CN102899276B - 一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，其分类命名为：嗜热链球菌BLST（Streptococcus thermophilus BLST），已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M 2012282。经试验证明，本发明的嗜热链球菌具有降胆固醇的作用，所以该菌株可以作为或用于制备降胆固醇的药物或保健品。具体应用时，可以培养嗜热链球菌BLST，得发酵产物，即为降胆固醇的保健品，该发酵产物也能够作为制备降胆固醇的药物或保健品的原料。本发明还提供了一种具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂，菌制剂百奥脂乐是由以下原料组成的：山楂，灵芝孢子粉，红曲米粉，低聚果糖，低聚木糖，嗜热链球菌BLST菌粉，植物乳杆菌LP-11菌粉。

Description

一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用。 

背景技术

胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，尤以脑及神经组织中最为丰富，不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的原料，胆固醇在体内有着广泛的生理作用。但是，现在随着人们生活水平的提高，高胆固醇含量膳食的摄入也逐渐增多，但随之而来的负面影响却是动脉粥样硬化、冠心病、高血压等心脑血管疾病的发病率不断提高。高脂血症是动脉粥样硬化和冠心病的主要原因，每年动脉粥样硬化、冠心病、高血压等心脑血管疾病的发病率不断提高。目前，心血管疾病已成为引起人类死亡的主要杀手，血清中的胆固醇则被认为是诱发冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的重要因素。因此，降低血清中胆固醇的水平直接关系到人类的健康，人体胆固醇浓度与膳食脂质摄入之间有着密切的关系，因此降低食品中的胆固醇关系到人类的健康与长寿。 

目前，降胆固醇的药物有：（1）主要降总胆固醇兼低密度脂蛋白的药物：主要是他汀类和胆汁酸螯合剂，如：洛伐他汀、辛伐他汀，消胆胺、降胆宁，主要是竞争抑制合成胆固醇的限速酶和加速胆汁酸的利用等；（2）降甘油三酯兼极低密度脂蛋白的药物：烟酸类和苯氧酸类，能降低甘油三酯在肝中合成；抑制低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）的合成，减少高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的分解；（3）综合调脂类：主要是一些中药制剂。这些药物或多或少的有不良反应，最常见的是胃肠道副反应。因此，寻找一种能够长期使用而且无不良反应的食品或者保健食品是研究工作者和患者所期盼的。 

国外研究表明，许多乳酸菌在体内和体外都有降低胆固醇的功效。美国和国内的营养和医学专家推荐食物胆固醇的摄入量标准为不超过250～300mg/d·人。随着人民生活水平的提高和膳食营养的增加，胆固醇的摄入量很容易超标。因此研究不限饮食、不影响食品风味、经济实用的降低食品及人体血清胆固醇水平的方法已成为当前重要的研究课题。乳酸菌大量存在于酸乳及其它相关发酵乳制品中。20世纪70年代，科学家先后通过对大量饮用酸乳等发酵乳制品的非洲Massai人血清胆固醇的研究，对新生儿的研究，对常饮酸乳的美国人的调查以及直接对酸乳的研究等，均发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。大量临床试验证实，服用乳酸菌及其相关制品对降低血清胆固醇水平有很好的效果。国内外的学者普遍认为，乳酸菌去除胆固醇的机制有以下几种：(1)与胆固醇共沉淀作用；(2)乳酸菌的同化作用（菌体的吸收）（3）胆固醇掺入菌体细胞膜；（4）菌体产生胆固醇氧化酶或其他酶系，直接在体外使胆固醇降解。本研究旨在筛选降胆固醇能力强、能够耐酸、耐胆盐、并能够在肠道存活的乳酸菌。 

乳酸菌是一种可以分解糖类产生乳酸的厌氧、兼性厌氧、无芽孢革兰氏阳性菌。乳酸菌中的嗜热链球菌被认为是“公认安全性（GRAS）”成分，广泛用于生产重要的乳制品发酵，如酸奶和奶酪。其对机体具有重要的生理功能：在其生长代谢过程中能产生β-半乳糖苷酶降低乳糖不耐症的发生，产生的乳酸降低肠道pH，促进肠蠕动防止病原菌定植，抑制病原菌的生长；发酵过程中产生胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS），增加酸奶粘度；缩短酸奶的凝乳时间等等。但大多数乳酸菌不能耐受胃酸和肠道中的胆盐，作为能够降低胆固醇的乳酸菌必须通过人体的胃肠道，才能发挥降胆固醇的作用。发明人根据这些特点对乳酸菌进行分离，从而筛选出一株性能优越的微生态制剂生产菌种。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用，并提供了一种具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，其分类命名为：嗜热链球菌BLST（Streptococcus thermophilusBLST），已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2012282。 

所述嗜热链球菌的菌种生物学特性如下：该菌种的细胞大小通常为（0.4μm~0.7μm）×(1.0μm~6.0um），球状，部分散在、对生，前期为链状，染色均匀，无荚膜，无鞭毛，能运动；培养基上的菌落圆形，表面乳白色，革兰氏阳性，接触酶阴性，O/F发酵试验产酸；能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖产酸，生长温度最高值为42~45℃，10℃以下不生长。 

经试验证明，所述嗜热链球菌具有降胆固醇的作用，所以该菌株可以作为或用于制备降胆固醇的药物或保健品。具体应用时，可以培养嗜热链球菌BLST，得发酵产物，即为降胆固醇的保健品，该发酵产物也能够作为制备降胆固醇的药物或保健品的原料。 

所述培养嗜热链球菌BLST的具体过程如下： 

（ⅰ）菌种：选用嗜热链球菌BLST； 

（ⅱ）斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃～42℃培养26～30h； 

（ⅲ）一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种用接种取两环于50mL～100mL种子液体培养基中，在37℃～42℃条件下，静置培养20～24h，制得一级种子液； 

（ⅳ）扩大培养：以3%的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37～42℃条件下，静置培养20～24h，制得二级种子液； 

（ⅴ）发酵罐培养：以3%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37～42℃条件下，静置培养30～36h； 

（ⅵ）收集发酵产物：待步骤（ⅴ）的发酵液的pH值降到4.5以下，收集发酵液； 

（ⅶ）发酵结束后，立即将发酵液12000转/min离心，得菌泥，向菌泥加保护剂，真空冻干，粉碎得菌粉；所述保护剂的组成及用量为：脱脂奶粉20%，蔗糖8%，甘油1%，均为相对于菌泥质量的百分数； 

上述步骤（ⅲ）、（ⅳ）、（ⅴ）中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，使用时，调节pH至6.0～6.5，在115℃条件下灭菌20min；步骤（ⅱ）所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0%的琼脂粉。 

