓度为0.3％时的存活率仍能达到22.1％。

2.6粪肠球菌粘附试验：结果见表12。

表12粪肠球菌粘附试验

由表12可以看出，该株粪肠球菌的粘附率能达到79.9％，说明该菌株的粘附性能比较强的。

3结论

正常菌群是指正常人和动物的体表或体内常在的菌群，它们的种类、数量很多。在正常情况下，与宿主、环境三者之间形成一个动态平衡的微生态系统，与宿主的生长、发育、物质代谢、衰老等有密切关系。某些益生菌可通过人为地添加，重建动物体的部分微生态环境，以达到促进消化吸收、提供营养素、调节免疫功能抵御病原菌侵入的目的，这些作用的产生取决于益生菌是否能够粘附于宿主的特定部位，进而在该部位定植。

本试验表明，该株粪肠球菌既具有较强的定植能力，又能够对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生较好的抑制作用，因此它可以作为优良粪肠球菌微生态制剂的开发菌株。

实施例3制备生物脱霉剂

步骤如下：

(1)发酵：

(i)菌种：选用粪肠球菌Enterococcus faecalis SRG CCTCC M 2010046；

(ii)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃培养24h；

(iii)一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接2环于80mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12h，制得一级种子液；

(iv)扩大培养：以5％(v/v)的接种量，将一级种子液接于800mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养8h，制得二级种子液；

(v)发酵罐培养：以5％(v/v)的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，静置培养16h；

(vi)收集发酵产物：待步骤(v)之发酵液黏度达130000cP时，收集发酵液；

上述步骤(iii)、(iv)所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，调节pH 6.0，115℃条件下灭菌20分钟；步骤(ii)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5％的进口琼脂粉；步骤(v)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，调节pH 6.0；其中，金属离子混合液的配方是：乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，pH 6.0。

(2)取水合硅铝酸盐，与步骤(1)中得到的发酵液混合，得复配液，即为生物脱霉剂，混合后，水合硅铝酸盐的质量浓度为0.08％；

(3)将步骤(2)中得到的复配液加入到饲料中，混合均匀。使用时，根据具体情况添加到饲料中：当需要预防饲料霉变时，其添加量为饲料重量的0.05～0.10％，当需要清除霉菌毒素时，其添加量为饲料重量的0.10～0.20％。

实施例4生物脱霉剂体外吸附效果：

在霉变饲料中加入本发明的实施例3制备的生物脱霉剂之后，结果见表13，可以看到，各试验组中的AFB1均被不同程度地吸附，其中添加2.00‰的生物脱霉剂组对AFB1的吸附率在99.75％以上，饲料中的黄曲霉毒素基本上已经被完全吸附，而添加1.50‰的生物脱霉剂组对AFB1的吸附率高达98.05％，脱霉效果非常显著。

表13生物脱霉剂体外吸附AFB1试验

实施例5生物脱霉剂体内脱毒效果：

(一)全收粪试验检测霉必吸对AFB1的脱毒效果

为了检测霉必吸对黄曲霉毒素B1(AFB1)的脱毒性能，采用全收粪法检测了动物食用霉变饲料后，被霉必吸吸附而随之排除体外的黄曲霉毒素B1占食入总量的比例，以此确定霉必吸的脱毒效果。

1试验材料与试验动物

霉变玉米：玉米粉于25℃～30℃，水分含量为15％的条件下发霉3～5天，60℃烘干，粉碎。

实验动物：选用体重相近、采食正常、健康的蛋鸡作为实验动物，供试鸡分为3组，每组4只(设4个重复)。

手术缝合针、线、强饲器、50mL塑料收粪瓶

2试验方法

2.1试验进程

试验分为预试期、正试期以及体况恢复期三个阶段，正试期包括禁食排空、强饲和粪尿排泄物收集三个过程，其进程见表14。

表14饲喂时间和饲喂方法

2.2排泄物的收集与处理

强饲后立即装好集粪瓶，以重复组为单位收集48h的排泄物，1～2h收集一次，排泄物取出后于60℃烘干，室内回潮24h，称重，作为每个重复组鸡的平均风干排泄物总量，粉碎，过40目筛，混合均匀后装入取样袋内封存。

2.3AFB1的提取与含量测定

按照GB样品脂肪含量≤3％的AFB1提取方法进行提取。AFB1的含量使用AFB1检测试剂盒(北京市营养源生物研究所)测定，操作方法依照说明书。

3试验结果

表15生物脱霉剂体内吸附AFB1试验

表16不同组别AFB1排出率的比较

如表15、16所示，空白对照组粪便AFB1的总量占霉变玉米中AFB1总量的38.2％，有大量的AFB1没有随粪便排出而残留在动物体内。霉变玉米中加入1‰的生物脱霉剂之后，50.44％的AFB1随粪便排出体外。霉变玉米中加入2‰的生物脱霉剂效果最好，AFB1的排出率达72.3％，脱霉效果显著。

生物脱霉剂将生物脱酶和物理吸附结合起来，显著调高了霉菌毒素随粪便的排出率。

基于上述的实验，本发明的发明人建议使用本发明的生物脱霉剂的使用添加量如下：

按照1.0‰的比例添加，可以吸附饲料中不容易被肉眼察觉的微量霉菌毒素，达到预防霉菌毒素中毒的目的；而对于轻度霉变的饲料，添加1.5‰的生物脱霉剂，可以达到防霉脱毒的效果，预防家畜食用霉变饲料后中毒；中度以上能够用肉眼发觉霉变严重的饲料，应当先将霉变饲料分散，降低霉菌毒素的浓度，再添加2.0‰的生物脱霉剂进行脱毒。

(二)霉必吸对维生素吸附性的检测

为了检测霉必吸对饲料中维生素类物质的影响，考虑本实验室的实际情况，选择维生素C作为检测对象，测定霉必吸对V_C的吸附性。

1试剂与仪器

6％(v/v)冰乙酸、0.5％(g/v)淀粉指示液、0.1mol/L碘标准液

仪器设备为普通实验室设备

2测定方法

称取试样0.2g(准确至0.0002g)，加新煮沸过的冷水100mL与冰乙酸溶液10mL使其溶解，加入霉必吸1.0‰组和2.0‰组，并设立空白对照组，180rpm摇床放置1h，加淀粉指示剂1mL，立即用0.1mol/L碘标准液滴定，至溶液蓝色在30s内不退。

试样中维生素C的含量质量分数按下面公式计算。

Claims (5)

1.一株能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌，其特征在于：该菌种命名为Enterococcus faecalis SRG，已与2010年03月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2010046。

2.根据权利要求1所述的能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌，其特征在于：其生物学特性如下：细胞球形或卵圆形，0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，在液体培养基中呈成对或短链；不生芽孢；革兰氏阳性；有时以鞭毛运动；没有明显的荚膜；兼性厌氧；化能异养，发酵代谢；可发酵的碳水化合物范围广泛，主要产L(+)-乳酸，但不产气，最终pH 4.2～4.6，营养需要复杂；接触酶阴性；通常在10～45℃能生长，最适37℃，在pH 9.6、6.5％NaCl中和40％胆碱中也能生长；很少还原硝酸盐；通常发酵乳糖；通常为Lancefield血清D群。

3.权利要求1所述的能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌在吸附霉变饲料中含有的霉菌毒素中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用涉及的方法步骤如下：

(1)发酵：选用粪肠球菌Enterococcusfaecalis SRG CCTCC M 2010046，发酵，发酵培养基MRS培养基，培养条件为：pH 5.5～6.7，温度30～42℃；得发酵液；

(2)取水合硅铝酸盐，与步骤(1)中得到的发酵液混合，得复配液，混合后，水合硅铝酸盐的质量浓度为0.05～0.10％；

(3)将步骤(2)中得到的复配液加入到饲料中，混合均匀，预防饲料霉变时，其添加量为饲料重量的0.05～0.1％，清除霉菌毒素时，其添加量为饲料重量的0.10～0.20％。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述发酵的具体步骤如下：

(i)菌种：选用粪肠球菌Enterococcus faecalis SRG CCTCC M 2010046；

(ii)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在30～42℃培养20～28h；

(iii)一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接1～3环于50mL～100mL种子液体培养基中，在30～42℃条件下，静置培养10～14h，制得一级种子液；

(iv)扩大培养：以5％的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在30～42℃条件下，静置培养5～12h，制得二级种子液；

(v)发酵罐培养：以5％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于30～42℃条件下，静置培养12～20h；

(vi)收集发酵产物：待步骤(v)之发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液；

上述步骤(iii)、(iv)所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，调节pH 5.5～6.7，115℃条件下灭菌20分钟；步骤(ii)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉；步骤(v)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L，调节pH 5.5～6.7；其中，金属离子混合液的配方是：乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，pH 5.5～6.7。