一种具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂，其特征在于：菌制剂百奥脂乐是由以下原料组成的：山楂58～62%（商品名称：山楂，实验室浓缩烘干；生产厂家：泰安绿地大药房），灵芝孢子粉6～10%（商品名称：灵芝孢子粉，实验室破壁处理；生产厂家：泰安凤凰灵芝生物科技有限公司），红曲米粉1.0～2.0%（商品名称：红曲米粉；生产厂家：山东巨野晨农天然产物有限公司），低聚果糖18～22%（商品名称：低聚果糖；生产厂家：郑州弘益泰化工产品有限公司），低聚木糖4～6%（商品名称：低聚木糖；生产厂家：山东龙力生物科技有限公司），嗜热链球菌BLST 2×10⁸cfu/g，植物乳杆菌LP-112×10⁸cfu/g（该菌株命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M 2010150，记载在中国专利申请CN201010240725.X中），各组分按质量百分比；嗜热链球菌和植物乳杆菌以菌粉的形式加入，菌粉质量要根据冻干菌粉的活菌数来计算，加入冻干菌粉后各组分的质量分数之和不足100%时，由奶粉（商品名称：奶粉；生产厂家：内蒙古伊利实业集团股份有限公司）补足至100%，制备时，将各组分混合均匀即可。 

所述植物乳杆菌是以菌粉的形式加入和存在的，其制备方法记载在中国专利申请CN201010240725.X中。 

所述嗜热链球菌BLST是以菌粉的形式加入和存在的，制备菌粉的具体过程同上。 

本发明的具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，为经过筛选得到的菌种，其降胆固醇能力强，效果好，可以用于制备降胆固醇的药物或保健品。本发明的具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂（称为百奥脂乐），比单一的中药组方、合生元效果显著，比市售国药准字号产品降脂宁、血脂康效果显著，是一个降低总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）效果很好的产品，此产品的原料皆为药食两用的，无毒副作用，无不良反应，是高血脂患者可以长期服用的最佳产品。 

附图说明

一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，其分类命名为：嗜热链球菌BLST（Streptococcus thermophilusBLST），已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2012282，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编：430072。 

图1：四株菌在降胆固醇培养基中发酵40h后的效果图，其中，（a）：菌株BJLY发酵前后降胆固醇效 果图；（b）：菌株LP发酵前后降胆固醇效果图；（c）：菌株R3发酵前后降胆固醇效果图；（d）菌株BLST发酵前后降胆固醇效果图。 

图2：菌株BLST和R3降胆固醇培养基中发酵40h后计数平板示意图，其中，（a）：菌株R3接到降胆固醇的培养基中，37℃发酵40h后，用平板稀释计数法计数，稀释度为10⁶上37℃培养48h的乳酸菌生长情况，从图中可以看出：在10⁶上乳酸菌未见菌落生长；（b）：菌株R3稀释度为10⁷乳酸菌未见菌落生长；（c）：菌株BLST接到降胆固醇的培养基中发酵40h后计数，稀释度为10⁶，37℃培养48h后未见菌落生长；（d）菌株BLST稀释度为107，37℃培养48h后未见菌落生长； 

图3（a）：菌株BLST降胆固醇培养基中发酵40h后，镜检涂片；图3（b）：菌株BLST吸附胆固醇后用无水乙醇处理后，镜检涂片；试验结果表明：菌体在胆固醇培养基中显微镜下未见游离的菌体，菌体外包裹着胆固醇，都与胆固醇结合形成一个个大的颗粒，在平板计数时菌体从外界吸收不到营养而未生长。经无水乙醇处理后，胆固醇溶解，露出菌体。这说明菌体与胆固醇有吸附作用。 

图4：吸附胆固醇后转入新鲜培养基中培养40h后镜检涂片；试验结果表明：将吸附胆固醇的菌体接入新鲜的未加胆固醇的培养基中，胆固醇可以释放到培养基中露出菌体，这可能是菌体细胞膜能够调节膜内外浓度差的作用。 

图5：各试验组对试验大鼠采食的影响。 

图6：各试验组对试验大鼠体重的影响。 

图7：各试验组TC比较图。 

图8：各实验组TG比较图。 

图9：各试验组HDL-C的比较图。 

图10：各实验组LDL-C的比较图。 

图11：各实验组TC比较。 

图12：各实验组TG比较图。 

图13：各实验组对HDL-C比较图。 

图14各实验组LDL-C比较图。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。 

实施例一、菌种的分离鉴定 

随着人们生活水平的提高，高胆固醇含量膳食的摄入也逐渐增多，随之带来的高脂血症、冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病已经严重危害到人体健康。人体内胆固醇获得的途径有外源摄取和内源合成，如何减少外源摄取胆固醇摄入量、降低人体血清胆固醇水平的研究越来越受到广泛关注。除了限制饮食外， 国内外的科学家研究表明，乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用，采用益生菌来降低胆固醇无毒无副作用、可长期安全食用，是解决人类心血管疾病的一条新途径。 

1材料与方法 

1.1试验材料 

酸奶、泡菜：购自泰安市中百超市。 

基础培养基：MRS培养基，筛选培养基：MRS加入2%碳酸钙。 

体外降胆固醇培养基：用无水乙醇将固态胆固醇（真空干燥箱干燥至恒重）和猪胆盐溶解，配成质量浓度为15mg/mL的胆固醇酒精溶液（含4.5%的猪胆盐），将胆固醇酒精溶液和新鲜配制的MRS溶液按1:14的比例配成约含0.1%胆固醇MRS培养基（含0.3%的猪胆盐），115℃高压蒸气灭菌20min，冷却后置4℃冰箱备用。 

试验仪器：电子天平、水浴锅、微波炉、双目显微镜、高速冷冻离心机等。 

1.2试验方法 

1.2.1菌种的分离、筛选、培养。无菌取分离物（酸奶、泡菜）1g，加入到盛有100mL灭菌生理盐水中，震荡摇匀，然后用接种环蘸取溶液于MRS碳酸钙琼脂平板划线接种，在37℃培养箱中恒温培养24h，再挑取有钙圈的菌落继续划线，37℃培养箱中恒温培养24h，挑取钙圈明显的单菌落保存到试管斜面上，做革兰氏染色，镜检。 

1.2.2种子液制备：将上述步骤1.2.1分离、筛选的菌种斜面，用接种环分别刮取两环于50-100mLMRS基础培养基中，37℃培养24h，得发酵液，备用。 

1.2.3耐酸试验：用HCl将生理盐水的pH值调至1.8，115℃，灭菌20min。分别取种子液1mL分别加入已灭菌pH值1.8的生理盐水，37℃条件下培养20min，取样测定活菌数，以最初的接入的菌液作为对照，计算其30min后的存活率。 

1.2.4耐胆盐试验：基础培养基中添加0.3%的猪胆盐，灭菌，接种量为2%，37℃培养1h后计数，以种子液的活菌数为起始菌数，计算其存活率。 

1.2.4模拟人工胃液试验：种子液按2%（v/v）接种于模拟胃液中，在37℃条件下培养，分别在30min取样，平板菌落计数，以种子液作为对照，将计数结果取对数。人工胃液配制：依照中国药典2010版附录。 

1.2.6模拟人工肠液试验：种子液按2%（v/v）接种于模拟肠液中，在37℃条件下培养0h、0.5h、1h取样，平板菌落计数，以种子液作为对照，将计数结果取对数。人工肠液配制：依照中国药典2010版附录。 

1.2.7降胆固醇能力筛选：将各菌株活化2～3次，分别接种到MRS培养基中，37℃培养24h，按2%(V/V)接种量接种于降胆固醇筛选培养基中，摇匀后立即取样2mL，4000rpm离心5min，取上清液用邻苯二甲醛比色法，测定胆固醇含量，37℃静置培养40h后，用同样方法测定上清中胆固醇含量，并计算培养基中胆 固醇的清除率，重复试验三次求平均值。 

1.2.8胆固醇含量测定采用直接离心邻苯二甲醛法（0PA法）。 

1.2.9胆固醇脱除率的计算：胆固醇的脱除率（%）=胆固醇降解量/发酵前胆固醇含量×100%。 

1.2.10菌种鉴定试验（生化试验）按GB/T4789.35-2010，伯杰氏细菌鉴定手册，配制糖发酵培养基，将纯培养菌分别穿刺接种，同时进行氧化及触酶试验，产酸产气等试验，37℃培养2d。 

2结果与分析 

2.1形态观察从酸奶中分离纯化的5株乳酸菌和从泡菜中分离纯化的22株乳酸菌经37℃，24h培养均生长出乳白色、隆起、边缘整齐的小菌落，但需氧培养的菌落明显小于厌氧法。革兰氏染色为阳性，球菌、链球菌及杆菌。 

2.2耐酸试验结果对分离纯化的27株乳酸菌进行耐酸试验，有6株表现出来良好的耐酸性，BLS3菌株的耐酸性最好，在pH值1.8的生理盐水中30min其存活率达到了20.5%，BLST和BLP5次之，分别为9.2%和5.6%，其余的3菌株都在2%以上。 

2.3耐胆盐试验结果将分离纯化好的菌株以2%的接种量接种到含0.3%的猪胆盐的培养基，37℃培养1h后计数，其存活率结果表明有5株乳酸菌有较好的耐胆盐能力，其中BLST耐胆盐能力最好存活率为56.8%，其次为BLS3、BLP2、BLP5、BLP8，其存活率分别为43.5%、40.2%、38.4%、30.7%。 

结合这几株的耐酸和耐胆盐试验结果，确定BLS3、BLST、BLP5三个株菌作为后备菌种，进行下一步的试验筛选。 

2.4模拟人工胃液试验三株菌的模拟人工胃液试验的结果见表1。 

表1三株菌的耐受人工胃液试验结果（单位：1g cfu/mL）                                                   

试验结果表明，在模拟人工胃液中，30min后菌株BLST活菌数的对数值高于BLP5和BLS3，其数量级在104。 

2.5模拟人工肠液试验三株菌的耐受人工肠液试验结果见表2。 

表2三株菌的耐受人工肠液试验结果（单位：1g cfu/mL）    

试验结果表明：三株菌在人工肠液中2h存活率都很高，其中以菌株BLST与0h的活菌数数量级没有减少，这株菌能够在人工肠液中存活并生长，BLS3、BLP5的活菌数的数量级有所下降，分别下降了2个 数量级，这两株菌在人工肠液中长期存在会有大量的死亡。 

2.6降胆固醇的能力筛选三株菌对胆固醇的清除能力试验结果见表3。 

表3三株菌对胆固醇的清除能力试验结果（单位：1g cfu/mL）    

试验结果表明：降胆固醇能力比较最强的是BLS3达到90%以上，其次是BLST，胆固醇的降解能力也达到89%以上，BLP5最差为49.1%。 

通过对三株菌模拟人工胃液试验、模拟人工肠液试验及降胆固醇的能力比较试验，最终确定能够耐受人工胃液、人工肠液的菌株BLST为最佳菌株，其降胆固醇的能力也较强。 

2.7生化鉴定试验结果菌株BLST的生理生化鉴定试验结果见表4。 

表4菌株BLST的生理生化鉴定试验结果    

试验结果表明，BLST与嗜热链球菌的生化特性相一致，依据伯杰氏手册，初步鉴定为嗜热链球菌，命名为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，对其进行保藏，于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2012282。经连续培养传代和对比试验，该菌株的分类学形 状、形态特征等理化形状未发现可见变化，说明该菌株的形状稳定遗传。 

实施例二、菌种的理化性质分析 

1材料与方法 

1.1菌种：嗜酸乳杆菌1.2467、植物乳杆菌LP、嗜热链球菌BLST（实施例一分离）、嗜热链球菌1.1855、罗伊氏乳杆菌6126、鼠李糖乳杆菌6133、保加利亚乳杆菌BJLY（山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院分离）、嗜酸乳杆菌R3（山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院分离）。 

1.2试剂：胆固醇（分析纯），冰醋酸，硫酸，邻苯二甲醛，正己烷，氢氧化钾等为分析纯；胆盐（生化试剂），吐温-80、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨，醋酸钠、柠檬酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁。 

1.3培养基：MRS培养基 

体外降胆固醇培养基的配制：用无水乙醇将固态胆固醇（真空干燥箱干燥至恒重）和猪胆盐溶解，配成质量浓度为15mg/mL的胆固醇酒精溶液（含4.5%的猪胆盐），将胆固醇酒精溶液和新鲜配制的MRS溶液按1:14的比例配成含0.1%胆固醇MRS培养基（含0.3%的猪胆盐），115℃高压蒸气灭菌20min，冷却后置4℃冰箱备用。 

1.4试验方法 

1.4.1种子液制备：取活化好的菌种斜面，用接种环分别取两环于50-100ml MRS基础培养基中，37℃培养24h，得种子液，备用。 

1.4.2耐酸试验：用HCl将生理盐水的pH值调至1.8，115℃，灭菌30min。分别取种子液1mL分别加入已灭菌pH值1.8的生理盐水，37℃条件下培养1h，取样测定活菌数，以最初的接入的菌液作为对照。 

1.4.3耐胆盐试验：培养基中添加0.3%的猪胆盐，灭菌，接种量为2%，37℃培养3h后计数，以种子液的活菌数为起始菌数，将活菌数取对数。 

1.4.4模拟人工胃液试验：菌液按2%（v/v）接种于模拟胃液中，在37℃条件下培养，分别在0.5h、1.0h、2.0h、3.0h取样，平板菌落计数，以种子液作为空白对照。人工胃液配制：依照中国药典2010版附录。 

1.4.5模拟人工肠液试验：菌液按2%（v/v）接种于模拟肠液中，在37℃条件下培养0h、2h、4h、6h、8h取样，平板菌落计数，以种子液作为空白对照。人工肠液配制：依照中国药典2010版附录。 

1.4.6降胆固醇菌种的筛选：将各菌株活化2～3次，分别接种到MRS培养基中，37℃培养24h，按3%（V/V)接种量接种于降胆固醇筛选培养基中，摇匀后立即取样2mL，4000rpm离心5min，取上清液用邻苯二甲醛比色法，测定胆固醇含量，37℃静置培养40h后，用同样方法测定上清中胆固醇含量，并计算培养基中胆固醇的清除率，重复试验三次求平均值。 

1.4.7胆固醇含量测定采用直接离心邻苯二甲醛法（0PA法）。 

1.4.8胆固醇脱除率的计算：胆固醇的脱除率（%）=胆固醇降解量/发酵前胆固醇含量×100%。 

2乳酸菌体外降胆固醇的试验 

2.1体外降胆固醇的试验设计 

试验菌株按4%接种于100mL约含100μg/mL胆固醇的MRS培养基中，37℃兼性厌氧培养40h。测定终pH值和活菌计数，4000rpm离心5min，上清液用于测定胆固醇含量，菌泥用于沉淀分析。以未接种的胆固醇含100μg/mL的MRS培养基作为空白对照。 

A、菌株对胆固醇的去除：未接种的对照离心液与试验上清离心液的胆固醇含量之差，即为被菌体去除的胆固醇； 

B、沉淀冲洗（测定沉淀于细胞外部的被去除胆固醇）：用5mL无菌水重悬菌泥，4000rpm离心5min，测定上清液胆固醇含量； 

C、将B的沉淀用无水乙醇重悬浮后，4000rpm离心5min，测定上清液胆固醇含量；空白发酵液中的离心清液和沉淀中的胆固醇含量之和减去发酵后三个上清液之胆固醇含量之和即为进入细胞内部的被去除胆固醇。 

D、重新培养：将吸附和吸收胆固醇的菌液2mL，4000rpm离心5min，加入5mL新鲜的不含胆固醇的MRS培养基中，混匀37℃培养40h，测定发酵液的含量，并计算其释放率。 

以下公式用于计算各部分胆固醇的含量： 

A、物理吸附的胆固醇（%）=d/（a-c）×100%； 

B、化学细胞吸附的胆固醇（%）=（e-b）/（a-c）×100%； 

C、细胞内的胆固醇（%）=〔（a+b）-（c+d+e）〕/（a-c）×100%； 

D、释放率（%）%=5f/2（d+e） 

a：未接种的培养基中离心清液中胆固醇浓度，μg/mL， 

b：未接种的培养基中离心沉淀中胆固醇浓度，μg/mL， 

c：发酵上清液中胆固醇浓度，μg/mL； 

d：去离子水重悬后离心清液的胆固醇浓度，μg/mL； 

e：乙醇处理后上清液中胆固醇浓度，μg/mL 

f：新鲜培养基中胆固醇的浓度，μg/mL。 

2.2灭活菌体对胆固醇的脱除试验 

灭活菌对介质中胆固醇的脱除作用：将发酵好的菌液，80℃处理40min，按4%的接种量接入高胆固醇液体培养基，37℃静止培养40h后，4000rpm离心5min，测定上清液中胆固醇含量、降胆固醇的脱除率。 

3乳酸菌清除胆固醇的影响因素 

3.1不同接种量对胆固醇降解率的影响 

将选育的菌株按不同的接种量分别以2%、4%、6%、8%接种于含1mg/mL胆固醇液体MRS培养基中，37℃恒温培养40h，测定并计算胆固醇的降解率。 

3.2不同浓度的胆固醇对胆固醇降解率的影响 

将选育的菌株按相同量接种于含0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL不同浓度胆固醇的MRS液体培养基中，37℃恒温箱培养，期间每隔12h震荡一次，40h后测定并计算胆固醇的清除率及pH值。 

3.3不同浓度胆盐对胆固醇脱除的影响 

在体外降胆固醇的培养基中分别加猪胆盐，使猪胆盐的含量分别是0.1%、0.2%、0.3%，37℃恒温箱培养，40h后测定并计算胆固醇的降解率。 

3.4不同胆盐对脱除胆固醇的影响 

在MRS培养基中分别加胆固醇胶束溶液，使培养基中胆固醇的含量为1mg/mL，胆盐分别为猪胆盐、牛胆盐、牛磺胆酸钠，胆盐含量皆为0.3mg/mL，121℃灭菌30min，冷却，取样6mL，4000rpm离心5min，分别测定未发酵培养基中胆固醇的含量；按4%接种量接乳酸菌，37℃培养40h后，测定发酵后发酵液中胆固醇的含量。 

3.5不同发酵时间对降胆固醇的影响 

活化好的菌株按4%的接种量，接种于含胆固醇1mg/mL、胆盐浓度为0.3%的培养基中，37℃培养，分别在12h、24h、32h、40h、48h、50h取样，分别测定胆固醇的清除率。 

3.6培养基灭菌时间对降胆固醇的影响 

降胆固醇培养基121℃灭菌时间设计为20min、30min，接种量4%，37℃培养40h后，测定发酵后发酵液中胆固醇的含量，计算胆固醇的清除率。 

4结果与讨论 

4.1乳酸菌的理化性质试验结果 

4.1.1八株菌的来源用途及形态学特征，见表5。 

表5八株菌的来源、用途、形态学特征    

4.1.2八株菌培养24h后发酵液的pH值及活菌数的对数值见表6。 

表6八株菌培养24h后发酵液的pH值及活菌数的对数（单位：1g cfu/mL）    

试验结果表明：以菌株LP发酵液的pH值最低，其次是sh6133、BLST，pH值都在4以下，再次为1.2467、L6126、1.1855，以R3和BJLY最高分别为4.41和4.54；同条件下培养24h，以菌株LP、1.1855、BLST、1.2467、sh6133、活菌数较高，数量级达到10⁹，菌株L6126、R3数量级稍低，数量级在10⁸，菌株BJLY的活菌数最低，数量级在10⁷。 

4.1.3八株菌的耐酸试验 

将液体种子以1%的接种量转入在pH值为1.8的生理盐水中37℃培养1h，计数，计数结果分别取对数，酸性溶液中的活菌数比原液中的活菌数即为其存活率，结果见表7。 

表7八株菌的耐酸试验结果（单位：1g cfu/mL）    

试验结果表明：菌株L6126的耐酸能力最强，在酸性溶pH1.8的溶液中1h其存活率为5.38%，其次是菌株R3存活率为1.82%，依次是菌株BLST、1.1855存活率为0.62‰和0.22‰，以SH6133和BJLY耐酸能力最差。 

4.1.4八株菌的耐人工胃液试验试验结果见表8。 

表8八株菌的耐受人工胃液试验（单位：1g cfu/mL）    

试验结果表明：八株菌在人工胃液中只有菌株L6126能够耐受，3h后活菌数对数为6.24，存活率为0.79‰；30min后，菌株L6126没有死亡现象，其余7株菌死亡率较高，菌株LP、BLST的存活率为0.23‰、0.11‰，R3和SH6133的活率最低都小于0.05‰，2h后除了L6126人工胃液中几乎没有活菌。 

4.1.5八株菌的耐胆盐试验 

培养基中添加0.3%的猪胆盐，灭菌，接种量为2%，37℃培养3h后计数，以种子液的活菌数为起始菌数，分别将计数结果取对数，胆盐溶液的活菌数比原液的活菌数即为存活率，结果见表9。 

表9八株菌的耐胆盐试验结果（单位：1g cfu/mL）    

试验结果表明：菌株L6126、菌株BLST和1.2467在胆盐溶液中培养3h后，活菌数存活率较高，分别是74.1%、45.0%、40.7%，说明这两株菌耐胆盐能力较强；而菌株BJLY、SH6133在胆盐溶液中活菌数存活的较少，分别是0.19‰和0.003‰，这两株菌耐胆盐能力较弱。 

4.1.6八株菌的耐受人工肠液试验试验结果见表10。 

表10八株菌的耐受人工肠液试验（单位：1g cfu/mL）    

试验结果表明：八株菌在人工肠液中6h存活率都很高，其中以菌株BLST、1.24671.1855、、LP四株菌比0h的活菌数有所升高，即这四株菌能够在肠液中存活并生长，BJLY、L6126、R3、SH6133四株菌有所下降，其中以R3存活率下降的最多。 

4.1.7八株菌对胆固醇的脱除率试验试验结果见表11、表12。 

表11八株菌对胆固醇的清除能力试验结果（单位：1g cfu/mL）    

由上表可以看出：降胆固醇能力比较最强的是BJLY，其次是LP＞BLST＞R3，再次是L6126、Sh6133，1.1855，以1.2467的降胆固醇能力最差。 

表12八株清除胆固醇后的pH值 

试验结果表明：8株菌正常发酵后的pH值和加胆固醇后发酵的pH值都有所不同，加胆固醇后发酵液的pH值都比原发酵液的pH值有所升高，这可能是乳酸菌在体外胆固醇培养基中生长代谢中的代谢产物乳酸、甲酸等小分子的有机酸与胆固醇结合而未游离出来导致培养基的pH值不能下降。 

小结：综合各菌株的耐酸、耐人工胃液，耐胆盐、耐人工肠液及去除胆固醇的能力试验结果，菌株BJLY虽然降胆固醇的能力比较强，但是其耐酸、耐胆盐能力极差，也不耐受人工胃液，因此不是最佳菌株。菌株L6126能够耐酸、耐胆盐，在人工胃液和人工肠液中也能够存活，但是其降胆固醇的能力较差，因此也不是最佳菌株；菌株R3降胆固醇的能力较好，但是在人工肠液中6h后活菌数量降低，因此也不是最佳菌株。只有菌株BLST和LP降胆固醇的能力较强，既能够耐酸、耐胆盐，在人工肠液中能够存活和生长，因此这两株菌为后备试验选择。 

另外：从本试验可知，在饭前或饭后30min以内服用乳酸菌制剂时可以通过胃肠道。 

4.2乳酸菌降胆固醇作用效果 

4.2.1体外降胆固醇的试验结果 

4.2.1.1发酵后发酵液终pH值为6.36，效果图见图1，发酵40h后计数，结果未计出，结果见图2。涂片镜检发酵液，结果见图3（a）、图3（b）。 

4.2.1.2吸附胆固醇后转入新鲜培养基中培养40h后镜检涂片，结果见图4。 

4.2.1.3发酵前后各部分的胆固醇的含量测定结果见表13。 

表13发酵前后测定各部分的胆固醇的含量（单位：μg/mL） 

注：发酵后沉淀e包括发酵前的沉淀b，也包括胆固醇渗透到菌体内的一部分。 

4.2.1.4菌体吸附和吸收胆固醇的含量及在发酵液中的释放率见表14。 

表14菌体对胆固醇的吸附和吸收及在发酵液的释放率 

由表13、表14和图3、图4试验结果可以得出：菌体降胆固醇有物理吸附和化学吸附及菌体吸收，其吸附率分别是3.82%、73.3%，菌体吸收率为22.9%，从而得知，乳酸菌降胆固醇的作用是以吸附和吸收为主，菌体吸附胆固醇后转入到新鲜的培养基中，能够从菌体表面释放，其释放率为19.3%。 

4.2.2.灭活菌液和菌体对去除胆固醇的影响 

将种子菌液发酵24h，将种子液与80℃水浴中处理40min，100mL/瓶分别接菌液4mL和8mL的菌泥，37℃培养40h，分别测定发酵前后胆固醇的含量及去除率。 

表15灭活菌液和菌体对脱除胆固醇的影响结果 

试验结果（表15）表明，灭活的菌体和菌液对胆固醇都有一定的清除除作用，可能是灭活菌体的细胞膜破裂释放出疏水性的基团更有利于吸附疏水的胆固醇所导致，8%的菌泥比4%的菌液的清除能力低，这可能是菌液中还有某种物质如有机酸、特殊酶系等对降胆固醇也有一定的作用。该结果与医学网中论文《罗氏乳杆菌无细胞上清液降胆固醇能力研究》试验结论一致。 

小结：通过对菌株BLST降胆固醇的作用效果研究可知：菌株降胆固醇主要是通过胆固醇与菌体的吸附和吸收作用，即共沉和同化作用；由灭活菌液和菌体对胆固醇脱除研究，说明了菌体具有清除胆固醇能力，从而说明菌体产生胆固醇氧化酶酶解胆固醇不是降胆固醇主要作用，发酵液中的代谢产物有机酸、酶等也有一定的作用。 

4.3乳酸菌降胆固醇影响因素试验结果 

4.3.1不同接种量对清除胆固醇的影响 

培养基中胆固醇浓度为1mg/mL、胆盐为0.3%，接种量分别为2%、4%、6%、8%，37℃培养40h，分别测定发酵前后胆固醇的含量。各接种量的去除胆固醇的能力试验结果如表16。 

表16不同接种量对脱除胆固醇的影响结果 

试验结果表明：不同的接种量对去除胆固醇有一定的影响，在接种量为2%~4%时，去除胆固醇的能力最强，随着接种量的增加，去除胆固醇的能力有所下降。这可能是接种量过高会抑制乳酸菌的生长。 

4.3.2胆固醇的浓度对清除率的影响 

在培养基中分别加胆固醇胶束溶液，使胆固醇浓度分别是0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL，胆盐含量0.3%，接种量皆为4%，37℃培养40h，分别测定发酵前后胆固醇的含量及去除率，结果见表17。 

表17不同浓度的胆固醇对脱除胆固醇的影响结果 

试验结果表明：乳酸菌清除胆固醇的能力随着浓度的增加而增加，胆固醇浓度达到1.5mg/mL，清除能力下降。这可能是高浓度的胆固醇抑制乳酸菌的生长的缘故。备注：本次试验培养基的灭菌时间为20min。 

4.3.3不同浓度胆盐对脱除胆固醇的影响 

在体外降胆固醇的培养基中分别加猪胆盐，使猪胆盐的含量分别是0%、0.1%、0.3%、0.5%，37℃恒温箱培养，40h后测定并计算胆固醇的降解率及pH。其测定结果见表18。 

表18胆盐不同浓度对脱除胆固醇的影响结果 

试验结果表明：乳酸菌清除胆固醇必须在胆盐存在的情况下，胆盐浓度为0%时，清除胆固醇的能力很弱，胆盐浓度在0%~0.3%之间是随着胆盐浓度的增加而升高，胆盐浓度0.3%时，胆固醇的清除是最高的79.2%，胆盐浓度为0.5%时就下降，这可能是高浓度的胆盐会抑制乳酸菌的升高。该结论与《乳液科学与技术》中《乳制品中具有降胆固醇功能乳酸菌的体外筛选》的结论一致。 

4.3.4不同胆盐对脱除胆固醇的影响 

表19不同胆盐对脱除胆固醇的影响结果 

试验结果（表19）表明：不同的胆盐对降胆固醇有一定的影响，培养基中加入牛黄胆酸钠时对胆固醇的脱清除率最大达到93.7%，其次是牛胆盐72.3%，再次是猪胆盐58.9%。此结论与2010年《食品工业科技》中《植物乳杆菌ST-Ⅲ菌株降胆固醇影响因素的研究》的结论一致。 

备注：本次灭菌温度是121℃，胆固醇浓度为1.5mg/mL。 

4.3.5乳酸菌在体外降胆固醇溶液中的生长曲线 

不同发酵时间对去除胆固醇的影响结果见表20，起初胆固醇含量914μg/mL。 

表20不同发酵时间的pH和对脱除胆固醇的影响结果 

试验结果表明：发酵从12h至24h，pH有所降低，但是从24h后，pH值处于一种稳定状态，发酵液中胆固醇的含量随着发酵时间的延长而降低，清除率随着发酵时间的延长而升高。 

5结论 

1、通过对八株菌的耐酸、耐胆盐、耐人工胃液和肠液的试验研究，得出八株菌的耐酸、耐胆盐的能力各不相同，有7株菌在人工胃液中1h后大量的死亡，只有菌株L6126能耐酸耐胆盐，又能够通过人工胃液和肠液；菌株BLST、LP相对具有较强的耐酸、耐胆盐能力及耐受人工胃液和肠液，且菌株BLST在人工 肠液中6h能够存活并生长；菌株BJLY、sh6133其耐酸耐胆盐能力最差。 

八株菌降胆固醇的能力比较：菌株BJLY降胆固醇的能力最强，37℃恒温箱培养40h后，其最高清除率能达到95%以上，其次是LP＞BLST＞R3清除率最高也达到90%以上。 

结合八株菌的耐酸、耐胆盐、耐人工胃液、耐人工肠液的试验研究结果及降胆固醇的能力试验，可以确定菌株BLST、LP即为生产最佳菌株，其中以BLST最佳。 

2、通过对菌株BLST降胆固醇的试验可知：菌株降胆固醇主要是通过胆固醇与菌体的吸附和吸收作用，即共沉和同化作用，其次是代谢产物有机酸、酶等也有一定的作用。 

3、菌体降胆固醇受到很多因素的影响，接种量、胆盐种类、胆盐浓度，胆固醇的浓度、发酵时间等，它随着发酵时间的延长而升高，接种量在2%~4%、猪胆盐浓度为0.3%、胆固醇浓度为1mg/mL、菌体对胆固醇的清除率最高，而不同的胆盐以牛磺胆酸钠对胆固醇的清除影响最大，清除率最高达到90%以上，清除率随着发酵时间的延长逐渐升高。 

4、随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，对乳酸菌保健作用的认识也日益加深，特别是它能够有效的降低饮食中的胆固醇，降低外原性胆固醇在体内的吸收，预防动脉粥样硬化、冠心病、高血压等深受人们的青睐。因此，高效降低外源性胆固醇的乳酸菌制品也大有市场价值可言。 

实施例三、发酵工艺的研究 

嗜热链球菌BLST发酵工艺的研究 

菌粉是通过以下步骤得到的： 

（ⅰ）菌种：选用嗜热链球菌BLST(Streptococcus thermophilus) 

（ⅱ）斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃培养28h； 

（ⅲ）一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下用接种环取两环接种于50mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养22h，制得一级种子液； 

（ⅳ）扩大培养：以3%的接种量，将一级种子液接于500mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养22h，制得二级种子液； 

（ⅴ）发酵罐培养：以3%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，静置培养32h； 

（ⅵ）收集发酵产物：待步骤（ⅴ）的发酵液的pH值降到4.0，收集发酵液； 

（ⅶ）发酵结束后，立即将发酵液12000rpm离心，菌泥加保护剂（脱脂奶粉20%，蔗糖8%，甘油1%）真空冻干，粉碎得菌粉。 

上述步骤（ⅲ）、（ⅳ）、（ⅴ）中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、 吐温-801mL/L，使用时，调节pH至6.0，在115℃条件下灭菌20min；步骤（ⅱ）所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5%的琼脂粉。 

实施例四、应用研究 

（一）百奥脂乐对高脂大鼠模型的功能研究 

1材料与方法 

1.1试验动物：健康雄性wistar大鼠（150~200g），60只（购于山东鲁抗动物试验中心，许可证号：SCXK（鲁）2008002。 

1.2高脂饲料配方 

78.8％基础饲料、1％胆固醇、10％蛋黄粉、10％猪油和0.2％胆盐。 

1.3仪器及试剂 

解剖器械，全自动生化分析仪（卓越330全自动生化分析仪），胆固醇、胆盐（安徽科宝生物工程有限公司），血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白HDL-C、低密度脂蛋白（LDL-C）测定试剂盒（购于南京建成生物工程研究所，批号：20111103）。 

1.4剂量设计与分组 

试验设四个剂量组和一个高脂对照组，一个空白组（模型组），以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，一个正常组，每组10只，受试样品时间30天，见表21。 

表21剂量设计与分组 

1.5百奥脂乐原料组成为：山楂59%（商品名称：山楂；生产厂家：泰安绿地大药房，实验室提取浓缩烘干），灵芝孢子粉8.5%（商品名称：灵芝孢子粉，实验室破壁处理；生产厂家：泰安凤凰灵芝生物科技有限公司），红曲米粉1.85%（商品名称：红曲米粉；生产厂家：山东巨野晨农天然产物有限公司），低聚果糖22%（商品名称：低聚果糖；生产厂家：郑州弘益泰化工产品有限公司），低聚木糖5.85%（商品名称：低聚木糖；生产厂家：山东龙力生物科技有限公司），嗜热链球菌BLST 2×10⁸cfu/g，植物乳杆菌LP-112×10⁸cfu/g（该菌株命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M 2010150，记载在中国专利申请CN201010240725.X中），各组分按质量百分比，菌粉质量要根据冻干菌粉的活菌数来计算，加入冻干粉后各组分的质量分数之和不足100%时，由奶粉（商品名称：奶粉；生产厂家：内蒙古伊利实业集团股份有限公司）补足至100%，制备时，将各 组分混合均匀即可。 

1.6试验步骤 

在试验环境下大鼠喂饲基础饲料观察7d，然后尾静脉采血，测定血清总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。根据血清总胆固醇（TC）水平，进行随机分组，在给予高脂饲料的同时给予不同剂量的受试样品，定期称量体重，于试验结束禁食16小时，称体重，尾静脉取血，水合氯醛麻醉解剖，取肝、脾、肾称重。 

1.7观察指标：试验过程记录大鼠体征、饮食、体重等，测血清TC，TG，HDL-C，LDL-C水平，肝、脾、肾指数。 

1.8数据分析：试验数据用SPSS13.0软件处理，计量资料以

表示，用t检验评价试验结果。 

2结果与分析 

2.1试验期间各组大鼠体征变化情况见表22。 

表22试验期间各组大鼠体征变化情况 

2.2各试验组对大鼠采食量的影响 

试验期间，每天称大鼠的采食量，每5天对各试验组大鼠称重，各试验组的每5天采食量的变化和体重的变化见图5、图6。 

试验结果表明：剂量3组（平3）、剂量4（平4）组的采食量与阳性对照组的采食量有显著性差异，比阳性对照采食量多，4个剂量组无显著性差异。百奥脂乐的四个剂量组采食量较多，阳性对照组采食量较少。 

2.3百奥脂乐不同剂量对试验大鼠体重的影响结果见图6。 

试验结果表明：随着饲喂时间的延长，各个试验组动物的体重增重逐渐降低，其中剂量4组相比增重较少。通过SPSS13.0分析，各试验组之间没有显著性差异，可知百奥脂乐不影响大鼠的生长。 

2.4各试验组对试验大鼠料肉比的影响结果见表23。 

表23各试验组对大鼠料肉比的影响

分析结果表明：空白对照组与阳性对照组之间没有显著性差异（p＞0.05），空白对照组与剂量1组、剂量2组差异不显著（p＞0.05），与剂量4组差异不显著。 

2.5各试验组肝、脾、肾指数见表24。 

表24各试验组的肝、脾、肾指数

分析结果表明：肝指数：4个剂量组与阳性对照组、空白组比较没有显著性差异，4个剂量组之间两两比较没有显著性差异；脾指数：各试验组之间两两比较没有显著性差异；肾指数：各试验组之间两两比较没有显著性差异。 

2.6各试验组对大鼠血脂各项指标的影响结果见表25，以及图7、图8、图9、图10。 

表25各试验组大鼠血液中血脂的各项指标（单位：mmol/L）

试验结果表明：总胆固醇（TG）：空白对照组与正常组比较，差异极显著（p＜0.01），模型成功建立。空白对照组与阳性对照组之间差异不显著（p＞0.05），与四个剂量组差异显著（p＜0.05），与剂量3、剂量4差异极显著（p＜0.01），随着剂量的增大，总胆固醇有先升高再降低的趋势，但是差异不显著。 

甘油三酯（TG）：空白对照组与正常组比较显著的升高，差异极显著（p＜0.01），模型成功建立；空白对照组与阳性对照组之间差异不显著（p＞0.05），阳性对照降低不显著，与四个剂量组之间差异显著（0.01＜p＜0.05），比空白组明显的降低，四个剂量组两两比较没有显著的差异（p＞0.05）。 

高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）：正常组与空白对照组比较极显著的升高（p＜0.01），空白组与阳性对照组没有显著性差异（p＞0.05），与剂量1、剂量2、剂量3没有显著性差异（p＞0.05），与剂量4有显著性差异（p＜0.05），剂量4的HDL-C显著的比空白组低。四个剂量组的剂量1、剂量2、剂量3之间没有显著性差异（p＞0.05），剂量4与剂量1、剂量2、剂量3有显著性差异（p＜0.05），与阳性对照组有显著性差异（p＜0.05），即高剂量能降低高密度脂蛋白。 

低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）：正常组与空白对照组极显著的降低（p＜0.01），空白对照组与阳性对照组、4个剂量组之间没有显著性差异（p＞0.05），阳性对照组与剂量4差异显著（p＜0.05）。但是，四个剂量组比空白对照组有所降低。 

3结论 

通过上面的试验可以得出，百奥脂乐不影响大鼠采食量、不增加大鼠的体重，对大鼠的肝、脾、肾指数没有影响，四个剂量组中以剂量1既能够降低血液中的总胆固醇（TG）的含量，又能够降低甘油三脂（TC），对高密度脂蛋白（HDL-C）的升高不明显，对低密度脂蛋白（LDL-C）降低不明显；剂量1服用量低，产品原料成本低；剂量4虽然显著地降低总胆固醇甘油三脂，但是它也显著的降低高密度脂蛋白胆固醇，服用量大，产品成本较高，所以不是最佳剂量，剂量1为最佳剂量。 

（二）百奥脂乐与市售产品、中药及合生元的效果比较 

2.1材料与方法：同动物试验（一） 

2.1.1受试物组成 

A、降脂宁：中成药（国药准字Z22026279）生产厂家，吉林通化永仓药业有限公司。功能主治：降血脂，软化血管。用于增强冠状动脉血液循环，抗心律不齐及高血脂症。 

B、血脂康：主要成分洛伐他汀（国药准字Z10950029）生产厂家，北京北大维信生物科技有限公司。功能主治：除湿祛痰，活血化瘀，健脾消食。用于脾虚痰瘀阻滞症的气短、乏力、头晕、头痛、胸闷、腹胀、食少纳呆等；高脂血症；也可用于高脂血症及动脉粥样硬化引起的心脑血管疾病的辅助治疗C、中药组方：山楂53.28%（商品名称：山楂，实验室提取浓缩烘干；生产厂家：泰安绿地大药房)，红曲米粉20%（商品名称：红曲米粉；生产厂家：山东巨野晨农天然产物有限公司），蔗糖10.32%（商品名称：蔗糖；生产厂家：郑州龙生食品添加剂有限公司），糊精16.4%（商品名称：糊精；生产厂家：洛阳民昌药用辅料有限公司）。 

D、合生元配方：低聚果糖80.1%（商品名称：低聚果糖；生产厂家：郑州弘益泰化工产品有限公司），低聚木糖17.9%（商品名称：低聚木糖；生产厂家：山东龙力生物科技有限公司），嗜热链球菌BLST 2×10⁸cfu/g，植物乳杆菌LP-112×10⁸cfu/g（该菌株命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2010150，记载在中国专利申请CN201010240725.X 中），各组分按质量百分比，菌粉质量要根据冻干菌粉的活菌数来计算，加入冻干粉后各组分的质量分数之和不足100%时，由奶粉（商品名称：奶粉；生产厂家：内蒙古伊利实业集团股份有限公司）补足至100%，制备时，将各组分混合均匀即可。 

E、D配方中的菌110℃灭活10min。 

F、百奥脂乐主要原料：山楂59%（商品名称：山楂；生产厂家：泰安绿地大药房，实验室提取浓缩烘干），灵芝孢子粉8.5%（商品名称：灵芝孢子粉，实验室破壁处理；生产厂家：泰安凤凰灵芝生物科技有限公司），红曲米粉1.85%（商品名称：红曲米粉；生产厂家：山东巨野晨农天然产物有限公司），低聚果糖22%（商品名称：低聚果糖；生产厂家：郑州弘益泰化工产品有限公司），低聚木糖5.85%（商品名称：低聚木糖；生产厂家：山东龙力生物科技有限公司），嗜热链球菌BLST 2×10⁸cfu/g，植物乳杆菌LP-112×10⁸cfu/g（该菌株命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M 2010150，记载在中国专利申请CN201010240725.X中），各组分按质量百分比，菌粉质量要根据冻干菌粉的活菌数来计算，加入冻干粉后各组分的质量分数之和不足100%时，由奶粉（商品名称：奶粉；生产厂家：内蒙古伊利实业集团股份有限公司）补足至100%，制备时，将各组分混合均匀即可。 

2.1.2试验分组见表26。 

表26剂量设计与分组 

2.1.3数据分析：试验数据用SPSS13.0软件处理，计量资料以

表示，用t检验评价试验结果。 

2.2结果与分析 

2.2.1试验期间各组大鼠体征变化情况见表27。 

表27试验期间各组大鼠体征变化情况 

试验结果表明：各试验组的大鼠体征和饮食都是正常的。 

2.2.2各试验组的料肉比结果见表28。 

表28各试验组的料肉比

试验结果表明：各试验组之间没有显著性的差异。 

2.2.3各试验组之间的肝、脾、肾指数结果见表29。 

表29各试验组之间的肝、脾、肾指数（单位mmol/L）

试验结果表明：肝指数：空白组与阳性对照1、百奥脂乐组、合生元（H）极显著性的增大，与阳性对照2、中药组、合生元（S）比较有增多趋势，但差异不显著。肾指数，空白组与阳性对照1有显著性的升高，与其它各试验组无显著性差异；脾指数：空白组与各试验组无显著性的差异。2.2.4各试验组的血脂中的各项指标结果见表30及图11、图12、图13、图14。 

表30各试验组血脂的各项指标（单位：mmol/L）

注：小写字母为显著，大写字母为极显著。 

分析结果表明：总胆固醇（TC）正常组与空白对照组差异及显著的降低（p＜0.01），正常组比 空白对照组总胆固醇TC显著的降低，模型成立；阳性对照1组（降脂宁）、阳性对照2（血脂康）与空白对照组比较差异不显著（p＞0.05），阳性对照2有降低趋势，合生元（H）、合生元（S）、百奥脂乐与空白组比较，有极显著的降低（p＜0.01）。 

甘油三脂（TG）正常组与与空白对照组比较，差异显著的升高（p＜0.01），模型成立。模型组与阳性对照1（降脂宁）无降低，与阳性对照2（血脂康）比较、中药组，有降低的趋势，但是差异不显著（p＞0.05），与合生元（H）、合生元（S）、百奥脂乐比较，有显著的降低（p＜0.05），与百奥脂乐相比差异极显著的降低（p＜0.01）。 

高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）模型组与各试验组之间没有显著性的差异（p＞0.05）。各试验组不能提高HDL-C的量。 

低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）模型组与各试验组之间没有显著性的差异（p＞0.05），但是阳性对照2、合生元（S）有显著性的差异（p＜0.05），显著的升高。与其它组差异不显著（p＞0.05）。 

2.3结论 

1、合生元（H）能够明显的降低高脂大鼠血液中的总胆固醇（TC）、甘油三脂（TC）；比市售药准字号的药品降脂宁、血脂康降总胆固醇、甘油三脂效果明显，对高密度脂蛋白（HDL-C）升高不明显，对低密度脂蛋白（LDL-C）没有升高作用。 

2、中药组有降总胆固醇（TC）、甘油三脂(TG)的作用，比降脂宁、血脂康降总胆固醇的效果显著，比血脂康降甘油三脂的效果稍差，对升高高密对脂蛋白、降低低密度脂蛋白不明显。 

3、百奥脂乐能够极显著的降低大鼠高脂模型的总胆固醇（TC）、甘油三脂（TC），效果比市售的降脂宁、血脂康效果极显著，比百奥脂乐复方中的中药、合生元效果极显著。对高密度脂蛋白升高作用不明显，对低密度脂蛋白降低作用不明显。 

因此，百奥脂乐比单一的中药组方、合生元效果显著，比市售国药准字号产品降脂宁、血脂康效果显著，是一个降低总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）效果很好的产品，此产品的原料皆为药食两用的，无毒副作用，无不良反应，是高血脂患者可以长期服用的最佳产品。 

Claims (6)

1.一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，其特征在于：其分类命名为：嗜热链球菌BLST（Streptococcus thermophilus BLST），已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2012282。 

2.权利要求1所述的具有降胆固醇能力的嗜热链球菌在制备降胆固醇的药物或保健品中的应用。 

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：应用时，培养嗜热链球菌BLST，得发酵产物，即为降胆固醇的保健品，或：该发酵产物能够作为制备降胆固醇的药物或保健品的原料。 

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：培养的具体过程如下： 

（ⅰ）菌种：选用嗜热链球菌BLST； 

（ⅱ）斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃～42℃培养26h～30h； 

（ⅲ）一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种，用接种环取两环于50mL～100mL种子液体培养基中，在37℃～42℃条件下，静置培养20h～24h，制得一级种子液； 

（ⅳ）扩大培养：以3%的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃～42℃条件下，静置培养20h～24h，制得二级种子液； 

（ⅴ）发酵罐培养：以3%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃～42℃条件下，静置培养30h～36h； 

上述步骤（ⅲ）、（ⅳ）中所述种子液体培养基以及步骤（ⅴ）中所述液体发酵培养基的配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，使用时，调节pH至6.0～6.5，在115℃条件下灭菌20min；步骤（ⅱ）所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0%的琼脂粉。 

5.一种具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂，其特征在于：菌制剂是由以下原料组成的：山楂56～61%，灵芝孢子粉6～9%，红曲米粉1.0～1.5%，低聚果糖18～22%，低聚木糖4～6%，嗜热链球菌BLST 2×10⁸cfu/g，植物乳杆菌LP-11 2×10⁸cfu/g，各组分按质量百分比； 

所述嗜热链球菌和植物乳杆菌以菌粉的形式加入，加入菌粉后各组分的质量分数之和不足100%时，由奶粉补足至100%； 

所述嗜热链球菌BLST，已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2012282； 

所述植物乳杆菌LP-11命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中 国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2010150。 

6.根据权利要求5所述的具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂，其特征在于：所述嗜热链球菌BLST是以菌粉的形式存在的，制备菌粉的具体过程如下： 

（ⅰ）菌种：选用嗜热链球菌BLST； 

（ⅱ）斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃～42℃培养26h～30h； 

（ⅲ）一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下用接种环取两环于50mL～100mL种子液体培养基中，在37℃～42℃条件下，静置培养20h～24h，制得一级种子液； 

（ⅳ）扩大培养：以3%的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在37℃～42℃条件下，静置培养20h～24h，制得二级种子液； 

（ⅴ）发酵罐培养：以3%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃～42℃条件下，静置培养30h～36h； 

（ⅵ）收集发酵产物：待步骤（ⅴ）的发酵液的pH值降到4.5以下，收集发酵液； 

（ⅶ）发酵结束后，立即将发酵液12000rpm离心，得菌泥，向菌泥加保护剂，真空冻干，粉碎得菌粉；所述保护剂的组成及用量为：脱脂奶粉20%，蔗糖8%，甘油1%，均为相对于菌泥质量的百分数； 

上述步骤（ⅲ）、（ⅳ）中所述种子液体培养基以及步骤（ⅴ）中所述液体发酵培养基的配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-801mL/L，使用时，调节pH至6.0～6.5，在115℃条件下灭菌20min；步骤（ⅱ）所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0%的琼脂粉。 

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